관류의 공간 측정, 고체 종양에 삽입 유체 압력과 리포좀 축적

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Stapleton, S., Mirmilshteyn, D., Zheng, J., Allen, C., Jaffray, D. A. Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors. J. Vis. Exp. (114), e54226, doi:10.3791/54226 (2016).

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Abstract

리포좀의 이종 종양 내 축적 효능의 중요한 결정 인자이다. 혼돈 종양 미세하고 IFP 상승 모두는 나노 리포좀 계 약물 전달 시스템의 이종 종양 내 분포에 연결된다. 본 연구에서 종양 미세 상승 IFP 및 나노 입자의 축적이 관계는 생체 내 실험을 통해 조사 하였다. 이것은 동적 전산화 단층 촬영 (DCE-CT) 강화 된 콘트라스트 및 종양 IFP 측정 마이크로 CT 스캐너에 접속 된 새로운 영상 유도 로보트 바늘 배치 시스템을 사용하여 사용하여 종양 미세 평가함으로써 수행 하였다. 리포솜의 종양 내 축적 안정적 조영제 iohexol (CT-리포좀)를 캡슐화하는 나노 입자 리포좀 제제의 CT 이미지 기반의 평가에 의해 결정 하였다. CT 영상에서의 공간 분포의 공동 지역화 허용종양 혈역학 유방암의 각각의 피하 이종 이식 마우스 모델에서 IFP 및 CT-축적 리포솜. 측정 관류 플라즈마 부피 분율은 리포솜의 종양 내 분포의 강한 매개체이다 발견되었다. 또한, 결과는 IFP 혈류를 변조를 통해 리포좀 분포 매개 간접적 인 역할을 제안한다.

Introduction

나노 입자 약물 전달 시스템의 종양 내 축적을 측정하면, 세포 독성 약물의 적절한 농도는 종양 내에서 달성되었는지 확인하기위한 중요한 도구를 제공 할 수있다. "화상 수"리포좀 시스템의 개발이 비 침습성 정량을 허용 생체 같은 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 광학 형광 2, 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 3 등의 영상 방식을 이용하여 약물 전달 비히클의 검출, (4) 및 자기 공명 영상 (MRI) 5. 이미징 약동학 및 리포좀 전달 시스템의 생체 분포를 결정하기 위해 나노 입자 축적 -6,7- 인 인터 피사체 내 종양 이질성의 정도를 나타 내기 위해 사용되었다. 그러나, 나노 입자의 영상은 혼자 자신의 가난한 축적 및 유통에 기여 생물학적 장벽을 식별하지 않습니다. 이 지식은 연구에 매우 중요합니다ational 더 효과적인 제제의 개발 및 전략을 내 종양 축적 (8)을 향상시킬 수 있습니다. 치료 전략이 향상된 나노 반송 결과 특정 생물학적 장벽을 변조하는데 적용될 수 있음을 증명하고있다. 또한, 나노 입자 제제는 특히 특정 생물학적 전송 배리어 (10)를 극복하기 위해 개발되었다. 두 시나리오에서, 생물학적 장벽 측정 적합한 나노 입자 약물 전달 전략의 사용을 유도하는데 사용될 수있다.

종양 미세과 높은 IFP 고체 종양 9,11 이러한 리포좀으로 나노 입자의 내 종양 축적의 두 가지 주요 결정 요인이 될 것으로 생각된다. 그러나 가난한 리포좀 축적에 기여할 수있는 다른 장벽은 조밀 한 세포 외 기질, 불 침투성 혈관, 고체 조직 압력 (12)을 포함한다. 이 장벽은 시공간에 관련방법 비정상적인 혈류 상승 간질 유체의 압력은 나노 입자의 초기 전달 및 혈관 외 유출 구동 두 가지 중요한 요인으로되고. 전술 한 바와 같이, 종양 미세 상승 IFP 및 리포좀 내 종양 축적 간의 관계를 확립하는 리포솜 촬상 데이터의 적절한 해석에 필수적이다. 여기서 정량 방법은 고형 종양에서 종양 미세 상승 IFP 및 나노 입자의 축적의 관계를 측정하는 것이 제시되어있다. 이것은 동적 콘트라스트 컴퓨터 단층 촬영을 개선하여 부피 CT 영상 종양 미세을 이용한 CT 리포좀 조영제 인트라 종양 분포 공동화 측정을 수행함으로써 달성하고, 영상 유도 로보트 침 위치 확인 시스템을 이용하여 종양 IFP는 불린다 중부 표준시 - IFP 로봇 13.

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Protocol

모든 생체 실험은 대학 건강 네트워크 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 하였다.

1. 동물 모델

  1. 함께 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린 - 스트렙토 마이신을 100 배 희석 DMEM에 5 × 106 개 MDA-MB-231 7 유방 선암종 종양 세포와 배양.
  2. 수확 된 세포들은 0.05 % 트립신 EDTA 용액을 이용하여 80 %의 컨 플루 언트 할 ​​때. 3 ~ 5 분 후 DMEM의 3 배 부피의 트립신 EDTA를 중화. 세포의 15 μL 나누어지는을 가지고 혈구를 사용하여 계산합니다. 200 XG에서 5 분간 원심 분리로 펠렛 세포는 ml 당 10 × 106 세포의 농도로 HBS 재 정지.
  3. 임플란트 피하 (SC) 각각 8 내지 12 주령의 암컷 SCID 마우스의 뒷다리에 1 × 106 (2) 세포 주입함으로써 종양 (N = 5). 주입을위한 표준 25 G 바늘을 사용합니다.
  4. 모니터 t사우스 캐롤라이나 종양 볼륨> 200mm 3 (약 7 ~ 9 일)에 도달하면 umor 성장하여 캘리퍼 (볼륨 = 0.5 ×의 길이 x 너비 2)는 측정을 시작합니다.

2. CT-리포좀의 제조 및 특성

  1. 리포좀의 제조
    1. 1,2- 디 팔미 토일 - SN 글리세로 -3- 포스 포 콜린 (DPPC), 콜레스테롤 (CH) 및 1,2- 디스 테아 SN 글리세로 -3- 포함 CT-지질 리포좀에 대한 성분 (200 밀리몰 / L)에 용해시키고 40 : 5 DPPC : CH : PEG2000-DSPE 55의 몰비로 70 ℃에서 무수 에탄올 -phosphoethanolamine-N - 폴리 (에틸렌 글리콜) 2000 (PEG2000-DSPE).
    2. 70 ° C로 가열 유지하여 에탄올을 증발시키고, 그 용액에 CT 조영제 iohexol (요오드 300 ㎎ / ㎖)을 추가하도록 최종 지질 농도는 100 mm이다.
    3. 자주 텍싱 4 시간 동안 70 ° C에서 솔루션을 유지합니다.
    4. 샘플 5 팀을 돌출, 단일 층 소포를 얻으려면두 ES 내지 250 psi의 압력에서 200 nm의 기공 크기 막을 적층하고, 10 ㎖ 지질 압출기를 사용하여 400 psi에서 두 개의 적층 된 80 nm의 기공 크기는 막을 통해 5 회 다시 돌출. 각 압출 사이클의 처음에 압출기에 리포좀 10 ㎖를 피펫 각 압출 사이클 후의 멸균 튜브 또는 원추형 유리 바이알로 모은다.
    5. 100 kDa의 분자량이 0.02 mM의 HEPES 완충 생리 식염수 (HBS, 산도 7.4)의 250 배 용량 초과에 대한 (MWC) 투석 가방을 잘라 사용하여 투석을 16 시간으로 취소 캡슐화 iohexol를 제거합니다. 예를 들어, 커에 백 바깥 HBS 250ml를 투석 백에 리포좀 용액 1 ㎖를 배치했다.
    6. 제조자의 지시에 따라 75 nomical MWC 상업적 접선 흐름 방식을 이용한 CT-리포좀을 농축시킨다. 약 55 밀리그램 ml의 최종 농도 요오드 농축 -1.
  2. 리포좀 특성
    1. ioxehol을 해제 한 다음 탈 이온수 100 배 체적 과량을 사용하여 희석 된 에탄올의 10 배 부피 초과 량을 사용하는 CT-리포좀 파열에 의해 밀봉 효율을 측정한다 (리포좀 즉, 10 ㎕의 100 에탄올 μL 후 희석을 이용하여 파열 10 ㎖의 최종 부피).
    2. 245 nm의 파장에서 검출와 UV 분광계를 이용하여 농도를 결정 iohexol. 제의 양을 방출 iohexol 제의 비율 량을 고려하여 캡슐화 효율 계산은 제조시 첨가.
    3. 제조자의 지시에 따라 동적 광산란 입도 분석기 시스템을 이용한 유체 역학적 직경 제타 전위를 측정한다. 측정을 용이하게하기 위해 탈 이온수 (최종 부피 1 ㎖의 리포솜 5 μL) 200X하여 CT-리포좀 용액을 희석.

종양 미세과 CT-리포좀 3. CT 영상분포

참고 : 다른 소프트웨어 버전 또는 장비를 사용하는 경우 체적 검사를 수행하기위한 제조업체의 지침을 따르십시오.

  1. 의료 공기 또는 산소와 혼합 2 % 이소 플루 란을 사용하여 각 마우스를 마취하고 발가락을 곤란하게하고 어떤 반응을 관찰하지에 의해 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. 얇은 플라스틱 판에 발 테이핑하여 엎드린 자세 동물 고정시킨다.
  2. 측면 꼬리 정맥에, PE10 튜브에 20cm에 연결된 사용자 지정 27 G 카테터를 삽입하고 테이프의 여러 조각 제자리에 고정합니다.
  3. 중부 표준시 - 리포좀의 최소 200 μl를 포함하는 1 ML의 주사기를 준비합니다. 카테터를 세척 할 때 사용하는 식염수로 1 ML의 주사기를 준비합니다. (부피비 9 : 1) 마지막으로, 식염수와 혼합 자유 iohexol 적어도 150 μL와 함께 1 ml의 주사기를 준비한다.
  4. 마이크로 CT 스캐너 침대에 발생하기 쉬운 마우스를 놓습니다. tumo을 배치 레이저 측위 시스템을 사용하여각 스캔에 대한 거의 같은 방향으로 연구.
  5. 주사기 펌프에서 CT-리포좀 주사기를 놓고 주사기에 카테터를 연결합니다. 초 당 10 μL의 펌프 속도를 설정합니다.
  6. CT 스캐너 콘솔 소프트웨어를 이용하여 명암 조정 스캔을 수행하여 시스템을 초기화한다. 관심의 각 영상 프로토콜에 대한 명암 스캔 옵션을 선택 드롭 다운 메뉴에서 명암을 선택하고 교정을 시작하려면 스캔 버튼을 누릅니다.
  7. 어떤 조영제 주입하기 전에 종양 체적 해부학 마이크로 CT를 수행한다. 연동 장치가 해제 된 CT 스캐너의 안전을 보장하기 위해 CT 스캐너 콘솔 소프트웨어 표시 봐. 중부 표준시 스캐너 콘솔 선택 검사에서 80 kV의 70 mA의 관 전류의 X 선 에너지를 선택하고 시간이 16 초 이상 1,000 이미지 전망을 캡처합니다. 스캔을 시작하려면 스캔 버튼을 누릅니다.
  8. 400 mg의 요오드 kg의 농도로 CT-리포좀 루스를 주입하기 위해 주사기 펌프를 사용하여-1. 약 150 μL (25 g을 마우스를 가정)의 볼륨을 주입하는 펌프를 설정합니다. 주입하는 펌프의 '시작'버튼을 누릅니다. 수동 주입 전체 에이전트 양을 보장하기 위해 (두 카테터의 체적)의 생리 식염수를 50 μL로 카테터를 플러싱 카테터 분명하다.
  9. CT-리포좀의 주입 후 10 분을 기다린 후 3.5에 설명 된 것과 동일한 방법 및 설정을 사용하여 두 번째 해부 검사를 수행합니다.
  10. 3.3에서 설명 된 것과 동일한 주입 속도 설정을 사용하여 (부피비 9 : 1) 식염수와 혼합 자유 iohexol 100 ㎕의 부피를 주입 주사기 펌프를 설정하여 DCE-CT 스캔을 수행.
    1. CT 스캐너 콘솔 획득 매 10 초에서 80 kV로, 90mA의 튜브 에너지의 X 선 에너지 설정을 사용하며, 처음 30 초 동안 416 화상 돌기 매 초를 캡처하고 그 다음 5 분 동적 주사를 선택할 . DCE-CT 데이터를 5 초를 캡처 한 다음 injectio에 시작 버튼을 누릅니다n 개의 펌프.
    2. 는 DCE-CT 검사 후 체적 해부학 마이크로 CT 스캔을 수행합니다.
  11. 단계 3.5에 기재된 바와 같이 동일한 체적 CT 설정을 사용하여 CT-리포좀 48, 72 시간 포스트 분사 사이의 해부학 CT 영상 캡처.
  12. GPU가 재건​​축 소프트웨어를 사용하여 해부 CT 및 DCE-CT 데이터를 재구성.
    1. 재건 소프트웨어로 이미지를로드합니다. 관심 영역을 선택 마우스를 사용하여 이미지를 통해 투자 수익 (ROI)을 그려 재구성한다. 재구성 된 군데의 저장 위치와 파일 이름을 설정하고 '.MAT'로 출력 파일 형식을 선택합니다.
      참고 : 소프트웨어가 자동으로 해부학 적 검사를위한 0.153 X 0.153 X 0.153 mm 3에 복원 된 복셀 크기를 설정하고 DCE-CT 검사에 0.153 X 0.153 X 0.462 mm 3. '재건을 시작'버튼을 클릭합니다.
  13. 을 계산 CT-리포솜의 주입 전 10 분간 주입 후 스캔을 사용하여혈장 부피 분율은 앞서 설명한 3. 또한, 이전에 7 바와 같이 간극 체적 분율을 계산하는 사전 주입 iohexol 5 분 후 분사 스캔을 사용한다.
  14. 종양 체적 내에 ROI (region of interest)를 식별하는 기능을 제공하는 소프트웨어에 DCE-CT 데이터를 가져 시간 강도 곡선 (TICS)을 얻었다. 그 후 시간의 함수로서 ROI의 평균 CT 향상을 계산한다. 이 실험에서 사용자 지정 소프트웨어는 투자 수익 (ROI)을 식별하고 TIC를 계산하기 위해 개발되었다.
  15. 두 구획 추적 운동 모델을 사용하여 측정 틱 피팅에 의해 관류 및 혈관 투과성의 정량적 추정치를 얻습니다. 피팅 DCE-CT 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하고, 두 구획 트레이서 동역학 모델에서 고정 된 파라미터로서 선험적 플라즈마 체적 분율의 추정 및 삽입 부피비를 사용할 수있다. 원형질의 선험적 추정치를 얻기 위해 이전에보고 된 방법을 사용하여a와 간질 볼륨 분수 14.

종양 간질 유체 압력 4. 공간 측정

  1. IFP는 PE20 폴리에틸렌 튜브 50cm 통한 압력 변환기 및 상기 IFP 수집 시스템 25 G 척추 바늘을 연결 측정합니다. 헤파린 설페이트 / 식염수 (1시 10분)으로 시스템 전체를 세척. 사용하기 전에 70 % 이소 프로필과 바늘을 소독.
  2. 획득 시스템의 전원을 켜고 IFP 수집 소프트웨어를 실행하고 mmHg로의 IFP 측정을 획득 할 수있는 시스템을 보정하기위한 설정 파일을로드합니다. 지속적으로 IFP 데이터를 수집하기 위해 취득 버튼을 클릭합니다.
  3. 4.8에 기술 된 방법을 사용하여 리포좀 CT-48, 72 시간 포스트 분사 사이 IFP 측정 (이것은 종양의 CT-리포좀 피크 누적의 대략적인 시간에 상당)을 수행. 중부 표준시 - IFP 로봇에 IFP 바늘을 연결합니다.
  4. 에 대한 좌표계를 정렬 교정 검사를 수행중부 표준시 - IFP 로봇과 CT 스캐너. 중부 표준시 - IFP 로봇에 기준 마커 첨부 파일을 추가하고 네 개의 다른 위치에 기준 마커와 네 메스 CT 스캔을 수행합니다.
    1. 은 CT-IFP 로봇 컨트롤러 소프트웨어를 실행 로봇을 초기화하고, X, Y, Z 대상 위치를 입력하고 '이동'버튼을 클릭하여 세 가지 위치로 로봇을 이동합니다.
    2. 다음 X에서 CT 스캔을 가지고, Y는 Z 좌표 (1) 0,0,0; (2) -10,0,0 단계; (3) 0,7,0 단계; (4) 0,0,10합니다. 90 kV로, 10mA, 16 스캔을 시작하기 위해 CT 스캐너 소프트웨어를 눌러 '시작'을 사용하여 초 스캔을 선택합니다. 3.10에 기술 된 바와 같이 검사를 재구성.
  5. 중부 표준시 - IFP 로봇 정렬 소프트웨어를 실행합니다. 다음 '열기'클릭 '등록 데이터'영역에 들어있는 '추가'버튼을 클릭하고 4.3에서 얻은 네 재구성 등록 검사를 선택합니다.
    주 : 기준 마커의 픽셀 위치가 자동으로 softwa에 입력됩니다레.
    1. '계산 변환'버튼을 클릭 한 다음 '변환 적용'버튼을 클릭합니다. 이것은 CT-IFP 로봇 좌표계 CT 스캐너 좌표계로 변환하는 데 사용되는 정렬 데이터를 생성한다. 보정이 완료되면 CT-IFP 로봇에 동물 플랫폼을 연결합니다.
  6. 의료 공기 또는 산소와 혼합 2 % 이소 플루 란을 사용하여 각 마우스를 마취하고 발가락을 곤란하게하고 어떤 반응을 관찰하지에 의해 확인합니다. CT-IFP 로봇 플랫폼 동물 고정화 종양의 CT-IFP 로봇 시스템에 액세스 할 수 있도록 마우스를 위치. 이 IFP 바늘 삽입 동안 이동하지 않도록 테이프를 사용하여 종양을 고정시킨다.
  7. IFP 바늘을 삽입하기 전에 해부학 마이크로 CT 스캔을 수행합니다. 3.10에 기재된 단계를 사용하여 CT 데이터를 재구성한다.
  8. 중부 표준시 - IFP 로봇 정렬 소프트웨어에 사전 바늘 삽입 CT 데이터를로드합니다. 종양을 시각화 할 수있는 창 레벨을 조정합니다. 일을 클릭모든 이미지에서 종양의 전자 림, 다음 두 번째 림 위치를 클릭합니다.
    주 : 소프트웨어가 두 위치 사이의 직선을 따라 위치의 시리즈를 계산합니다. 는 X, Y 및 Z 참고 목록에서 5~8 균등 위치 일련의 좌표.
  9. 삽입하기 전에 헤파린 생리 식염수와 바늘을 세척하여 IFP 시스템을 준비합니다.
  10. 중부 표준시 - IFP 로봇 제어 소프트웨어에, X, Y, Z에 첫 번째 미리 결정된 바늘 위치를 입력하고 키를 누릅니다-이동 '이동'버튼을 원하는 위치로 로봇을 이동합니다. 조직에 바늘을 삽입하려면 '삽입 바늘'버튼을 클릭합니다.
    1. IFP 측정이 증가하고는 IFP 수집 소프트웨어에 값을-곤란 사전에 반환 지적 바늘이 IFP 바늘과 곤란과 PE20 튜브를 해제하여 조직 사이 좋은 유체 소통을 위해 삽입 한 후. 기준에 반환하지 않는 측정을 거부합니다.
  11. 취득삽입 된 바늘 해부학 CT 검사 후 조직에서 바늘을 철회하기 위해 CT-IFP 로봇 제어 소프트웨어의 '후퇴 바늘'버튼을 클릭합니다. IFP 값이 상기 바늘의 인출 후에 프리 바늘 삽입 값으로 복귀하지 않는 IFP 측정을 거부한다. 이 바늘은 측정 중에 걸려 수도 의미한다. 반복 4.8 각각의 바늘 위치에 대한 4.10 단계를.
  12. 바늘 후 삽입 메스 CT 스캔에서 식별 된 종양 부피의 질량 중심 니들 포트 상대의 x, y, z 위치를 계산하여 종양 체적 내에서 바늘의 위치를​​ 결정한다.
  13. 모든 측정이 완료된 후 자신의 케이지에 동물을 돌려줍니다. 무인 동물을두고 의식을 회복하고는 흉골 드러 누움을 유지 할 수 있습니다 때까지 그들을 관찰하는데주의를 기울여야하지 마십시오.

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Representative Results

상기 프로토콜은, 각각 91.8 ± 0.3 nm 내지 -45.5 ± 2.5 MV를, iohexol의 캡슐화 농도 CT-리포좀을 수득 리포솜 직경 55 밀리그램 mL의 -1의 제타 포텐셜을 의미한다.도 1a는 대표적인 DCE-CT 영상을 포함 결과 iohexol의 종양 내 축적의 시간 변화를 표시 체적 데이터의 시계열을 얻었다. 종양 내에서 ROI를 선택하면 관류, 혈관 투과성, 혈장 부피 분율 및 간극 체적 분율 (도 1b)의 추정치를 얻기 위해 탐침 운동의 모델링 방법을 이용하여 정량화 될 수있는 TIC를 산출한다. matlab에 (14)에 구현 된 비선형 곡선 피팅 루틴을 이용하여 본 연구에서 두 구획 트레이서 동역학 모델을 사용하고, 측정 TIC 맞추기. 동일한 크기의 관심의 여러 영역으로 종양 볼륨을 세분화하면 t의 정량화 가능그는 종양 체적 (도 1C) 내의 혈역학 파라미터의 분포를 공간적. 분할은 시간 소모적이고 어려운 이는 수동으로 수행 될 수도 있고, 자동으로 구형 좌표계를 사용하여 여러 개의 동일한 크기의 ROI에 종양이 분할 알고리즘을 이용하여 현재 수행있다. 는 DCE-CT 방법은 혈류, 혈관 투과성, 혈장 부피 분율 및 간극 체적 분율의 공간 분포의 정량적 평가를 제공한다. 이러한 매개 변수는 중앙 종양 부피에 비해 주변을 따라 관류 플라즈마 간질 부피비 높은 수준으로 공간적으로 불균일 것으로 관찰되었다.

체적 CT 촬영 방법은 생체 분포 및 CT-리포좀의 내 종양 분포를 알 수있다. 2A는 48 시간의 후 분사에서 CT-리포좀의 생체 분포를 보여줍니다. 에이전트는 여전히 일에 순환비장과 간에서 관찰 상당한 이해와 전자 혈관 시스템. 종양 체적 내에 밝은 영역들로 표시된 바와 같이 CT-리포좀 내 종양 축적은, 중앙에 비해 우세한 주변 축적 이질적인 것으로 관찰되었다 (도 2B).

체적 CT 이미징 IFP 측정 위치는 CT-IFP 로봇 설정을 사용하여 제조 추적하는데 사용될 수있다.도 3a는 종양 체적 내에 IFP 바늘의 위치를 나타낸다 고해상도 마이크로 CT를 이용하여 묘화있다. 바늘이 명확 종양 체적 내의 IFP 측정 공간 지역화 허용 종양 체적 내에서 식별 될 수있다 (도 3b). 이는 종양 체적 내에서 여러 IFP 측정을 수행하여 종양 걸쳐 IFP의 공간지도를 생성 할 수있다. 공간 IFP 다음의 대응하는 측정 값과 상관 될 수있다종양 미세과 CT-리포좀 축적.

체적 CT 영상은 CT-리포좀 축적의 공간적 공동 현지화 측정의 예를 제공하는 것이 가능, IFP, 및 CT-리포좀 축적. 혈류 역학의 측정을 공동 현지화도 4를 만드는 기준의 공통 프레임 수, IFP, 관류, 혈관 투과성, 혈장 부피 분율 및 간극 체적 분율. 그것은 그 재관류를 관찰하고, 혈장 부피 분율이 크게 피하 MDA-MB-231 종양의 CT-리포좀 내 종양 축적과 관련이 있었다. 또한, IFP의 반경 분포 측정과 상관 혈역학. 이러한 결과는 복합 시공간 관계는 종양 미세, 리포좀 IFP (14)의 내부 사이에 존재 종양 축적 제안한다.

그림 1 도 1 : 종양 미세의 DCE-CT 이미징의 시간의 함수로서 조영제 동역학을 나타내는 종양 체적 내에 수집 시간 CT 영상의 (a)의 대표적인 시리즈.. 적색 형상 시간 강도 곡선 (TIC)는 측정 된 ROI를 나타낸다. (b) 상기 TIC는 ROI 내의 혈역학 파라미터 정량적 추정치를 수득 두 구획 트레이서 동역학 모델을 사용하여 적합하다. (c) 상기 종양의 양적 혈역학 적 매개 변수의 대표 공간 분포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 리포좀 Accumul의 체적 CT-영상 ATION. (A) CT-리포좀의 생체 분포를 보여주는 대표적인 3D 볼륨 렌더링 이미지. (b)의 대표 축, 관상, 48 시간의 후 분사에서 CT-리포좀의 내 종양 축적을 나타내는 종양의 중심을 촬영 시상 조각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 :. 이미지 가이드 IFP 측정 (가) CT-리포좀 (오렌지)의 48 시간의 후 분사에 피하 종양에 CT-IFP 로봇 시스템 (녹색) 후 바늘 삽입의 대표적인 3D 볼륨 렌더링 이미지. (b) 이후의 니들 삽입의 대표적인 CT 이미지./54226/54226fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 :. 종양 미세, IFP, 및 CT-리포좀 축적의 공동 현지화 측정이 패널은 CT-리포좀 축적 촬영 48 시간 후 분사, IFP, 관류, 혈관 투과성, 플라즈마 부피 분율의 대표 공간 공동 현지화를 보여주는 간극 체적 분율. 다시 인쇄 (14)의 허가와. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기에 제공된 이미지 기반의 측정 방법은 종양 미세 속성, IFP, 및 CT-리포좀 축적의 공간 분포의 결정을 할 수 있습니다. 이러한 속성에 관한 이전의 시도는 다수의 종양 함유 동물 걸쳐 대량 측정을 수행에 의존하기 때문에 일반적으로 나노 크기의 약물 전달 시스템 (15)에 대해 관찰 된 인트라 종양 축적 이질성을 담당 메커니즘을 밝히기 감도 부족했다. DCE-CT는 종양 미세 특성의 내 종양 변화를 측정 할 수있는 도구를 제공 메스 CT는 CT-리포솜 증착 동력학의 정확한 묘사를 제공하고, CT-IFP 로봇 시스템에 IFP의 공간 맵핑을 수행하기위한 도구를 제공한다 같은 동물. 또한, DCE-CT 영상이 연구 잠재적으로 임상 transl의 연구 결과를 임상 설정에서 종양의 혈류 역학을 측정하기위한 임상 승인 된 방법은테이블.

측정의 복잡성을 감안할 때, 강인 데이터 세트의 수집을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 요소가있다. 종양 미세의 DCE-CT 기반 정량화 종양의 혈류 역학의 정확한 견적을 보장하기 위해 틀림없이 가장 어렵습니다. 이것은 대 잡음비 (SNR)에 높은 신호를 획득 틱 및 TICS 16,17 정량화 강력한 피팅 알고리즘을 채택이 필요하다. 틱의 육안 검사는 낮은 SNR 분석 데이터를 제거하기 위해 사용될 수있다. 주의를 기울이지 않으면 또한 다음 높은 SNR 틱의 끼워 맞춤은 또한 종양 관류, 혈관 투과성, 혈장 부피 분율 및 간극 체적 분율 (16)의 잘못된 추정을 초래할 수도있다. 정량화의 정확도를 최대화하기 위해 전략 후속 측정 틱의 모델에 맞는 동안 고정 된 파라미터로서 사용되는 플라즈마 및 간극 체적 분율의 모델을 독립 추정치를 얻기 위해 사용 하였다. 이 방법종양 관류 및 혈관 투과성의 강력한 추정 (15)를 얻을 수있다 보장합니다.

CT-리포좀의 내 종양 분포의 강력한 분석 에이전트의 충분한 축적 후 체적 CT 촬영을 수행해야합니다. 이전 연구에서, CT-리포좀 피크 종양 축적은 마우스 이종 이식 3,15에서 48 시간 내지 72 사이에서 발생한다. 또한 선형 관계는 CT-리포좀 (15)의 내 종양 축적의 변화의 간단한 정량을 허용 CT 영상에서 CT-리포좀 농도와 콘트라스트 향상 사이에 ​​존재합니다.

바늘 기반 방법을 사용하여 IFP의 정확한 측정은 카테터와 조직 사이 좋은 유체 소통을 필요로한다. 또한, 그렇지 않으면 IFP 최소한의 공간적 변화가있을 것입니다, 높은 중앙 종양 IFP (> 5 ~ 10 mmHg로)가 만 사용 종양에 중요하다. 중부 표준시 - IFP 강탈을 사용하여 IFP의 공간 측정오티 인해 바늘 삽입으로 인한 조직 운동에 도전 할 수 systemcan. 이미징 사전 및 사후 바늘의 위치는 정확하게 바늘의 위치를​​ 식별하기위한 중요하다; 그러나 의한 측정 사이 조직 워핑 이후 니들 사이의 게재 위치를 연관시키는 어렵다. 그것은 바늘 삽입시 중요한 조직의 변형에 그 무작위로 선택 바늘 위치 결과를 알 수 있었다. 결과적으로,이 방법은 IFP의 적어도 정확한 공간 매핑을 제공 하였다. 반대로, 종양 부피에 걸쳐 선형 트랙을 따라 측정을 행하여 측정 IFP의 공간 정확도를 향상시킬 수있는 트랙 접선 바늘을 삽입. 트랙 접선 바늘을 삽입하여 측정 트랙 방향을 따라 조직의 변형의 영향을 최소화한다.

본 연구는 개별적인 종양에서 종양 미세, IFP 및 CT-리포좀 축적의 공간 분포를 측정 할 수있는 능력을 입증. 이러한 기술을 습득 한 후에는 종양 미세 환경과 약물 전달에 미치는 영향을 특성화하기 위해 독립적으로 또는 함께 이러한 측정을 수행하는 것이 가능하다. MDA-MB-231 유방암 이종 이식 모델에서 이들 방법을 사용하여 관류 플라즈마 체적 분율이 14 리포솜의 종양 내 분포의 강한 매개체 인 것으로 나타났다. IFP 및 리포좀 분포 사이의 강한 관계가있을 찾을 수 없습니다. 그러나 IFP 강하게 IFP 혈류의 조절을 통해 리포좀 분포 매개 간접 역할을 할 수 있음을 시사 종양 관류 측정으로 상관 관계가 있었다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDA-MB-231 metastatic breast adenocarcinoma tumor cells  ATCC HTB-26
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F1051
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x Solution GE Healthcare Life Sciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300-054
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Lipids Inc., USA 850355P
Cholesterol (CH) Avanti Lipids Inc., USA 700000P
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethylene glycol) 2000 (DSPE-PEG2000) Avanti Lipids Inc., USA 880128P
Omnipaque (Iohexol) 300 mg of iodine/ml  GE Healthcare, CA
80 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes Whatman Inc., USA
200 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes Whatman Inc., USA
10 m Lipex Extruder  Nothern Lipids Inc, CA
Dialysis Bag Molecular Weight Cut Off (MWCO) of 8 kDa Spectrum Labs, USA 
750,000 Nomical Molecular Weight Cut Off (NMWC) Tangential flow column  MidGee ultrafiltration cartridge, GE Healthcare, CA
Peristaltic pump  Watson Marlow Inc., USA
UV spectrometer Helios γ, Spectronic Unicam,  USA
90Plus particle size analyzer  Brookhaven, Holtsville, USA
eXplore Locus Ultra micro-CT system  GE Healthcare, CA Manipulated using CT-Console Software
AxRecon GPU-based Reconstruction  Acceleware Corp. CA
27 G Catheter SURFLO Winged Infusion Set Terumo Medical Products, USA SV*27EL
PE20 polyethylyne tubing Becton Dickinson, USA 427406
Pen tip 25 G × 3.5′′ Whitacre spinal needle  Becton Dickinson, USA 405140 IFP needle
P23XL  pressure transducer  Harvard Apparatus, CA P23XL
PowerLab 4/35, Bridge Amp, with LabChart Pro 7.0 ADInstruments Pty Ltd., USA PL3504, FE221 IFP acquisition system and acquisition software
CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot) Parallax Innovations, CA Manipulated using CT-IFP robot Control Software
CT-IFP robot alignment software Custom Matlab software
DCE-CT Analysis Software Custom Matlab software
Matlab 2013b Mathworks, USA

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References

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