Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones

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Immunology and Infection

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Summary

Este ensayo de adhesión de flujo proporciona un modelo de impacto simple de la máxima de las interacciones célula-célula epitelial T. Una bomba de jeringa se utiliza para generar la tensión de cizallamiento, y la microscopía confocal captura imágenes para la cuantificación. El objetivo de estos estudios es cuantificar eficazmente la adhesión de células T usando condiciones de flujo.

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Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Peled, M., Mor, A. Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions. J. Vis. Exp. (112), e54203, doi:10.3791/54203 (2016).

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Abstract

En general, la adhesión de las células T es un componente crítico de la función, contribuyendo a los distintos procesos de reclutamiento celular a los sitios de inflamación y la interacción con las células presentadoras de antígeno (APC) en la formación de sinapsis inmunológicas. Estos dos contextos de adhesión de las células T se diferencian en que las interacciones célula T-APC pueden considerarse estática, mientras que las interacciones de los vasos de la sangre por células T son desafiados por el esfuerzo cortante generada por la circulación en sí. interacciones de células T de APC se clasifican como estática en que los dos socios celulares son estáticos con relación al otro. Por lo general, esta interacción se produce dentro de los ganglios linfáticos. Como una célula T interactúa con la pared del vaso sanguíneo, las células detienen y deben resistir el esfuerzo cortante generado. 1,2 Estas diferencias ponen de manifiesto la necesidad de comprender mejor adherencia estática y la adherencia en condiciones de flujo como dos procesos distintos reguladores. La regulación de la adhesión de las células T se puede describir sucintamente como concurricán el estado afinidad de la integrina moléculas expresadas en la superficie celular, y regulando de este modo la interacción de las integrinas con los ligandos de moléculas de adhesión expresadas sobre la superficie de la célula que interactúan. Nuestra comprensión actual de la regulación de los estados de afinidad proviene de la integrina menudo simplista en sistemas modelo in vitro. El ensayo de adhesión usando condiciones de flujo descrito aquí permite la visualización y la cuantificación exacta de las interacciones de células de células epiteliales T en tiempo real después de un estímulo. Una adhesión bajo ensayo de flujo se puede aplicar a los estudios de adhesión de señalización dentro de las células T después de tratamiento con sustancias inhibidoras o estimulantes. Además, este ensayo se puede ampliar más allá de la señalización de las células T a cualquier población de leucocitos adhesivo y cualquier par molécula de integrina adherencia.

Introduction

La adhesión de linfocitos T media una serie de procesos diferentes en un sistema inmunológico saludable, 3 juega un papel crítico en el tráfico de células T y la presentación de antígenos. Ya sea durante la vigilancia inmune o una respuesta inmune activa estas dos amplias funciones para la adhesión son críticos. 4 Los eventos de señalización fisiológicos de las interacciones de células de células endoteliales T son distintos de células T antígeno que presenta la célula (APC) interacciones, y por lo tanto requieren métodos distintos de estudio para entender mejor las cascadas de señalización implicadas. La adhesión firme de una célula T a una pared del vaso sanguíneo durante la extravasación de linfocitos requiere la activación rápida y dinámica de la integrina. La interacción estrecha entre un activo de moléculas de integrina y de adhesión del estado a lo largo del endotelio conduce a resistente al flujo de la sangre de adhesión, permitiendo que las células T para rastrear a lo largo de la superficie en busca de una zona propicia para el paso de la célula. 5 El rastreo de un bi células T -directionally Alonga pared del vaso sanguíneo es dependiente sobre la adhesión polarizado, con un extremo frontal adhesiva distinta de la célula T. 6 es más importante, la adhesión firme y la transmigración requieren resistencia a la fuerza de cizallamiento generada mediante la circulación de flujo sanguíneo.

En el diseño de experimentos para estudiar la adhesión de linfocitos, se debe prestar atención al estímulo específico de interés. Mientras activación de la integrina es un componente común y crítico de todas las formas de la adhesión de células T, las cascadas de activación es probable que ser único aguas abajo de los receptores individuales y co-receptores. Del mismo modo, los pares de integrina y la molécula de adhesión funcionan en microambientes especializados y en subpoblaciones específicas. De esta manera, estos pares pueden ser regulados de manera muy diferente. El modelo que aquí se presenta es ideal para el estudio de las cascadas que conducen a la activación de la integrina que tiene lugar bajo condiciones de estrés de cizalla de señalización. 7 Estas interacciones no pueden entenderse adecuadamente en un ADHESI estáticaen el sistema debido al impacto de estas fuerzas han demostrado tener directamente en el comportamiento de células T. 8 Aunque aquí se presenta con las células T y las células CHO (ovario de hámster chino) ingeniería genética para expresar (células CHO-ICAM) humano ICAM-1 El sistema puede ser fácilmente modificado para estudiar diferentes poblaciones de leucocitos o moléculas de adhesión.

Este ensayo proporciona un método para cuantificar la adhesividad de las células T y activación de la integrina usando tensión de corte, proporcionando un modelo para la etapa de la adhesión firme de la extravasación de leucocitos. A través del uso de las células CHO-ICAM la afinidad de LFA-1 para su ligando en células vivas se puede examinar en tiempo real en respuesta a diversos estímulos de interés. Esta técnica requiere obtiene fácilmente, cámaras de micro-de flujo disponible comercialmente en combinación con una bomba de jeringa, simplificando en gran medida el equipo necesario para modelar el flujo de sangre y el estrés de cizalladura en comparación con otros modelos. 9 Otra ventaja importante de este ensayo es que la señalización específicacascadas y el estado de activación resultante de las integrinas individuales pueden ser estudiados limpiamente a través de la utilización de células CHO que expresan moléculas de adhesión de ingeniería humanos de interés. Además, la combinación de los datos cuantitativos con imágenes de células vivas es una ventaja significativa de este método. En general, mientras que una serie de ensayos de adhesión de células T estática que se han descrito muy bien modelar las interacciones de las células T de APC, estos modelos son insuficientes para captar el proceso dinámico de la adhesión célula epitelial T. Por esta razón, la hora de elegir un ensayo de adhesión del estímulo en cuestión debe ser considerada.

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Protocol

1. Revestimiento las células CHO-ICAM

Nota: El objetivo de este paso es la placa de las células CHO-ICAM en las cámaras de flujo para el crecimiento durante la noche con el objetivo de generar una monocapa confluente.

  1. Mantener las células CHO-ICAM en 10 cm tratado de cultivo de tejidos placas de cultivo en 10 ml de medio RPMI suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina (CHO-ICAM medio de cultivo completo) a 37 ° C con 5% CO 2.
  2. Para recoger las células, añadir 1 ml 0,5% de tripsina-EDTA y se incuba a temperatura ambiente durante 1 min con agitación suave. Neutralizar la tripsina con 4 ml de medios de comunicación.
  3. Contar las células CHO-ICAM utilizando un hemocitómetro y calcular 0,75 x 10 5 células por cámara. Nota: En este experimento: se necesitarán 2,25 x 10 5 células para sembrar 3 cámaras.
  4. Centrífuga de 0,75 x 10 5 células CHO-ICAM por cámara durante 5 minutos a 500 x g, temperatura ambiente y volver a suspender el sedimento celular en 30 l por cámara de CHO-ICAM Medio de cultivo completo.
    Nota: En este experimento se necesitarán 90 l para sembrar 3 cámaras.
  5. Añadir lentamente las células en un depósito de la cámara de flujo. Permitir que las células se asienten durante 5 minutos en la incubadora a 37 ° con 5% de CO2.
  6. Añadir 200 l de medio de cultivo completo a través de los dos depósitos de cada cámara. adiciones alternar entre los dos para evitar el movimiento de las células ya que el sistema se equilibra.
  7. Se incuban las células durante la noche en el interior de una incubadora a 37 ° con 5% de CO 2.

2. Preparación de las células T

Nota: Este ensayo puede realizarse con células T humanas primarias o una línea de células T. Un protocolo de aislamiento de células T de la sangre se ha descrito previamente. 10 Si se utilizan células T humanas primarias usan células recién aisladas para obtener los mejores resultados. Si se utiliza una línea de células T, seguir el protocolo de cultivo especificado por la fuente de las células. Con el fin de detectar las células en una microsco fluorescentepe las células T se marcaron con éster de succinimidilo fluoresceína carboxi (CFSE).

  1. Contar las células T usando un hemocitómetro y calcular 2 x 10 6 células por cámara. Nota: En este experimento, se necesitarán 6 x 10 6 células por 3 cámaras.
  2. Centrifugar 2 x 10 6 células T por cámara de 5 min a 500 xg, a temperatura ambiente y volver a suspender las células en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 1% de glucosa o 2% de FBS.
  3. Añadir CFSE a escala 1: 1000 dilución (acciones hecha a 5 mm). Cubrir de la luz y se incuba durante 8 minutos a temperatura ambiente
  4. Girar a 500 xg durante 5 min, RT.
  5. sedimento celular se vuelve a suspender con 240 l por condición (Ver Sección 4 "Nota") de suero carente de medios RPMI. En este experimento, resuspender el sedimento celular en 720 l de llanura RPMI. Dividir las células en tubos de 1,5 ml vacíos etiquetados para cada cámara, 240 l por tubo. Mantener las células en un bloque de calor 37 ° C hasta su uso.

3. La creación de THe Input / Output Tubos Flexibles y bomba de jeringa

  1. Se calienta la cámara de imágenes en vivo microscopio para 37 ° C.
  2. Preparar la manguera de entrada:
    1. Llene una botella de vidrio de 500 ml con agua y hacer 2 agujeros en la tapa. Etiquetar los agujeros "en" y "fuera". Esto actuará como un baño de agua de calefacción para los medios de entrada.
    2. Ejecutar la entrada de una manguera a través de los agujeros en la tapa y en el baño de agua. Asegúrese de que el lado de la manguera que se conecta a la jeringa viene a través de la "en" agujero y la parte que se conectará al depósito de entrada viene a través del agujero "fuera".
    3. Enjuague la entrada de una manguera con 60 ml de agua para eliminar el aire del sistema.
    4. Primer la entrada de una manguera de medio RPMI que carece de suero calentado a 37 ° C. Llene una jeringa 60 ml y empujar a través de los medios de comunicación hasta que la manguera es completamente imprimada y carente de cualquier burbuja de aire.
      Nota: Dependiendo de la length de tubo utilizado el volumen necesario para cebar variará.
      1. Calcular el volumen de los medios necesarios para el experimento multiplicando la velocidad de flujo (en este caso 0,3 ml / min) por el número de minutos (5 min) por el número de cámaras en el experimento (en este caso 3); en este experimento, el uso de 4,5 ml de medio. Nota: Se recomienda tener 5 ml de volumen extra (en este caso por un total de 9,5 ml) que queda en la jeringa después de la preparación.
    5. Coloque toda la configuración de entrada en el recinto de imágenes en vivo del microscopio para mantener 37 ° C. Ejecutar la manguera y jeringa fuera del recinto y cargar la jeringa en la bomba de jeringa.
  3. Preparar la manguera de salida:
    1. Hacer un agujero en la tapa de una botella de 250 ml para su uso como residuos de salida.
    2. Ejecutar el tubo de salida a través del agujero y en la botella. Fije sin apretar la tapa, no se cierra hasta el final.
    3. Coloque la configuración de salida en el recinto de imágenes en vivo de la microscope.
  4. Calcular la velocidad de flujo (ml / min) necesaria para generar la tensión de corte deseada (dyn / cm 2). esfuerzo de corte varía en diferentes compartimentos vasculares, por lo tanto, tener en cuenta el modelo global que incluye los tipos de células que han de estudiarse y tratamientos al decidir sobre un nivel de tensión de corte.
    Nota: Estos experimentos se llevan a cabo en el 0,4 dyn / cm2 para imitar un entorno vena pequeña.
    1. Tome las dimensiones de la cámara en el cálculo de la tensión de cizallamiento. Utilice la siguiente fórmula (proporcionado por el fabricante 11) para las cámaras de flujo utilizadas aquí (Véase la Tabla de Materiales): T = η * 176,1 * ø donde la tensión T = esfuerzo cortante, η = viscosidad dinámica, ø = caudal. Nota: La viscosidad dinámica del medio RPMI a 37 ° C es 0,007.

4. Carga de las Cámaras de flujo y la estimulación de las células

Nota: Con el fin de iniciar la adhesión,Las células T deben ser estimuladas. En el siguiente experimento, las células podría mantenerse sin estimular o se estimularon con SDF-1α 12 o acetato de forbol miristato (PMA; control positivo) 13. Para la presentación adecuada de quimioquinas a las células T, las células CHO-ICAM se preincuban con SDF-1α (seguido de lavados de serie), lo que permite la presentación en la superficie celular. PMA es un éster de forbol que es estructuralmente similar a la de glicerol segundo mensajero de diacilo (DAG); Aquí se usa como un control positivo. Las células T se tratan directamente con PMA antes de cargar en la cámara de flujo.

  1. Colocar el portaobjetos cámara de flujo en el microscopio y establecer el plano focal de la monocapa de células CHO-ICAM utilizando el objetivo 20X.
  2. Mantener las células T teñidas con CFSE para todas las otras condiciones en el bloque de calor 37 ° C. Preparar las células CHO-ICAM o T como sigue inmediatamente antes del ensayo para esa condición:
    1. Para la condición de no estimulada (cámara 1), mantenga una ch / tubo de flujoámbar sin tratar, para servir como control negativo para la estimulación.
    2. Para la estimulación con PMA (cámara 2), estimular un tubo de células T con PMA (10 ng / ml) para servir como control positivo; tratar inmediatamente antes de cargarlos en la cámara de flujo.
    3. Para la estimulación SDF-1α, (cámara 3), estimular la tercera cámara de flujo con SDF-1α (100 ng / ml) mediante la eliminación de 70 l a la vez 3 veces desde el depósito superior (depósito de salida) y luego la adición de 70 l de SDF -1α (100 ng / ml) en la parte baja del depósito (depósito de entrada). Incubar durante 5 min.
  3. Retire y deseche 70 l a la vez 3 veces desde el depósito de salida de una cámara.
  4. Añadir 70 l de suspensión de células T pre-tratada (según sea el caso) en el depósito de entrada 3 veces. Esperar 5 minutos para permitir que las células se mueven desde la entrada de la cámara ( "In"), y para llegar a la salida proximal ( "Out") de la cámara.
  5. Durante este tiempo, la imagen 5campos de las células T teñidas con CFSE. Elige campos que se dispersan por todo el centro de la cámara (Figura 1). Utilice las siguientes condiciones de excitación / emisión: excitación láser de longitud de onda: 488 nm; Filtro de emisiones colección: 500 - 540 nm. Estas imágenes servirán como los recuentos de células pre-flujo.
  6. Conecte el tubo de entrada y salida al mismo tiempo a los depósitos de la cámara de flujo.
    Nota: Colocación de la tubería al mismo tiempo es crítico a fin de no introducir burbujas de aire en la cámara y el mantenimiento del equilibrio global dentro de la cámara.
  7. Comience flujo a 0,3 ml / min (0,4 dyn / cm 2), mientras que la visualización de las células T teñidas con CFSE. Cuando comienza el flujo, especialmente con la primera cámara, a menudo hay un retraso entre el inicio de flujo y la observación de la rodadura de las células T, por lo tanto comenzar la sincronización 5 min en el inicio de movimiento de las células T.
  8. Terminar el flujo después de 5 minutos, y la imagen 5 campos en el canal CFSE. Elija los campos dispersos aleatoriamente excelentes referenciasughout el centro de la cámara de flujo (Figura 1). Estas imágenes servirán como los recuentos de células post-flujo.

5. La determinación del porcentaje de células adherentes

Nota: Determinación del número de las células en las imágenes adquiridas se hace objetivamente con software automatizado. Para nuestros estudios se utilizó la Volocity software (versión 6.2.1), pero otros programas como ImageJ (versión 1.48V) también son aplicables.

  1. Determinar el número de células por campo pre-flujo para cada condición. El promedio de los 5 campos es el "recuento medio de células pre-flujo." 7
  2. Determinar el número de células por campo de post-flujo para cada condición. El promedio de los 5 campos es el "recuento medio de células de flujo posterior." 7
  3. Calcular el porcentaje de células adherentes utilizando la siguiente fórmula: Porcentaje de células adherentes = (post-flujo de recuento de células promedio) / (pre-flujo recuento medio de células) x 100%.

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Representative Results

Los resultados representativos se muestran desde el ensayo de adhesión de flujo usando Jurkat y células T CD3 + humanas primarias, como se indica, se estimularon con SDF-1α. Los controles negativos en todos los experimentos se muestran en las células no estimuladas. Un porcentaje umbral basal adhesión de las células no estimuladas está entre 5 - 10%; Adherencia baja notablemente por encima de este rango indica un experimento problemática y sugiere la población inicial de células T se forma no específica pre-activa en la preparación. Las veces de aumento en el número de células adherentes después de flujo en cada condición de sobre la de las células no estimuladas se puede calcular además del cálculo de porcentaje de adhesión. Los datos que representan estos dos métodos de cálculo se incluyen aquí.

La Figura 2A muestra imágenes representativas de campos dentro de la cámara de flujo para cada condición de pre y post-flujo. Antes del experimento, Jurkat (mostrarn en la Figura 2A) o células T CD3 + humanas primarias se purifican, contados, y marcadas con CFSE. Para cada condición experimental se marcaron 2 x 10 6 células. células T no estimuladas se cargaron en cámaras de flujo que contienen células CHO-ICAM en la presencia o ausencia de SDF-1α. Se dejó que las células T para mover y acumular en la cámara durante 5 min, y durante este tiempo se capturaron las imágenes para determinar el recuento de pre-flujo. Un número comparable de células pre-flujo entre las diferentes estimulaciones es esencial para asegurar condiciones experimentales uniformes. Después de 5 min de la tensión de corte continuo generado por el flujo, se capturaron las imágenes de nuevo para determinar los recuentos de post-flujo. Es evidente a través de estas imágenes representativas que SDF-1α aumenta el número de células T capaces de adherirse a las células CHO-ICAM bajo esfuerzo de cizallamiento.

La Figura 2B muestra el pliegue del cambio en la adhesión celular T como calculado basado en el número de células T Jurkat antes y después de flujo sin estimular o en presencia de SDF-1α. Para todas las condiciones de los recuentos promedio de 5 campos de células pre-flujo y 5 campos se determinaron después del flujo, y una comparación de la estimulación SDF-1α que no estimulado se utiliza para calcular veces el cambio en la adhesión de las células T. Como se muestra aquí, SDF-1α induce un aumento de 2 veces cerca en la adhesión en comparación con no estimulada.

La Figura 2C muestra un método alternativo de cálculo de datos. Aquí el porcentaje de adhesión de las células T CD3 + humanas primarias en la presencia o ausencia de SDF-1α se determina determinando primero los recuentos de células T pre y post-flujo promedio, a continuación, dividiendo el promedio de flujo posterior por el promedio de pre-flujo y multiplicando por 100. a través de este cálculo a toda la población pre-flujo representa% de adhesión 100. Como se muestra aquí, el 15% de las células T no estimuladas se adhieren bajo cizallamiento Stress en comparación con 50% de las células T estimuladas con SDF-1α.

Figura 1
La Figura 1. Es importante analizar sólo en las zonas expuestas al flujo homogéneo. Representación esquemática de las cámaras de flujo utilizados con indicación de dónde campos deberían obtenerse imágenes. Según la información proporcionada por los fabricantes de cámara, la velocidad de flujo pre-set sólo se alcanza a través del centro de las cámaras, indicado por naranja en este esquema. Más cerca de las fronteras de la cámara de la velocidad de flujo disminuye y no debe ser incluido en la imagen o el análisis experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. <strong> SDF-1α induce la adhesión de células T a ICAM-1 en virtud de la tensión de cizallamiento. células A. T Jurkat se marcaron con CFSE a una concentración de 5 mM. A continuación, las células se cargaron en las cámaras de flujo que se pretrataron con SDF-1α (100 ng / ml) o no estimuladas y configurarse en el microscopio confocal y se dejan mover y acumular en la cámara durante 5 min. Alternativamente, las células T Jurkat se trataron previamente con PMA (10 ng / ml) antes de la adición a las cámaras de flujo. A lo largo de esas imágenes pre-flujo 5 min fueron capturados. Entonces el flujo se inició a 0,4 dyn / cm 2 para crear la tensión de cizallamiento durante 5 min. Al finalizar, se capturaron imágenes post-flujo. Imágenes representativas de las células T Jurkat se muestran, barra de escala de 50 micras. B. veces el cambio en la adhesión de las células T Jurkat se calcula determinando primero los recuentos de células pre-y post-flujo promedio para cada condición y dividiendo ese número promedio de flujo posterior por el promedio co pre-flujount individualmente para cada condición. Este cociente adhesión para cada condición de estimulación, aquí SDF-1α o PMA, se divide entonces por el cociente de adhesión no estimulado para determinar el factor de cambio en la adhesión. Las barras representan la media de 3 experimentos ± SEM. C. Porcentaje de adhesión de las células T CD3 + humanas primarias se calculó determinando primero los pre media y post-flujo de los recuentos de células para cada condición. Para cada condición, el recuento medio de post-flujo se divide por el recuento medio de pre-flujo y se multiplica por 100. La adhesión por ciento resultante se basa en el recuento de células pre-flujo siendo 100% la adherencia. Las barras representan la media de 5 experimentos ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. TLas células primero se acumulan entonces fluyen sobre la monocapa de CHO-ICAM. Células T Jurkat se marcaron con CFSE a una concentración de 5 mM. A continuación, las células se cargaron en las cámaras de flujo que se pretrataron con SDF-1α (100 ng / ml) y configurarse en el microscopio confocal y se dejan mover y acumular en la cámara durante 5 min. A lo largo de estos 5 min imágenes fueron capturadas como una serie de lapso de tiempo; fotogramas fijos (A). Entonces el flujo se inició a 0,4 dyn / cm 2 para crear la tensión de cizallamiento durante 5 min. A lo largo de estos 5 min imágenes fueron capturadas como una serie de lapso de tiempo; imágenes fijas (B). La dirección del flujo en estas imágenes es de abajo hacia arriba, y el plano focal se fija en la monocapa de CHO-ICAM. Las células T se pueden clasificar en 3 grupos: (1) se visualizan las células T que ruedan a lo largo de la monocapa en la velocidad de flujo, líneas horizontales cortas en movimiento de abajo hacia arriba a través del campo, ya que se están moviendo rápidamente, mientras se toman las radiografías. (2) células T crawling a lo largo de la monocapa. Estas células están firmemente adheridas sobre la base de la resistencia al flujo, y se arrastran probable en busca de una zona propicia a paso celular, que no se observa en este modelo. (3) las células T que se adhieren firmemente a la monocapa, son resistentes al flujo, pero son inmóviles. Estas células no están rodando de forma activa o arrastra a lo largo de la monocapa. Un análisis más sofisticado se puede hacer, en base a los objetivos del estudio, a través del uso de una secuencia de comandos ImageJ diseñado para diseccionar estas poblaciones de células para su posterior cuantificación o caracterización. Escala de barras de 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Las células CHO-ICAM deben formar una monocapa confluente. Imagen representativa de un confluente monolay CHO-ICAMer dentro de una cámara de flujo. La barra de escala 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Con el fin de analizar adecuadamente la adhesión de células T, el estimulante que se incluirán en el estudio deben ser considerados al momento de elegir un método in vitro. Si bien hay varios ensayos para estudiar las señales que conducen a LFA-1 de activación y ICAM-1 de unión a todos los métodos no son intercambiables. Un ensayo de adhesión estática 10 es el más adecuado para estudiar las interacciones de las células T de APC; Alternativamente, el método de la tensión de cizallamiento se detalla aquí es ideal para modelar las interacciones de células-T de células epiteliales. In vivo, como quimiocinas se presentan a lo largo del endotelio, rodando las células T debe responder mediante la adhesión y resistencia a la tensión de cizallamiento de la sangre fluya 14,15 firmemente. Por esta razón, el estudio de la señalización de quimiocinas es el más adecuado para ser estudiado en un ensayo que incorpora la tensión de cizallamiento. La principal ventaja de esta adhesión usando condiciones de flujo es su simplicidad en el modelado de las interacciones entre las células T y las integrinas. Este ensayo combina bastante única función y mecanicistaestudios de modelado de un entorno para el estudio de uno-adhesión integrina par molécula. Otro punto fuerte de este método es su capacidad de adaptación; este método se puede utilizar para cuantificar la adhesión de leucocitos de cualquier a cualquier molécula de adhesión. Este método puede ser utilizado para detectar el efecto de múltiples fármacos o manipulaciones genéticas espera que altere el reclutamiento de células T y la extravasación a través de activación de la integrina alterado.

Al igual que con cualquier método in vitro, hay algunas limitaciones de este ensayo. Este modelo utiliza ingeniería células CHO en lugar de células endoteliales primarias estimuladas como otros modelos han utilizado. 16 Mientras que esto nos da la capacidad de entender los eventos de señalización que influyen en el estado de activación de un solo integrina, esto también puede ser considerada como una debilidad del modelo. Como no hay selectinas expresadas por las células CHO, el ensayo se realiza en dos pasos. Durante la primera etapa (la fase de acumulación), las células T se inyectan en la entrada reservoir a un lado de la cámara y los viajes al otro lado por la presión mínima y las fuerzas capilares. El comportamiento de las células T a través de estos 5 min se puede observar en la Figura 3A. Después de 5 min, y durante la segunda etapa (la fase de flujo) la velocidad de flujo se incrementa y las células se iniciará a rodar y adherirse. Es importante tener en cuenta que no todas las células T inyectadas en el movimiento del depósito de entrada a través de la cámara durante la fase de acumulación, y estas células rodar a lo largo de la monocapa como el flujo se aumenta (Figura 3B). De esta manera, la etapa de laminación de la extravasación se mejora artificialmente, pero no se elimina, en este modelo.

Puesto que el número máximo de células adherentes es una expresión del número de células de entrada que entra en la cámara existe el potencial para número variabilidad en bruto entre experimentos. Mientras que las imágenes de preflujo no representan plenamente la máxima población de células T del 100%, ya que no tienen en account el depósito de entrada, que es un control importante incluir en los cálculos especialmente cuando dos tipos de células diferentes contadas individualmente se van a comparar. Además, no se recomienda que los linfocitos hornos primaria pueden utilizar en un único análisis de adherencia variable. Es decir, pre-estimulación de las células T a través de receptores de células T (TCR) y / o co-receptores puede confundir el efecto del tratamiento de los intereses sobre la adhesión. Estas variables se deben considerar durante el diseño experimental. Del mismo modo, los estudios funcionales con PBMCs previamente congelado a menudo dan resultados de confusión, y por esta razón las líneas celulares o PBMCs primarias recién aisladas funcionan mejor con este ensayo. La comprensión del nivel de base normal de adhesión no estimulado para la PBMC incluidos en el estudio es crítica en la identificación de una población de células que ha sido no específica pre-activado conduce a resultados de confusión.

Para replicar este ensayo con exactitud, es esencial que algún pasos en el protocolo, incluyendo los tiempos de sedimentación e incubación de flujo, sea preciso y uniforme en todas las condiciones. En esta misma luz, las células CHO-ICAM deben ser confluentes uniformemente a través de todas las cámaras de flujo (Figura 4) y los recuentos de células T también debe ser preciso. 17 incluso pequeñas diferencias en estos factores pueden afectar la precisión de los recuentos de células al final. Una aplicación en el futuro de este ensayo es el desarrollo de una serie de líneas celulares que expresan de forma individual selectinas y las moléculas de adhesión para ampliar el impacto de este método a otras cascadas de señalización.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
T cell samples (cell line or primary) ATCC TIB-152 Peripheral human T cells
CHO-ICAM-1 cells ATCC CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat ibidi 80606
500 ml glass bottle Fisher FB800500
250 ml glass bottle Fisher FB800250
Silicone tubing 0.8 mm ibidi 10841
Confocal microscope with incubator chamber Ziess 700 Any wide field fluorescent microscope
Syringe pump New Era Pump Systems NE-300
60 ml syringe BD 309653
CFSE eBioscience 65-0850
SDF-1α R&D 350-NS-010/CF
RPMI Lonza 12-702F/12
PBS  Lonza 17-516F
Microcentrifuge Eppendorf  5424
D-Glucose Sigma Aldrich G8270 
PMA Sigma Aldrich 16561-29-8
Volocity software Perkin Elmer Version 6.2.1
ImageJ software NIH Version 1.48V
Tissue-culture treated culture dishes Falcon 353003
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red Gibco 25200114
Heat Inactivated FBS Denville FB5001-H
Penicillin/Streptomycin Fisher BP295950

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References

  1. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20, (5), 525-532 (2008).
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