Perfüzyon Mekansal Ölçümler, Solid Tümörlerde interstisyel sıvı basınç ve lipozomlar Birikim

JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Stapleton, S., Mirmilshteyn, D., Zheng, J., Allen, C., Jaffray, D. A. Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors. J. Vis. Exp. (114), e54226, doi:10.3791/54226 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

lipozom heterojen intra-tümöral birikim onların etkinliğinin önemli bir belirleyicisidir. kaotik tümör mikro sirkülasyonu ve IFP yüksek Hem lipozomlar gibi nanoteknoloji dayalı ilaç verme sistemleri heterojen intra-tümöral dağılımı ile bağlantılıdır. Bu çalışmada, tümör mikrosirkülasyon, yüksek IFP ve nanopartiküllerin birikimi arasındaki ilişki in vivo deneylerle araştırılmıştır. Bu dinamik bilgisayarlı tomografi (DCE-BT) gelişmiş kontrast ve tümör IFP ölçümü mikro-CT tarayıcıya bağlı yeni bir görüntü kılavuzluğunda robotik iğne yerleştirme sistemi kullanılarak tümör mikrosirkülasyonun değerlendirilmesi ile gerçekleştirilmiştir. Lipozomların intra-tümöral birikimi stabil olarak kontrast maddesi iyoheksol (BT-lipozomlar) kapsülleyen bir nano lipozomal formülasyonun BT görüntü bazlı değerlendirilmesi ile belirlenmiştir. BT görüntüleme mekansal dağılımı co-lokalizasyonu için izinTümör hemodinami, meme kanseri bireysel subkütan ksenograft fare modelinde IFP ve BT-lipozom birikimi. Ölçümler perfüzyon ve plazma hacim oranı lipozom intra-tümöral dağılımının güçlü arabulucular olan keşfine yol açtı. Ayrıca, sonuçlar IFP kan akışını modüle yoluyla lipozom dağıtımı aracılık dolaylı bir rol oynadığını göstermektedir.

Introduction

nanoparçacık ilaç verme sistemleri intra-tümöral birikiminin ölçülmesi sitotoksik ilacın yeterli bir konsantrasyonu, tümör içinde elde edilmiş olup olmadığını belirlemek için önemli bir araç sağlayabilir. "Görüntü mümkün" lipozomal sistemlerinin geliştirilmesi non-invaziv ve nicel sağlar in vivo böyle pozitron emisyon tomografisi (PET) 1, optik floresan 2, ve bilgisayarlı tomografi (BT) 3 olarak görüntüleme yöntemleri ile ilaç uygulama aracı tespiti, 4 ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) 5. Görüntüleme farmakokinetik ve lipozom verme sistemleri biyolojik dağılımını belirlemek ve nanoparçacık birikimi 6,7-arası konu ve intra-tümöral heterojenlik derecesini ortaya çıkarmak için kullanılmaktadır. Ancak, nanopartiküllerin görüntüleme yalnız kendi kötü birikimi ve dağıtım katkıda bulunmuş biyolojik engelleri tespit etmez. Bu bilgi r için her şeyden önemlidirilli daha etkili formülasyonlar geliştirilmesi ve stratejiler intra-tümöral birikimi 8 geliştirmek. Terapötik stratejiler geliştirilmiştir nanoparçacık taşıma 9'da elde edilen belirli bir biyolojik bariyerler modüle uygulanabilir olduğu gösterilmiştir. Buna ek olarak, nanopartikül formülasyonları spesifik olarak belirli bir biyolojik taşıma bariyer 10 üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. Her iki senaryoda da biyolojik engellerin ölçümleri uygun bir nanoparçacık ilaç dağıtım stratejisinin kullanımına rehberlik etmesi için kullanılabilir.

Tümör mikrodolaşım ve yükseltilmiş IFP katı tümörler 9,11 tür lipozomlar gibi nanopartiküllerin intra-tümöral birikimi iki anahtar belirleyicisi, olduğuna inanılmaktadır. Ancak, kötü lipozom birikimine katkıda bulunmak için diğer engeller yoğun hücre dışı matriks, geçirimsiz damarsal ve katı doku basıncı 12 arasındadır. Bu engeller bir uzay-zamansal olarak ilişkilişekilde, anormal kan akımı ve yüksek interstisyel sıvı basıncı nanopartiküllerin ilk teslimat ve ekstravazasyonu sürüş iki önemli faktör olmak. Daha önce belirtildiği gibi, tümör mikrosirkülasyon, yüksek IFP ve lipozom intra-tümöral birikim arasındaki ilişki kuran lipozom görüntüleme verilerinin doğru yorumlanması için zorunludur. Burada nicel yöntemler bir solid tümör tümör mikrosirkülasyon, yüksek IFP ve nanoparçacık birikimi arasındaki ilişkiyi ölçmek için sunulmuştur. Bu dinamik kontrast bilgisayarlı tomografi görüntüleme gelişmiş kullanarak hacimsel BT görüntüleme, tümör mikrosirkülasyon kullanarak BT lipozom kontrast madde intra-tümöral dağıtım eş lokalize ölçümler gerçekleştirilir ve bir görüntü kılavuzluğunda robotik iğne konumlandırma sistemini kullanarak tümör IFP denir CT-IFP robot 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm in vivo deneyler Üniversitesi Sağlık Ağı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan bir protokol çerçevesinde gerçekleştirildi.

1. Hayvan Modeli

  1. Birlikte% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin-streptomisin 100x seyreltme ile DMEM içerisinde 5 x 10 6, MDA-MB-231 7 göğüs adenokarsinoma tümör hücreleri arasında kültür.
  2. Hasat hücreler% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi kullanılarak% 80 konfluent olduğunda. 3-5 dakika sonra DMEM 3x hacim tripsin-EDTA etkisiz hale getirir. hücrelerin 15 ul tablet alın ve bir hemasitometre kullanarak saymak. 200 x g'de 5 dakika boyunca bir pelet halinde Santrifüj hücreleri ve ml başına 10 x 10 6 hücre konsantrasyonunda HBS'de yeniden askıya.
  3. İmplant deri altı (SC), her biri 8 ila 12 haftalık dişi SCID fare arka bacak 1. 6 ila 10 x 2 hücreleri enjekte tümörleri (n = 5). Enjeksiyon için bir standart 25 G iğne kullanın.
  4. monitör tSC tümörleri hacim> 200 mm 3 (yaklaşık 7 ila 9 gün) ulaştığında umor büyüme kullanarak kaliperleri (Cilt = 0.5 x Uzunluk x Genişlik 2) ve ölçümler başlar.

2. CT-lipozom preparatı ve Karakterizasyonu

  1. lipozom preparatı
    1. 1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DPPC), kolesterol (CH), ve 1,2-distearoil-sn-glisero-3 dahil olmak üzere CT lipozomları lipid bileşenleri (200 mmol / L) çözündürün 40: 5: DPPC: CH: DSPE-PEG2000 55 bir molar oranda, 70 ° C'de susuz etanol içindeki -phosphoethanolamine-N-poli (etilen glikol) 2000 (DSPE-PEG2000).
    2. 70 ° C'de ısı sağlayarak etanol buharlaştırılmakta, daha sonra çözeltiye, CT kontrast maddesi iyoheksol (iyot 300 mg / ml) ekleyin bu nihai lipid konsantrasyonu 100 mM kadardır.
    3. sık sık vorteks 4 saat boyunca 70 ° C'da, çözelti koruyun.
    4. Numune 5 tim ekstrüzyona, tek katmanlı veziküller elde etmek içiniki ile es 250 psi arasında bir basınçta, 200 nm gözenek büyüklüğü membranları istiflenmiş ve 10 mi lipit ekstrüzyon presini kullanarak 400 psi iki istif 80 nm gözenek boyutlu membran ile 5 döngü tekrar a'ya. Her bir çekme döngüsünün başında ekstrüdere lipozomların, 10 ml bir hacme pipet ve her çıkarma işlemi sonra steril bir konik tüp ya da cam şişenin içine toplar.
    5. 100 kDa'lık bir molekül ağırlığı 0.02 mM HEPES-tamponlu tuzlu su çözeltisi (HBS, pH 7.4), 250-kat hacim olarak karşı (MWC) diyaliz torbası kesilmiş kullanılarak diyaliz 16 saat ile enkapsüle iyoheksol çıkarın. Örneğin, bir beher içinde torbanın dışındaki HBS'de 250 ml diyaliz torbası içindeki lipozom solüsyonu 1 ml yerleştirin.
    6. üreticinin talimatlarına uygun olarak bir 750.000 Excel-Word MWC ticari teğetsel akış sistemi kullanılarak, CT-lipozomlar konsantre edilir. Yaklaşık 55 mg ml'lik nihai iyot konsantrasyona kadar konsantre edin -1.
  2. Liposome Karakterizasyonu
    1. Ioxehol bırakın ve daha sonra iyonu giderilmiş su, 100-kat hacim olarak kullanılarak seyreltilmiş etanol 10 kat hacim olarak kullanıldığı zaman CT-lipozomlar koparılması suretiyle kapsülleme verimliliği ölçümü (lipozomlar yani 10 ul 100 etanol ul ve ardından seyreltilmiş kullanılarak rüptüre 10 ml'lik bir son hacme kadar).
    2. 245 nm'lik bir dalga boyunda algılama UV spektrometresi kullanılarak iyoheksol konsantrasyonunun belirlenmesi. maddenin miktarını serbest iyoheksol maddenin oranın alınarak kapsüller verimliliği hesaplamak hazırlanması sırasında ilave edildi.
    3. üreticinin talimatlarına göre bir dinamik ışık kırılmalı parçacık büyüklüğü analizörü sistemi kullanılarak hidrodinamik çapı ve zeta potansiyeli ölçülür. Ölçümleri kolaylaştırmak için deiyonize su içinde (son hacim 1 ml lipozom yani 5 ul) 200x CT-lipozom solüsyonu ile seyreltilir.

Tümör Mikrosirkülasyon ve BT-lipozom 3. BT Görüntülemedağıtım

NOT: Farklı yazılım sürümü veya ekipman kullanılması durumunda hacimsel tarama gerçekleştirmek için üreticinin talimatlarına uyun.

  1. tıbbi hava ya da oksijen ile karıştırılır% 2 izofluran kullanarak her fare anestezisi ve ayak kısma ve hiçbir tepki gözlemleyerek onaylayın. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözlere merhem sürün. ince plastik kuruluna pençeleri bantlama bir pozisyonda hayvan hareketsiz.
  2. lateral kuyruk damar içine, PI10 boru üzerinde 20 cm bağlı özel 27 G kateter, koyun ve bant birkaç adet ile yerine sabitleyin.
  3. CT-lipozomların en az 200 ul içeren 1 ml şırınga hazırlayın. kateter temizlemek için kullanma tuzlu su ile 1 ml şırınga hazırlayın. (: 1 hacim itibarı ile oranı 9) Son olarak, tuzlu su ile karıştırılmış serbest iyoheksol en az 150 ul 1 ml şırınga hazırlar.
  4. Mikro-BT tarayıcı yatağı üzerinde yüzüstü fare yerleştirin. tumo yerleştirmek için lazer konumlandırma sistemini kullanınHer tarama için yaklaşık olarak aynı yönde r.
  5. Bir şırınga pompası CT-lipozom şırınga yerleştirin ve şırınga kateter takın. saniyede 10 ul pompa hızını ayarlayın.
  6. CT-tarayıcı konsol yazılımı kullanarak parlak koyu kalibrasyon tarama yaparak sistemi başlatmak. ilgi her görüntüleme protokolü için parlak koyu tarama seçeneği seçin, açılan menüden parlak karanlık seçin ve kalibrasyonu başlatmak için tarama düğmesine basın.
  7. herhangi bir kontrast madde enjeksiyonu öncesinde tümörün bir hacimsel anatomik mikro-CT gerçekleştirin. kilitler temizlendikten CT tarayıcı güvenliğini sağlamak için BT tarayıcısı konsol yazılımı göstergesine bakın. CT tarayıcı konsol seçme taramasında 80 kV, 70 mA tüp akımının bir x-ışını enerjisini seçin ve süresi 16 saniye boyunca 1.000 görüntü projeksiyonları yakalar. tarama işlemini başlatmak için tarama düğmesine basın.
  8. 400 mg iyot kg konsantrasyonunda BT lipozomların bir bolus enjekte şırınga pompası kullanma1. 150 ul (25 g fare varsayılarak) içindeki bir hacim enjekte pompa ayarlayın. enjekte pompada 'start' düğmesine basın. El ile enjekte edilmiştir, tüm madde miktarının sağlanması için (iki kez kateterin hacmi) tuzlu su 50 ul, kateteri ve kateter açıktır.
  9. CT-lipozomların enjeksiyonundan sonra 10 dakika bekleyin ve 3.5'de tarif edilen aynı yöntem ve ayarları kullanarak ikinci bir anatomik tarama yapar.
  10. 3.3'de tarif edilen püskürtme hızı ayarı kullanılarak (hacme göre 1 oranında 9) tuzlu su ile karıştırılmış serbest iyoheksol 100 ul bir hacim enjekte şırınga pompası ayarlayarak bir DCE-CT taraması gerçekleştirmek.
    1. CT-tarayıcı konsol üzerinde bir satın alma her 10 sn ile 80 kV, 90mA bir tüp enerjisinin bir x-ışını enerji ayarını kullanır ve ilk 30 saniye için 416 görüntü projeksiyonları her saniye yakalar ve ardından 5 dakika dinamik tarama seçin . DCE-BT verilerinin 5 saniye yakalamak ve sonra injectio start düğmesine basınn pompası.
    2. DCE-BT'de sonra bir hacimsel anatomik mikro-CT taraması gerçekleştirin.
  11. adımlarda 3.5 tarif edildiği gibi aynı hacimsel BT ayarları kullanarak, BT-lipozom 48 ve 72 saat sonrası enjeksiyon arasındaki anatomik BT görüntüleri yakalayabilir.
  12. GPU rekonstrüksiyon yazılımı kullanarak anatomik BT ve DCE-BT veri yeniden.
    1. yeniden yazılım içine görüntüyü yükleyin. ilgi bölge seçin fareyi kullanarak resmin üzerine bir ROI çizerek yeniden inşa edilmesi. yeniden görüntülü kaydetmek konum ve dosya adı olarak ayarlayın ve '.mat' olarak çıktı dosya türünü seçin.
      NOT: Yazılım otomatik olarak anatomik taramalar için 0.153 x 0.153 x 0.153 mm 3 yeniden voksel boyutunu ayarlamak ve DCE-BT için 0.153 x 0.153 x 0.462 mm 3. 'Yeniden başlatmak' butonuna tıklayın.
  13. hesaplamak için BT-lipozom ön enjeksiyon ve 10 dakika sonrası enjeksiyon taramaları kullanınplazma hacim fraksiyonu olarak daha önce 3 nitelendirdi. Ayrıca, daha önce 7 açıklandığı gibi interstisyel hacim fraksiyonu hesaplamak için ön enjeksiyon ve iyoheksol 5 dk enjeksiyon sonrası taramaları kullanın.
  14. Tümör hacmi içinde faiz (ROI) bir bölgeyi tanımlamak için yeteneği sağlar yazılım içine DCE-CT verilerini alarak zaman yoğunluğunu eğrileri (TIC) edinin. Daha sonra, zamanın bir fonksiyonu olarak ROI ortalama BT donanımı hesaplar. Bu deneyde özel yazılım ROI belirlemek ve TİC hesaplamak için geliştirilmiştir.
  15. Bir iki bölmeli tracer kinetik model kullanılarak ölçülen tikleri takarak perfüzyon ve damar geçirgenliğinin nicel tahminleri elde. Montaj DCE-BT analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilen ve iki bölmeli tracer kinetik model sabit parametre olarak apriori plazma hacim fraksiyonu tahminleri ve interstisyel hacim kesirler kullanabilirsiniz olabilir. plasm apriori tahminlerini elde etmek, daha önce bildirilen yöntemleri kullanına ve interstisyel hacim fraksiyonları 14.

Tümör İnterstisyel Yağ Basıncı 4. Mekansal Ölçümleri

  1. IFP PE20 polietilen boru 50 cm ile basınç dönüştürücü ve IFP toplama sistemine 25 G spinal iğne bağlamak ölçmek için. bir heparin sülfat / tuzlu su solüsyonu (1:10) ile tüm sistemi yıkayın. Kullanmadan önce% 70 izopropil ile iğne sterilize edin.
  2. toplama sistemi açın ve IFP toplama yazılımı başlatmak ve mmHg IFP ölçümleri elde etmek için sistem kalibre etmek ayarları dosyaları yüklemek. sürekli IFP veri toplamak için Al düğmesini tıklatın.
  3. 4.8 tarif edilen metotlar kullanılarak, CT-lipozomların 48 ve 72 saat sonra enjeksiyon ile IFP ölçümleri (bu tümörün, CT-lipozomların en yüksek birikimin yaklaşık zaman karşılık gelir) uygulayın. CT-IFP robot IFP iğne takın.
  4. için koordinat sistemlerini hizalamak için kalibrasyon taramaları gerçekleştirmekCT-IFP robot ve BT tarayıcı. CT-IFP robot referans işaretleyici eki ekleyin ve dört farklı pozisyonlarda referans işaretleyici ile dört hacimsel CT taraması gerçekleştirin.
    1. CT-IFP robot kontrol yazılımı başlatmak robot başlatmak ve x, y, z hedefleyen pozisyonlarına girerek ve 'gitmek' butonuna tıklayarak üç pozisyonlara robotu hareket ettirin.
    2. Aşağıdaki x bir CT taraması atın, y, z koordinatları: (1) 0,0,0; (2) -10,0,0; (3) 0,7,0; ve (4) 0,0,10. 90 kV, 10 mA, 16 tarama başlatmak için CT-tarayıcı yazılımı ve basın 'Başlat' kullanarak sn tarama seçin. 3.10 açıklandığı gibi taramayı yeniden yapılandırma.
  5. CT-IFP robot hizalama yazılımı başlatın. Daha sonra 'açık' tıklayın 'Kayıt Data' Bölgede yüklü 'ekle' butonuna tıklayın ve 4.3 elde edilen dört yeniden kayıt taramaları seçin.
    NOT: referans marker piksel konumu otomatik olarak softwa girilecektiryeniden.
    1. 'Hesapla Transform' düğmesine tıklayın ve ardından 'Transform Uygula' düğmesine tıklayın. Bu CT-IFP robotu koordinat sistemi, CT tarayıcısına göre bir koordinat sistemi dönüştürmek için kullanılacak hizalama verilerini üretir. Kalibrasyon tamamlandıktan sonra, CT-IFP robot hayvan platformu takın.
  6. tıbbi hava ya da oksijen ile karıştırılır% 2 izofluran kullanarak her fare anestezisi ve ayak kısma ve hiçbir tepki gözlemleyerek onaylayın. CT-IFP robot platformu üzerinde hayvanın hareketsiz ve tümör CT-IFP robot sistemi için erişilebilir olacak şekilde fareyi yerleştirin. o IFP iğne yerleştirilmesi sırasında hareket etmez şekilde bant kullanarak tümör hareketsiz.
  7. IFP iğne takmadan önce bir anatomik mikro-CT taraması gerçekleştirin. 3.10 açıklanan adımları kullanarak BT veri yeniden.
  8. CT-IFP robot hizalama yazılımı içine önceden iğne ekleme BT verileri yükleyin. tümör görselleştirmek için pencere ve seviyesini ayarlayın. th tıklayınherhangi bir görüntü tümörün e jant, daha sonra ikinci bir kenar konumu tıklayın.
    NOT: Yazılım iki konum arasında doğrusal bir hat boyunca pozisyonları bir dizi hesaplar. x, y ve z, Not listesinden 5 ila 8 eşit aralıklı konumlarda bir dizi koordinatları.
  9. yerleştirilmeden önce heparin tuzlu su çözeltisi ile iğne yıkayarak IFP sistemini hazırlayın.
  10. CT-IFP robot kontrol yazılımı içine, x, y, z içine ilk önceden belirlenmiş iğne pozisyonları girin ve basın-hamle 'gitmek' düğmesini istenilen konuma robot taşımak için. doku içine iğne eklemek için 'Ekle Needle' düğmesini tıklayın.
    1. IFP ölçüm artar ve IFP toplama yazılımı değerini-kıstırma ön döner belirterek, iğne IFP iğne ve parmakla PE20 boru bırakarak dokusu arasında iyi akışkan iletişimi sağlamak yerleştirdikten sonra. başlangıca dönmek yok ölçümleri Reddet.
  11. edinme birtakılı iğne ile anatomik CT taraması, daha sonra dokudan iğne geri çekmek için CT-IFP robot kontrol yazılımı üzerinde 'Geri Çekme Needle' düğmesine tıklayın. IFP değeri iğne çekilmesinden sonra ön iğne ekleme değere dönmez herhangi IFP ölçümleri reddet. Bu iğne, ölçüm sırasında tıkanmış olabilir gösterir. Yineleyin 4.8 Her iğne pozisyonu için 4.10 için yineleyin.
  12. İğnenin sonrası ekleme hacimsel BT tanımlandığı gibi tümör hacminin kütle merkezine iğne giriş nisbetle X, Y ve Z konumları hesaplayarak tümör hacmi içinde iğne konumunu belirler.
  13. Tüm ölçümler tamamlandıktan sonra kafes hayvanları dönün. sahipsiz hayvanları bırakın ve bilinç kazanmış ve sternum yatma korumak mümkün olmuştur kadar onları gözlemlemek için özen etmeyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Söz konusu protokol, sırasıyla 91,8 ± 0,3 nm ve -45,5 ± 2,5 mV, iyoheksol kapsüllü bir konsantrasyon ile CT-lipozomlar elde lipozom çapı ve 55 mg ml -1 zeta potansiyelini demek gerekir. Şekil 1a temsilcisi DCE-BT görüntüleme içerir sonuçlar, iyoheksol intra-tümöral birikimi zamansal değişiklikleri gösterir hacimsel veri zaman serisi elde edilmiştir. Tümör içinde bir ROI seçilmesi perfüzyon, damar geçirgenliği, plazma hacim fraksiyonu ve interstisyel hacim fraksiyonu (Şekil 1b) tahminlerini elde etmek izleyici kinetik modelleme yöntemlerini kullanarak ölçülebilir bir TİC verir. Matlab 14 uygulanan bir doğrusal olmayan eğri uydurma kullanılarak rutin Bu çalışmada, bir iki bölmeli iz kinetik model kullanıldı ve ölçülen TIC uyum sağlar. eşit büyüklükte çoklu ilgi tümör hacmine bölümlere ayırmak, t ölçülmesini sağlarO tümör hacminin (Şekil 1c) içinde hemodinamik parametreler dağılımını mekansal. Segmentasyon zaman alıcı ve zor olan, ya elle yapılabilir, ya da otomatik olarak küresel koordinat sistemi kullanarak birden fazla eşit büyüklükte ROI'lardaki tümör bölen bir algoritma kullanarak burada gerçekleştirildiği şekilde. DCE-BT yöntemleri perfüzyon, damar geçirgenliği, plazma hacim fraksiyonu ve interstisyel hacim fraksiyonu mekansal dağılımının kantitatif tahminler. Bu parametreler, merkezi tümör hacmine kıyasla çevresi boyunca perfüzyon, plazma ve geçiş kesrinin yüksek seviyeleri ile uzaysal olarak heterojen olduğu gözlenmiştir.

Hacimsel BT görüntüleme yöntemi biodistribution ve BT-lipozomlar intra-tümöral dağılımını ortaya koymaktadır. 2a 48 saat sonrası enjeksiyon de BT-lipozom biodistribution göstermektedir. ajan hala th dolaşandalak ve karaciğer gözlenen esaslı şekilde alımının e vasküler sistem. Tümör hacmi içinde parlak bölgeler ile temsil etmek üzere, CT-lipozomların intra-tümöral birikimi, merkeze göre ağırlıklı olarak periferik birikimi ile heterojen olduğu gözlenmiştir (Şekil 2b).

Volumetrik BT görüntüleme IFP ölçümlerinin yeri CT-IFP robot kurulumu kullanarak yapılan izlemek için kullanılabilir. Şekil 3a tümör hacmi içindeki IFP iğne yerleşimi gösterir yüksek çözünürlüklü mikro-BT kullanılarak görüntülendi olarak. İğne net tümör hacmi içindeki IFP ölçümlerinin uzaysal lokalizasyonu sağlayan tümör hacminin içinde tespit edilebilir (Şekil 3b). Tümör hacmi içinde birden IFP ölçümler yaparak tümörün boyunca IFP bir mekansal harita üretmek mümkündür. mekansal IFP daha sonra karşılık gelen ölçümler ile korele edilebilirTümör mikrosirkülasyonun ve BT-lipozom birikimi.

Volumetrik BT görüntüleme BT-lipozom birikimi mekansal birlikte lokalize ölçümlerin bir örnek verir mümkün, IFP ve BT-lipozom birikimi. Hemodinamik ölçümleri birlikte lokalize Şekil 4'e yapım ortak bir referans çerçevesi sağlar, IFP, perfüzyon, vasküler geçirgenlik, plazma hacim oranı ve interstisyel hacim fraksiyonu. O perfüzyon gözlendi ve plazma hacim fraksiyonu anlamlı derialtı MDA-MB-231 tümörlerinde BT-lipozom intra-tümöral birikimi ile korelasyon. Ayrıca, IFP radyal dağılımı hemodinamik ölçümlerle korelasyon. Bu sonuçlar, karmaşık bir uzay-zamansal ilişki tümör mikrosirkülasyonun, IFP ve lipozomlar 14 intra-tümöral birikimi arasında var düşündürmektedir.

Şekil 1 Şekil 1: Tümör Mikrosirkülasyon DCE BT görüntüleme, zamanın bir fonksiyonu olarak kontrast ajanı kinetiklerini gösteren tümör hacminin içinde toplanan zamansal BT görüntüleri, (a) bir Örnek serisi.. Kırmızı kontur zaman yoğunluk eğrisi (TIC) ölçüldüğü bir ROI temsil eder. (B) TIC ROI içinde hemodinamik parametrelerin niceliksel tahminler elde etmek için bir iki bölmeli tracer kinetik model kullanılarak seçimdir. (C) tümör kantitatif hemodinamik parametrelerin Temsilcisi mekansal dağılımı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Liposome akümülatö Hacimsel CT-Görüntüleme tirme. (a) CT-lipozomlar biodistribution gösteren temsili bir 3D hacim görüntü render. (B) Temsilci eksenel, koronal ve 48 saat sonrası enjeksiyon de BT-lipozom intra-tümöral birikimini gösteren tümör merkezi aracılığıyla çekilen sagital dilimleri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3:. Görüntü Eşliğinde IFP Ölçümleri (a) CT-lipozomlar (turuncu) 48 saat sonrası enjeksiyon bir deri altı tümör içine CT-IFP robot sistemi (yeşil) sonrası iğne yerleştirilmesi temsili bir 3D hacim görüntü render. (B) sonrası iğne yerleştirilmesi bir temsilcisi BT görüntüsü./54226/54226fig3large.jpg "Target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4:. Tümör Mikrosirkülasyon, IFP ve BT-lipozom birikim Co-lokalize Ölçümler Panel CT-lipozom birikimi alınan 48 saat enjeksiyon sonrası, IFP, perfüzyon, vasküler geçirgenlik, plazma hacim fraksiyonu temsili mekansal ko-yerelleştirme gösteren ve interstisyel hacim fraksiyonu. Yeniden baskı 14 izni ile. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada sunulan görüntü tabanlı ölçme yöntemleri tümör mikrosirkülasyon özellikleri, IFP ve BT-lipozom birikiminin mekansal dağılımı tespitine imkan. Bu özellikleri ilişkilendirmek önceki girişimler, birden fazla tümör taşıyan hayvanlar üzerinden dökme ölçümler dayanıyordu ve bu nedenle yaygın olarak nano-boyutlu ilaç verme sistemleri 15 gözlenmiştir intra-tümöral birikiminde heterojenite mekanizmasını açıklamak duyarlılık eksikliği olan. DCE-BT tümör mikrosirkülasyonun özelliklerinde intra-tümöral varyasyonları ölçmek için bir araç sağlar, hacimsel CT CT-lipozom birikimi kinetiği doğru bir tasviri sağlar ve BT-IFP robot sistemi IFP mekansal haritalama gerçekleştirmek için bir araç sağlar aynı hayvan. Ayrıca, DCE-BT görüntüleme Bu çalışmada potansiyel klinik transl bulguları, klinik ortamda tümör hemodinamiği ölçme yapmak için bir klinik onaylı bir yöntemdirbir masa.

ölçümlerin karmaşıklığı göz önüne alındığında, sağlam veri kümelerinin toplanmasını sağlamak için birkaç kritik faktörler vardır. Tümör mikrodolaşımında DCE-BT tabanlı miktar tümör hemodinamik doğru tahminler sağlamak için tartışmasız en zordur. Bu gürültü oranları (SNR) yüksek sinyal ile tikleri elde edilmesi ve tikleri 16,17 ölçmek için sağlam bir uydurma algoritması kullanan gerektirir. Tikler Görsel inceleme analizinden düşük SNR verileri kaldırmak için de kullanılabilir. Dikkatli değilse Ayrıca, daha sonra yüksek SNR tikler uydurma da tümör perfüzyon, damar geçirgenliği, plazma hacim fraksiyonu ve interstisyel hacim fraksiyonu 16 hatalı tahminlere yol açabilir. miktar doğruluğu en üst düzeye çıkarmak için bir strateji sonradan ölçülen tikler model uyum boyunca sabit parametreler olarak kullanılan plazma ve interstisyel hacim fraksiyonları modeli bağımsız tahminleri elde etmek kullanılmıştır. Bu methodTümör perfüzyon ve damar geçirgenliğinin sağlam tahminler 15 elde edilmesini sağlar.

CT-lipozomların intra-tümöral dağılımının Sağlam analiz maddesinin yeterli birikimi sonra hacimsel BT görüntüleme gerçekleştirmek gerekir. Önceki çalışmalardan, CT-lipozom zirve tümör birikimi fare ksenogreftlerinde 3,15 48 saat 72 arasında oluşur. Ayrıca doğrusal bir ilişki CT-lipozomlar 15 intra-tümöral birikim değişimlerin basit ölçümü için izin BT görüntülemede BT-lipozom konsantrasyonu ve kontrast arasında var.

iğne tabanlı yöntem kullanılarak IFP hassas ölçümler kateter ve doku arasındaki iyi sıvı iletişimini gerektirir. Ayrıca, aksi IFP minimal mekansal farklılıklar olacak, yüksek santral tümör IFP (> 5 ila 10 mmHg) tek kullanım tümörler için önemlidir. CT-IFP soymak kullanarak IFP Mekansal ölçümleriot yüzünden iğne yerleştirilmesi neden olduğu doku harekete zor systemcan. Görüntüleme öncesi ve sonrası iğne yerleştirme doğru iğne yerleşiminin belirlenmesi için çok önemlidir; Ancak, bunun nedeni ölçümler arasındaki doku çözgü sonra iğne yerleşimler arasındaki konumunu ilişkilendirmek zor olabilir. Bu iğne yerleştirilmesi sırasında önemli doku deformasyonu o rastgele seçerek iğne pozisyonları sonuçları bulunmuştur. Bunun bir sonucu olarak, bu yöntem, IFP en doğru mekansal eşleme sağladı. Tersine, tümör hacminin karşısında bir doğrusal parça boyunca ölçümler ve IFP ölçümlerinin uzaysal doğruluğunu artırabilir parçaya teğet iğne takmadan. izlemek için teğet iğne takma ölçüm parça doğrultusu boyunca doku deformasyon etkilerini en aza indirir.

Bu çalışma, bireysel tümör tümör mikrosirkülasyon, IFP ve BT-lipozom birikiminin mekansal dağılımını ölçmek için yeteneğini göstermiştir. Bu teknikleri mastering sonra, tümör mikro ve ilaç dağıtım üzerindeki etkilerini karakterize etmek bağımsız olarak ya da birlikte bu ölçümler yapmak mümkündür. MDA-MB-231 göğüs ksenograft modelinde, bu yöntemler kullanılarak perfüzyon ve plazma hacmi fraksiyonu lipozomlar 14 intra-tümöral dağıtım güçlü medyatörleri olduğunu ortaya koymuştur. IFP ve lipozom dağılımı arasında güçlü bir ilişki olduğu bulunmamıştır. Ancak, IFP şiddetle IFP kan akımının modülasyonu yoluyla lipozom dağıtımı aracılık dolaylı bir rol oynayabileceğini düşündüren, tümör perfüzyon ölçümleri korelasyon saptandı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDA-MB-231 metastatic breast adenocarcinoma tumor cells  ATCC HTB-26
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)  Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F1051
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x Solution GE Healthcare Life Sciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300-054
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Lipids Inc., USA 850355P
Cholesterol (CH) Avanti Lipids Inc., USA 700000P
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-poly(ethylene glycol) 2000 (DSPE-PEG2000) Avanti Lipids Inc., USA 880128P
Omnipaque (Iohexol) 300 mg of iodine/ml  GE Healthcare, CA
80 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes Whatman Inc., USA
200 nm pore size Track-Etch polycarbonate membranes Whatman Inc., USA
10 m Lipex Extruder  Nothern Lipids Inc, CA
Dialysis Bag Molecular Weight Cut Off (MWCO) of 8 kDa Spectrum Labs, USA 
750,000 Nomical Molecular Weight Cut Off (NMWC) Tangential flow column  MidGee ultrafiltration cartridge, GE Healthcare, CA
Peristaltic pump  Watson Marlow Inc., USA
UV spectrometer Helios γ, Spectronic Unicam,  USA
90Plus particle size analyzer  Brookhaven, Holtsville, USA
eXplore Locus Ultra micro-CT system  GE Healthcare, CA Manipulated using CT-Console Software
AxRecon GPU-based Reconstruction  Acceleware Corp. CA
27 G Catheter SURFLO Winged Infusion Set Terumo Medical Products, USA SV*27EL
PE20 polyethylyne tubing Becton Dickinson, USA 427406
Pen tip 25 G × 3.5′′ Whitacre spinal needle  Becton Dickinson, USA 405140 IFP needle
P23XL  pressure transducer  Harvard Apparatus, CA P23XL
PowerLab 4/35, Bridge Amp, with LabChart Pro 7.0 ADInstruments Pty Ltd., USA PL3504, FE221 IFP acquisition system and acquisition software
CT-Sabre Small Animall Intervention system (CT-IFP Robot) Parallax Innovations, CA Manipulated using CT-IFP robot Control Software
CT-IFP robot alignment software Custom Matlab software
DCE-CT Analysis Software Custom Matlab software
Matlab 2013b Mathworks, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seo, J. W., Zhang, H., Kukis, D. L., Meares, C. F., Ferrara, K. W. A novel method to label preformed liposomes with 64Cu for positron emission tomography (PET) imaging. Bioconjugate chemistry. 19, (12), 2577-2584 (2008).
  2. Huang, H., Dunne, M., Lo, J., Jaffray, D., Allen, C. Comparison of Computed Tomography- and Optical Image-Based Assessment of Liposome Distribution. Molecular Imaging. 12, (3), 148-160 (2013).
  3. Stapleton, S., et al. A mathematical model of the enhanced permeability and retention effect for liposome transport in solid tumors. PloS one. 8, (12), e81157 (2013).
  4. Zheng, J., et al. A multimodal nano agent for image-guided cancer surgery. Biomaterials. 67, 160-168 (2015).
  5. Zheng, J., Liu, J., Dunne, M., Jaffray, D. A., Allen, C. In vivo performance of a liposomal vascular contrast agent for CT and MR-based image guidance applications. Pharmaceutical research. 24, (6), 1193-1201 (2007).
  6. Harrington, K. J., et al. Effective targeting of solid tumors in patients with locally advanced cancers by radiolabeled pegylated liposomes. Clinical Cancer Research. 7, (2), 243-254 (2001).
  7. Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes. J Control Release. 172, (1), 351-357 (2013).
  8. Lammers, T., Kiessling, F., Hennink, W. E., Storm, G. Nanotheranostics and image-guided drug delivery: current concepts and future directions. Mol. Pharm. 7, 1899-1912 (2010).
  9. Stapleton, S., Milosevic, M. F. Cancer Targeted Drug Delivery. Springer. 241-272 (2013).
  10. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature biotechnology. 33, (9), 941-951 (2015).
  11. Heldin, C. H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 4, (10), 806-813 (2004).
  12. Chauhan, V. P., Stylianopoulos, T., Boucher, Y., Jain, R. K. Delivery of molecular and nanoscale medicine to tumors: transport barriers and strategies. Annual review of chemical and biomolecular engineering. 2, 281-298 (2011).
  13. Bax, J. S., et al. 3D image-guided robotic needle positioning system for small animal interventions. Medical physics. 40, (1), 011909 (2013).
  14. Stapleton, S., Milosevic, M., Tannock, I. F., Allen, C., Jaffray, D. A. The intra-tumoral relationship between microcirculation, interstitial fluid pressure and liposome accumulation. Journal of Controlled Release. 211, 163-170 (2015).
  15. Stapleton, S., Allen, C., Pintilie, M., Jaffray, D. A. Tumor perfusion imaging predicts the intra-tumoral accumulation of liposomes. J Control Release. 172, (1), 351-357 (2013).
  16. Brix, G., Zwick, S., Kiessling, F., Griebel, J. Pharmacokinetic analysis of tissue microcirculation using nested models: multimodel inference and parameter identifiability. Medical physics. 36, (7), 2923-2933 (2009).
  17. Brix, G., Griebel, J., Kiessling, F., Wenz, F. Tracer kinetic modelling of tumour angiogenesis based on dynamic contrast-enhanced CT and MRI measurements. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 37, (1), 30-51 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics