Medidas espaciais de Perfusão, intersticial pressão do produto e lipossomas Acumulação em tumores sólidos

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Stapleton, S., Mirmilshteyn, D., Zheng, J., Allen, C., Jaffray, D. A. Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors. J. Vis. Exp. (114), e54226, doi:10.3791/54226 (2016).

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Abstract

A acumulação intra-tumoral heterogêneo de lipossomas é um factor determinante da sua eficácia. Tanto a microcirculação tumor caótica e elevada IFP estão ligados à distribuição intra-tumoral heterogêneo de sistemas de entrega de medicamentos à base de nanotecnologia, tais como lipossomas. No presente estudo, a relação entre a microcirculação tumor, IFP elevada e acúmulo de nanopartículas foi investigada através de in vivo experimentação. Isto foi conseguido através da avaliação da microcirculação tumor usando contraste dinâmico tomografia computadorizada (DCE-CT) e medição de IFP tumor usando um novo sistema de colocação da agulha robótico guiada por imagem conectado ao scanner micro-CT. A acumulação intra-tumoral de lipossomas foi determinado por avaliação com base em imagens CT de uma formulação lipossomal nanopartícula que encapsular estavelmente o iohexol agente de contraste (CT-lipossomas). CT imagiologia permitido para a co-localização da distribuição espacial dehemodinâmica tumorais, IFP e acumulação CT-lipossomas em um rato modelo de xenoenxerto subcutâneo individual de cancro da mama. Medições levou à descoberta de que a perfusão e a fração de volume de plasma são fortes mediadores de a distribuição intra-tumoral de lipossomas. Além disso, os resultados sugerem que o IFP desempenha um papel indireto na mediação de distribuição de lipossomas através de modulação do fluxo sanguíneo.

Introduction

Medição da acumulação intra-tumoral de sistemas de entrega de droga de nanopartículas podem ser uma ferramenta importante para determinar se uma concentração adequada de droga citotóxica foi atingido no interior do tumor. O desenvolvimento de sistemas de lipossomas "imagem-poder" permite a não-invasivo e quantitativa in vivo de detecção do veículo de entrega da droga usando métodos de imagem como a tomografia por emissão de positrões (PET) 1, fluorescência óptica 2, e tomografia computadorizada (CT) 3, 4 e ressonância magnética (MRI) 5. Imagem tem sido usado para determinar a farmacocinética e biodistribuição de sistemas de entrega de lipossomas e para revelar o grau de heterogeneidade inter-sujeito e intra-tumoral na acumulação de nanopartículas 6,7. No entanto, a imagem latente de nanopartículas sozinho não identificar as barreiras biológicas que têm contribuído para a sua má acumulação e distribuição. Este conhecimento é fundamental para o rdesenvolvimento acional de formulações mais eficazes e estratégias para melhorar a acumulação intra-tumoral 8. Demonstrou-se que as estratégias terapêuticas pode ser aplicada para modular as barreiras biológicas específicas resultando na melhoria do transporte de nanopartículas 9. Além disso, as formulações de nanopartículas têm sido desenvolvidos especificamente para superar a barreira biológica específica de transporte 10. Em ambos os casos, as medições de barreiras biológicas pode ser utilizado para orientar o uso de uma estratégia adequada de administração de fármaco de nanopartículas.

Microcirculação do tumor e elevada IFP são acreditados para ser dois principais determinantes da acumulação intra-tumoral das nanopartículas, tal como lipossomas, em tumores sólidos 9,11. No entanto, outras barreiras que contribuem para a acumulação de lipossomas pobres incluem uma matriz densa extracelular, vasculatura impermeável e pressão tecido sólido 12. Estas barreiras estão relacionados em um espaço-temporalforma, com o fluxo sanguíneo anormal e pressão do fluido intersticial elevada sendo dois importantes fatores que impulsionam a entrega inicial e extravasamento de nanopartículas. Como discutido anteriormente, que estabelece a relação entre a microcirculação do tumor, IFP elevada, e a acumulação intratumoral de lipossomas é imperativo para a correcta interpretação dos dados de imagem de lipossomas. Nisto métodos quantitativos para medir a relação entre a microcirculação do tumor, IFP elevada, e acumulação de nanopartículas num tumor sólido são apresentados. Isto é conseguido através da realização de medições co-localizada da distribuição intra-tumoral de um agente de contraste de lipossoma CT usando tomografia computadorizada volumétrica, microcirculação tumor usando contraste dinâmico aprimorado tomografia computadorizada, e IFP tumor utilizando um sistema de posicionamento da agulha robótico guiada por imagem, denominado o robô CT-IFP 13.

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Protocol

Todas as experiências in vivo foram realizados sob um protocolo aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use a Rede Universitária de Saúde.

1. Modelo Animal

  1. Cultura entre 5 a 7 x 10 6 MDA-MB-231 de adenocarcinoma da mama células tumorais em DMEM junto com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 100x diluição de penicilina-estreptomicina.
  2. Células colheita quando estão 80% confluentes utilizando uma solução de tripsina-EDTA a 0,05%. Após 3-5 min neutralizar a tripsina-EDTA com um volume de DMEM 3x. Tomar uma alíquota de 15 ul de células e contar com um hemocitômetro. Centrifugar células em um sedimento durante 5 min a 200 xg e re-suspender em HBS a uma concentração de 10 x 10 6 culas por ml.
  3. Implante subcutânea (SC) de tumores por injecção de 1 a 2 x 10 6 células no membro posterior de cada 8 a 12 semanas de idade do sexo feminino ratinho SCID (n = 5). Use uma agulha 25 G padrão para injeção.
  4. Monitor de tumor de crescimento utilizando pinças (volume = 0,5 x comprimento x largura 2) e iniciar as medições uma vez que os tumores SC atingiram um volume> 200 mm3 (cerca de 7 a 9 dias).

2. CT-lipossoma Preparação e Caracterização

  1. lipossoma Preparação
    1. Dissolve-se os componentes lípidos (200 mmol / L) para a CT-lipossomas, incluindo 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), colesterol (CH), e 1,2-distearoil-sn-glicero-3 -phosphoethanolamine-N-poli (etileno-glicol) 2000 (DSPE-PEG2000) em etanol anidro a 70 ° C a uma razão molar de 55: 40: 5 de DPPC: CH: DSPE-PEG2000.
    2. Evapora-se o etanol através da manutenção de calor a 70 ° C, e depois adicionar o agente de contraste iohexol CT (300 mg / ml de iodo) para a solução de tal modo que a concentração final de lípido é de 100 mm.
    3. Manter a solução a 70 ° C durante 4 h, com agitação em vórtice frequente.
    4. Para obter vesículas unilamelares, a extrusão da amostra 5 timES através de duas membranas empilhadas 200 nm de tamanho de poro, a uma pressão de 250 psi e extrudir novamente por 5 ciclos através de duas membranas de dimensão de poro de 80 nm a 400 psi empilhados usando uma extrusora de lípido de 10 ml. Pipetar um volume de 10 ml de lipossomas na extrusora no início de cada ciclo de extrusão e recolher em um tubo ou frasco de vidro cónico esterilizado depois de cada ciclo de extrusão.
    5. Remover o iohexol encapsulado-un por 16 horas de diálise com um peso molecular de 100 kDa cortada (CMM) saco de diálise contra um volume em excesso de 250 vezes de uma solução 0,02 mM de HEPES-tamponado com solução salina (HBS, pH 7,4). Por exemplo, colocar 1 ml de solução de lipossoma para dentro do saco de diálise, com 250 ml de HBS fora do saco numa proveta.
    6. Concentrar as CT-lipossomas utilizando um sistema de fluxo de 750.000 nomical MWC comercial tangencial de acordo com as instruções do fabricante. Concentra-se para uma concentração de iodo final de aproximadamente 55 mg ml -1.
  2. lipossoma Caracterização
    1. Medir a eficiência de encapsulação por ruptura das CT-lipossomas usando um excesso de volume de 10 vezes de etanol para libertar o ioxehol e depois dilui-se utilizando um excesso de volume de 100 vezes de água desionizada (ou seja, 10 pi de lipossomas rompido utilizando 100 ul de etanol e, em seguida, diluída para um volume final de 10 ml).
    2. Determinar a concentração de iohexol utilizando um espectrómetro UV com detecção de comprimento de onda de 245 nm. Calcula-se a eficiência encapsulamentos tomando a quantidade proporção de agente de iohexol libertado para a quantidade de agente adicionado durante a preparação.
    3. Medir o diâmetro hidrodinâmico e potencial zeta usando um sistema de analisador de tamanho de partícula de dispersão de luz dinâmica, de acordo com as instruções do fabricante. Dilui-se a solução de lipossomas por CT-200x (ou seja, 5 ul de lipossomas em 1 ml de volume final) em água desionizada de modo a facilitar as medições.

3. CT imagem da microcirculação tumor e CT-lipossomaDistribuição

NOTA: Siga as instruções do fabricante para a realização de uma verificação volumétrica se a versão de software diferente ou for utilizado equipamento.

  1. Anestesiar cada rato utilizando 2% de isoflurano misturado com ar medicinal ou oxigénio e confirme apertando o dedo do pé e observando nenhuma reação. Aplicar pomada para os olhos para evitar a secura e sob anestesia. Imobilizar animal em uma posição propensa gravando patas para uma placa de plástico fino.
  2. Coloque um costume 27 G catéter, ligado a 20 cm no tubo PE10, na veia caudal lateral e prenda no lugar com vários pedaços de fita.
  3. Prepara-se uma seringa de 1 ml para conter, pelo menos, 200 uL de CT-lipossomas. Prepara-se uma seringa de 1 ml com solução salina a ser usado para lavar o cateter. Finalmente, preparar uma seringa de 1 ml com, pelo menos, 150 uL de iohexol livre misturado com soro fisiológico (9: 1 razão em volume).
  4. Posicione o mouse em decúbito ventral na mesa do scanner micro-CT. Use o sistema de posicionamento laser para colocar o tumor em aproximadamente a mesma orientação para cada varrimento.
  5. Colocar a seringa de CT-lipossoma em uma bomba de seringa e fixar o cateter para a seringa. Definir a taxa de bombeamento de 10 ml por segundo.
  6. Inicializar o sistema através da realização de uma verificação de calibração claro-escuro usando o software do console CT-scanner. Selecione a opção de digitalização claro-escuro para cada protocolo de imagem de interesse, selecione claro-escuro do menu drop-down e pressione o botão de verificação para iniciar a calibração.
  7. Executar uma anatômica micro-CT volumétrica do tumor antes de qualquer injecção de agente de contraste. Observe o indicador de software do console do scanner CT para garantir a segurança CT scanner travas foram apagadas. No scanner CT console, selecione varredura selecionar uma energia de raios-x de 80 kV, a corrente do tubo de 70 mA, e capta 1.000 projeções de imagem ao longo do tempo 16 seg. Pressione o botão Digitalizar para iniciar a digitalização.
  8. Utilizar a bomba de seringa para injectar um bolus de CT-lipossomas a uma concentração de 400 mg kg de iodo-1. Definir a bomba de injectar um volume de aproximadamente 150 ul (assumindo que um rato de 25 g). Pressione o botão 'start' na bomba para injetar. descarregar manualmente o cateter com 50 ul de solução salina (duas vezes o volume do cateter) para assegurar que toda a quantidade do agente foi injectada e o cateter é clara.
  9. Aguarde 10 minutos após a injeção de CT-lipossomas e, em seguida, executar uma segunda varredura anatômica usando o mesmo método e configurações descrito em 3.5.
  10. Realizar uma verificação do DCE-CT, definindo a bomba de seringa para injectar um volume de 100 ul do iohexol livre misturado com soro fisiológico (9: 1 razão em volume) usando a mesma configuração da taxa de injecção descrito em 3.3.
    1. No console CT scanner selecione a verificação dinâmica 5 min que usa uma configuração de energia de raios-x de 80 kV, uma energia tubo de 90mA, e capta 416 imagem projeções cada segundo durante os primeiros 30 segundos e seguido de uma aquisição a cada 10 segundos . Capturar 5 segundos de dados DCE-CT e, em seguida, pressione o botão de início do injectiobomba n.
    2. Após a verificação DCE-CT executar uma varredura anatômica micro-CT volumétrica.
  11. Capturar imagens anatómicas CT entre 48 e 72 h pós-injecção de CT-lipossomas, usando as mesmas definições CT volumétrica como descrito nas etapas 3.5.
  12. Reconstruir os anatômicas dados CT e DCE-CT usando o software GPU-reconstrução.
    1. Carregar a imagem para o software de reconstrução. Selecione a região de interesse para ser reconstruído por desenhar uma ROI sobre a imagem usando um mouse. Definir o local para salvar e nome do arquivo para o reconstruída fotografada e selecione o tipo de arquivo de saída como '.mat'.
      NOTA: O software irá definir automaticamente o tamanho do voxel reconstruída para 0,153 x 0,153 x 0,153 mm3 para exames anátomo- 0,153 x 0,153 x 0,462 mm3 para varreduras DCE-CT. Clique no botão "começar a reconstrução".
  13. Utilizar a pré-injecção e 10 min pós-injecção varreduras de CT-lipossoma para calcular ofracção do volume do plasma como descrito anteriormente 3. Além disso, utilizar o pré-injecção e 5 min exames pós-injecção de iohexol para calcular a fracção de volume intersticial tal como descrito anteriormente 7.
  14. Obter intensidade tempo de curvas (TICs) ao importar os dados DCE-CT em software que fornece a capacidade de identificar uma região de interesse (ROI) dentro do volume do tumor. Em seguida o cálculo do realce significativo TC na ROI como uma função do tempo. Neste experimento software personalizado foi desenvolvido para identificar um ROI e calcular a TIC.
  15. Obter estimativas quantitativas de perfusão e permeabilidade vascular ajustando TICs medidos usando um modelo cinético traçador de dois compartimentos. Encaixe pode ser realizada usando software de análise de DCE-CT e utilizar as estimativas priori da fracção de volume de plasma e fracções de volume intersticial como parâmetros fixos no modelo cinético do marcador de dois compartimentos. Usar métodos reportados anteriormente para obter estimativas a priori do plasmaa e frações de volume intersticiais 14.

4. Medidas espaciais de Tumor intersticial Pressão Fluid

  1. Para medir IFP conectar a agulha espinhal 25 G para o transdutor de pressão e ao sistema de aquisição IFP através de 50 cm de tubo de polietileno PE20. Lavar todo o sistema com uma solução de sulfato de heparina / solução salina (01:10). Esterilizar a agulha com 70% isopropílico antes da utilização.
  2. Ligue o sistema de aquisição e lançar o software de aquisição de IFP e carregar os arquivos de configurações para calibrar o sistema para adquirir medições IFP em mmHg. Clique no botão AQUISIÇÃO para recolher continuamente dados IFP.
  3. Realizar medições IFP entre 48 e 72 horas após a injecção de lipossomas-CT (isto corresponde a aproximadamente o tempo de acumulação de pico de CT-lipossomas em que o tumor), utilizando os métodos descritos em 4.8. Coloque a agulha IFP para o robô CT-IFP.
  4. Executar verificações de calibração para alinhar os sistemas de coordenadas parao robô CT-IFP eo scanner CT. Adicionar o acessório marcador fiducial para o robô CT-IFP e executar um de quatro volumétrica TC com o marcador fiducial em quatro posições diferentes.
    1. O lançamento do software controlador do robô CT-IFP, inicializar o robô, e mover o robô para as três posições, inserindo os x, y, z alvejando posições e clicando no botão "ir".
    2. Tome uma tomografia computadorizada no seguinte x, y, z coordenadas: (1) 0,0,0; (2) -10,0,0; (3) 0,7,0; e (4) 0,0,10. Selecione um kV 90, 10 mA, 16 varredura seg usando o software CT-scanner e pressione 'Start' para iniciar a digitalização. Reconstruir a digitalização como descrito em 3.10.
  5. Inicie o software de alinhamento robô CT-IFP. Clique no botão "adicionar" carregado na região "Dados de Registo" e selecione os quatro varreduras de registro reconstruídos obtidos em 4.3, clique em 'open'.
    NOTA: A localização de pixel do marcador fiducial serão automaticamente inseridos no softwaré.
    1. Clique no botão "Calcular Transformar 'e depois clique no botão" Aplicar Transformação'. Isto gera dados de alinhamento que vai ser usado para converter o robô CT-IFP sistema de coordenadas para o aparelho de tomografia computadorizada sistema de coordenadas. Após a calibração estiver completa, coloque a plataforma de animal para o robô CT-IFP.
  6. Anestesiar cada rato utilizando 2% de isoflurano misturado com ar medicinal ou oxigénio e confirme apertando o dedo do pé e observando nenhuma reação. Imobilizar animal na plataforma do robô CT-IFP e posicione o mouse de modo que o tumor é acessível para o sistema do robô CT-IFP. Imobilizar o tumor utilizando fita adesiva de tal modo que não se move durante a inserção da agulha IFP.
  7. Efectuar uma análise micro-CT anatômica antes de inserir a agulha IFP. Reconstruir os dados CT usando as etapas descritas em 3.10.
  8. Carregar os dados de inserção CT pré-agulha para o software de alinhamento robô CT-IFP. Ajustar a janela e o nível de visualizar o tumor. Clique no the borda do tumor em qualquer imagem, em seguida, clique em um segundo local aro.
    NOTA: O software irá calcular uma série de posições ao longo de uma linha linear entre as duas posições. Note-se a x, y e z coordenadas para uma série de 5 a 8 posições uniformemente espaçadas a partir da lista.
  9. Prepara-se o sistema PI, através de lavagem da agulha com uma solução salina de heparina antes da inserção.
  10. Digite as primeiras posições da agulha pré-determinados para o x, y, z, para o software de controle do robô CT-IFP e pressione-move para o botão "ir" para mover o robô para a posição desejada. Clique no botão "Insert agulha 'para inserir a agulha no tecido.
    1. Depois de inserir a agulha garantir uma boa comunicação fluida entre a agulha IFP eo tecido apertando e soltando o tubo PE20, observando que os IFP aumentos de medição e retorna ao valor de pré-beliscar sobre o software de aquisição de IFP. Rejeitar as medições que não retornam à linha de base.
  11. adquirir umaTC anatômica com a agulha inserida, em seguida, clique no botão "Retração da agulha 'no software de controle do robô CT-IFP para retrair a agulha do tecido. Rejeitar quaisquer medições IFP onde o valor IFP não regressa ao valor de inserção pré-agulha após a retirada da agulha. Isto significa que a agulha pode ter sido obstruído durante a medição. Repita os passos 4,8-4,10 para cada posição da agulha.
  12. Determinar a posição da agulha no interior do volume do tumor por meio do cálculo das posições x, y, e z da porta da agulha em relação ao centro de massa do volume de tumor tal como identificado na pós-inserção varrimento CT volumétrica da agulha.
  13. Retornar animais para sua gaiola depois de todas as medições estão completos. Não deixar os animais sem vigilância, e cuidar para observá-los até que a consciência foi recuperado e eles são capazes de manter decúbito esternal.

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Representative Results

O protocolo acima referido deve render CT-lipossomas com uma concentração encapsulada de iohexol, diâmetro médio de lipossomas, e potencial zeta de 55 mg ml -1, 91,8 ± 0,3 nm e -45,5 ± 2,5 mV, respectivamente. Figura 1a inclui imagem representativa DCE-CT resultados, produzindo uma série temporal de dados volumétricos que mostram as mudanças temporais na acumulação intra-tumoral de iohexol. Selecção de uma ROI dentro do tumor produz um tique que pode ser quantificada utilizando traçadores métodos de modelação cinética para obter estimativas de perfusão, a permeabilidade vascular, fracção de volume de plasma, e a fracção de volume intersticial (Figura 1b). Neste estudo, foi utilizado um modelo de cinética de marcador de dois compartimentos e ajuste para o TIC medido utilizando uma curva de rotina de ajuste não linear implementado em Matlab 14. Segmentação do volume do tumor em vários regiões de interesse de igual tamanho permite a quantificação de tele distribuição espacial dos parâmetros hemodinâmicos no interior do volume do tumor (Figura 1C). A segmentação pode ser realizada manualmente, que é moroso e difícil, ou automaticamente, conforme aqui realizada usando um algoritmo que se divide o tumor em vários tamanhos iguais ROIs usando um sistema de coordenadas esféricas. Os métodos de DCE-CT fornecer estimativas quantitativas da distribuição espacial da perfusão, permeabilidade vascular, fracção de volume de plasma, e a fracção de volume intersticial. Foram observados esses parâmetros para ser espacialmente heterogénea com níveis mais elevados de perfusão, de plasma e fracções de volume intersticial ao longo da periferia em comparação com o volume tumoral central.

O método de imagem CT volumétrica revela a biodistribuição e a distribuição intra-tumoral das CT-lipossomas. A Figura 2A mostra a biodistribuição de lipossomas a CT-48 h pós-injecção. O agente ainda está circulando no thsistema vascular e, com absorção significativa observada no baço e no fígado. Observou-se a acumulação intra-tumoral das CT-lipossomas a ser heterogénea, com acumulação predominantemente periférica em relação ao centro, como denotado pelas regiões brilhantes dentro do volume do tumor (Figura 2b).

CT volumétrica de imagem pode ser usada para controlar a localização de medições IFP feita utilizando a configuração do robô CT-IFP. A Figura 3a mostra a colocação da agulha IFP dentro do volume do tumor como fotografada usando de alta resolução de micro-CT. A agulha pode ser claramente identificadas no interior do volume do tumor para permitir a localização espacial das medições IFP dentro do volume do tumor (Figura 3b). É possível gerar um mapa espacial do IFP em todo o tumor através da realização de medições múltiplas IFP dentro do volume do tumor. O IFP espacial pode então ser correlacionada com as medições correspondentes demicrocirculação do tumor e à acumulação CT-lipossoma.

Volumétrico CT de imagem permite um quadro comum de referência tornando possível a co-localizar medidas de hemodinâmica, IFP, e acumulação CT-lipossoma. Figura 4 dá um exemplo de medições espacialmente co-localizadas de acumulação CT-lipossoma, IFP, perfusão, permeabilidade vascular, fração de volume de plasma, e fração de volume intersticial. Observou-se que a perfusão e a fracção do volume de plasma foi significativamente correlacionado com a acumulação intra-tumoral das CT-lipossomas em subcutâneas MDA-MB-231 tumores. Além disso, a distribuição radial do IFP correlacionados com as medições hemodinâmicas. Estes resultados sugerem existir uma relação espaço-temporal complexa entre a microcirculação tumor, IFP e da acumulação intra-tumoral de lipossomas 14.

figura 1 Figura 1: Imagens de DCE-CT da microcirculação do tumor (a) Uma série representativa de imagens de CT temporais recolhidos no interior do volume do tumor, descrevendo a cinética do agente de contraste como uma função do tempo.. O contorno vermelho representa um ROI em que a curva de intensidade de tempo (TIC) é medido. (B) O TIC é adequado utilizando um modelo de cinética de marcador de dois compartimentos, para se obter estimativas quantitativas dos parâmetros hemodinâmicos dentro da ROI. (C) distribuição espacial Representante de parâmetros hemodinâmicos quantitativas no tumor. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: volumétrico CT-Imaging de lipossomas Acumuladores ção. (a) uma imagem representativa do volume 3D-rendeu demonstrando a biodistribuição da CT-lipossomas. (B) axial Representante, coronal e sagital fatias tomadas através do centro do tumor mostrando a acumulação intra-tumoral de CT-lipossomas em 48 horas após a injecção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:. Guiada por imagem Medidas IFP (a) Uma imagem renderizada-volume 3D representante do sistema do robô CT-IFP (verde) de inserção pós-agulha, um tumor subcutâneo em 48 horas após a injecção de CT-lipossomas (laranja). (B) Uma imagem CT representante da inserção pós-agulha./54226/54226fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4:. Medições localizada-Co da microcirculação do tumor, IFP, e acumulação de CT-lipossoma Painel mostrando uma co-localização espacial representante de pós-injecção, IFP, perfusão, permeabilidade vascular, fracção de volume de plasma de 48 h acumulação feita CT-lipossoma e fracção do volume intersticial. Re-impressão com a permissão de 14. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Os métodos de medição com base em imagens aqui apresentadas permitir a determinação da distribuição espacial das propriedades microcirculação tumor, IFP e acumulação CT-lipossoma. As tentativas anteriores de se relacionar essas propriedades têm contado com a realização de medições em massa em vários animais portadores de tumor e, portanto, não têm a sensibilidade para elucidar os mecanismos responsáveis ​​pela heterogeneidade na acumulação intra-tumoral que tem sido comumente observada para os sistemas de distribuição de drogas de tamanho nano-15. DCE-CT fornece uma ferramenta para medir as variações intra-tumoral em propriedades da microcirculação tumor, volumétrico CT fornece uma descrição precisa da cinética de deposição CT-lipossomas, eo sistema do robô CT-IFP fornece uma ferramenta para realizar o mapeamento espacial do IFP no o mesmo animal. Além disso, DCE-CT imagem é um método clinicamente aprovado para medir a hemodinâmica tumor na prática clínica, tornando os resultados deste estudo transl potencialmente clinicamenteuma mesa.

Dada a complexidade das medidas, há vários factores essenciais para garantir a recolha de conjuntos de dados robustos. DCE-CT quantificação base da microcirculação tumor é sem dúvida o mais difícil garantir estimativas precisas de hemodinâmica tumorais. Requer a obtenção de TIC com elevado sinal para relações de ruído (SNR) e empregando um algoritmo de ajuste robusto para quantificar as TIC 16,17. A inspecção visual de tiques podem ser usadas para remover os dados de baixa SNR a partir da análise. Além disso, se não forem tomadas, em seguida, a instalação de alta SNR TICs também podem levar a estimativas erradas de perfusão do tumor, a permeabilidade vascular, fração de volume de plasma, e fração de volume intersticial 16. A fim de maximizar a precisão quantificação uma estratégia foi empregue para obter estimativas independentes modelo das fracções de plasma e de volume intersticial, que são posteriormente utilizados como parâmetros fixos durante o ajuste do modelo de tiques medidos. Este métodogarante estimativas robustas de perfusão do tumor e permeabilidade vascular são obtidos 15.

análise robusta de a distribuição intra-tumoral das CT-lipossomas requer a realização de imagem CT volumétrica após acumulação suficiente do agente. A partir de estudos anteriores, a acumulação de tumor de pico da CT-lipossomas ocorre entre 48 a 72 horas em xenoenxertos rato 3,15. Além disso, existe uma relação linear entre a concentração de TC-lipossoma e realce de contraste em imagiologia de CT permitindo a simples quantificação das variações na acumulação intra-tumoral de lipossomas CT-15.

medições precisas de IFP utilizando o método baseado na agulha requerem uma boa comunicação de fluido entre o cateter e o tecido. Além disso, é importante apenas tumores que têm alta utilização IFP central do tumor (> de 5 a 10 mm Hg), caso contrário, haverá variações espaciais mínimas em FIP. medições espaciais do IFP usando o CT-IFP robot systemcan ser um desafio devido ao movimento do tecido causada pela inserção da agulha. pré-imagem e colocação de pós-agulha é fundamental para identificar com precisão a colocação da agulha; No entanto, pode ser difícil de se relacionar a posição entre os canais de agulha subsequentes, devido a deformação do tecido entre as medições. Verificou-se que a escolha aleatoriamente posições da agulha resulta na deformação do tecido significativa durante a inserção da agulha. Como resultado, este método proporcionou o mapeamento espacial menos precisas de FIP. Por outro lado, a realização de medições ao longo de uma faixa linear em todo o volume do tumor e inserir a agulha tangente à pista pode melhorar a precisão espacial das medições IFP. Inserir a agulha tangencial à faixa minimiza os efeitos da deformação do tecido ao longo da direcção de medição faixa.

Este estudo demonstrou a capacidade de medir a distribuição espacial da microcirculação tumor, IFP e acumulação CT-lipossomas em um tumor individual. Depois de dominar estas técnicas, é então possível realizar estas medições de forma independente ou em conjunto para caracterizar o microambiente do tumor e dos seus efeitos sobre a entrega da droga. Usando estes métodos no modelo de xenoenxerto da mama MDA-MB-231 revelaram que a perfusão e a fração de volume de plasma são fortes mediadores de a distribuição intra-tumoral de lipossomas 14. Não foi encontrado para ser uma forte relação entre o IFP e distribuição de lipossomas. No entanto, o IFP foi fortemente correlacionada com as medições de perfusão do tumor, o que sugere que IFP pode desempenhar um papel indireto na mediação de distribuição de lipossomas através da modulação do fluxo sanguíneo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDA-MB-231 metastatic breast adenocarcinoma tumor cells  ATCC HTB-26
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F1051
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x Solution GE Healthcare Life Sciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300-054
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Lipids Inc., USA 850355P
Cholesterol (CH) Avanti Lipids Inc., USA 700000P
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethylene glycol) 2000 (DSPE-PEG2000) Avanti Lipids Inc., USA 880128P
Omnipaque (Iohexol) 300 mg of iodine/ml  GE Healthcare, CA
80 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes Whatman Inc., USA
200 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes Whatman Inc., USA
10 m Lipex Extruder  Nothern Lipids Inc, CA
Dialysis Bag Molecular Weight Cut Off (MWCO) of 8 kDa Spectrum Labs, USA 
750,000 Nomical Molecular Weight Cut Off (NMWC) Tangential flow column  MidGee ultrafiltration cartridge, GE Healthcare, CA
Peristaltic pump  Watson Marlow Inc., USA
UV spectrometer Helios γ, Spectronic Unicam,  USA
90Plus particle size analyzer  Brookhaven, Holtsville, USA
eXplore Locus Ultra micro-CT system  GE Healthcare, CA Manipulated using CT-Console Software
AxRecon GPU-based Reconstruction  Acceleware Corp. CA
27 G Catheter SURFLO Winged Infusion Set Terumo Medical Products, USA SV*27EL
PE20 polyethylyne tubing Becton Dickinson, USA 427406
Pen tip 25 G × 3.5′′ Whitacre spinal needle  Becton Dickinson, USA 405140 IFP needle
P23XL  pressure transducer  Harvard Apparatus, CA P23XL
PowerLab 4/35, Bridge Amp, with LabChart Pro 7.0 ADInstruments Pty Ltd., USA PL3504, FE221 IFP acquisition system and acquisition software
CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot) Parallax Innovations, CA Manipulated using CT-IFP robot Control Software
CT-IFP robot alignment software Custom Matlab software
DCE-CT Analysis Software Custom Matlab software
Matlab 2013b Mathworks, USA

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References

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