Purificação de Native Complexos de estudo estrutural usando um método Tag Tandem Affinity

Biology

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van der Feltz, C., Pomeranz Krummel, D. Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method. J. Vis. Exp. (113), e54389, doi:10.3791/54389 (2016).

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Abstract

abordagens de purificação por afinidade foram bem sucedidos em isolar complexos nativas para a caracterização proteômica. heterogeneidade estrutural e um grau de heterogeneidade de composição de um complexo não costumam impedir o progresso na realização de tais estudos. Em contraste, um complexo destinado a caracterização estrutural deve ser purificado num estado que é tanto em termos de composição e estruturalmente homogénea, bem como a uma concentração mais elevada do que o necessário para proteómica. Recentemente, tem havido avanços significativos na aplicação da microscopia de electrões para a determinação da estrutura de grandes complexos macromoleculares. Isso tem aumentado o interesse em abordagens para purificar complexos nativas de qualidade e quantidade suficiente para a determinação estrutural por microscopia eletrônica. O método Tandem Affinity Purification (TAP) foi otimizado para extrair e purificar a 18 subunidade, ~ 0,8 Mda montagem ribonucleoprote�a a partir de levedura de brotamento (Saccharomyces cerevisiae)

Introduction

Muitos processos celulares importantes são realizadas por grandes complexos de proteínas e de ARN-proteína 1. Um gargalo significativo para a realização de estudos biofísicos e estruturais destes complexos é a sua obtenção de uma qualidade adequada (isto é, a homogeneidade) e numa concentração adequada. Isolamento de um complexo a partir de uma fonte nativa tem muitas vantagens, incluindo a retenção de modificações pós-transcricionais e / ou traducionais relevantes de subunidades e segurar a montagem complexa adequada. No entanto, grandes complexos celulares estão frequentemente presentes em uma célula de um número de cópias baixo e a purificação deve ser altamente eficiente e ocorrem sob condições fisiológicas próximo para assegurar a integridade do complexo é mantido. Purificando um complexo de uma fonte eucariótica é particularmente desafiador e pode ser financeiramente proibitivo. Assim, as estratégias ou métodos que sejam eficientes e produzem um complexo homogênea são altamente desejado.

Uma estratégia que tem sidosucesso na purificação complexos nativos de células eucarióticas para sua caracterização inicial é o Tandem Affinity Purification (TAP) Método 2,3. O método TAP foi inicialmente concebido para purificar a proteína nativa a partir da levedura de brotamento (S. cerevisiae) em complexo com a interação dos fatores (s) 2. O método utilizado TAP duas etiquetas, cada etiqueta fundidos em conjunto para a mesma sequência do gene que codifica a proteína. As etiquetas foram seleccionados de forma a equilibrar a necessidade de apertado e selectiva de ligação a uma resina de afinidade com um desejo de manter perto de condições de solução fisiológica. Este equilíbrio serve para preservar a interação estável (s) da proteína marcada com a interação dos fatores (s) para a caracterização pós-purificação. A etiqueta TAP genomicamente incorporada foi colocada na extremidade (C-terminal) de um gene de codificação da proteína e consistia de uma sequência de codificação para um Calmodulin Binding Peptide (CBP) seguido de Proteína A - uma adição de pouco mais de 20 kDa ao etiquetado proteína. CBP é curto, 26 aminoácidos, e reconhecido pela ~ 17 kDa de proteína calmodulina (CaM), na presença de cálcio com um K D na ordem de 10 -9 M 4. A Proteína A etiqueta é maior, que consiste de duas repetições de 58 resíduos com um curto ligante entre as repetições. Cada repetição ácido amino 58 é reconhecido pela imunoglobulina G (IgG) com um K D ~ 10 -8 M 5. Entre estas duas etiquetas foi incorporado um local de reconhecimento para a protease de TEV, uma endopeptidase do Vírus do tabaco Etch 6,7. Tal como ilustrado na Figura 1, no primeiro passo de afinidade do método da TAP etiquetado proteína é ligado a uma resina de IgG através da Proteína A. A proteína é eluída com etiquetas por clivagem em coluna após a adição de protease de TEV, Site-especificamente a clivagem entre as duas marcas. Este é um passo necessário como a interacção de IgG e proteína A é muito forte e pode apenas ser adequadamente perturbado sob condições desnaturantes solução. Na falta de um Protein uma etiqueta, a proteína está ligada a resina CaM na presença de cálcio e eluído a partir desta resina com a adição de EGTA quelante de iões metálicos (ácido tetracético de etileno-glicol) (Figura 1).

Logo após a introdução do método da TAP, que foi utilizado num estudo em larga escala para gerar um "mapa" de interacções complexas em S. cerevisiae 8. É importante notar, como uma consequência deste esforço uma biblioteca inteira Quadro levedura-TAP Tagged de leitura aberta (ORF), bem como a TAP indivíduo com etiquetas ORFs 9 estão disponíveis a partir de uma fonte comercial. Assim, pode-se obter qualquer cepa de levedura com uma proteína marcadas para qualquer complexo levedura. O método TAP também estimulou modificações ou variações da etiqueta TAP, incluindo: a sua utilização para a purificação de complexos de outros eucariotas, bem como as células bacterianas 10,11; a criação de uma "tag dividido", em que a proteína A e PFC são colocados em diferentes proteínas 12; eo taGS alterado, de modo a acomodar a necessidade do investigador, tais como a sensibilidade do complexo de Ca 2+ ou de EGTA 13.

Recentes avanços em ambos instrumentação e metodologia levaram a avanços significativos na aplicação de microscopia eletrônica (EM) para determinação da estrutura, que levaram à alta, perto imagens de resolução atômicas de complexos macromoleculares 14. A resolução de um complexo obtido por EM, no entanto, permanece depende da qualidade do complexo em estudo. Este estudo utilizou a abordagem tag TAP para purificar de S. cerevisiae U1 snRNP, um baixo número de cópias do complexo ribonucleoproteico 18 da subunidade (~ 0,8 MDA) que faz parte do spliceossoma 15,16. Um número de passos foram tomados para purificar este complexo de tal forma que é homogénea e de uma concentração adequada. Os potenciais problemas encontrados em várias fases da purificação são descritos e estratégias para superar feita challEnges destaque. Com cuidado avaliar e optimizar etapas na purificação, o U1 snRNP purificado é de uma qualidade e em quantidade adequada para coloração negativa e eletrônica crio microscopia (crio-EM) estudos. Um método TAP protocolo optimizado para a purificação de complexos de nativas para estudos estruturais é aqui descrito.

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Protocol

Nota: O seguinte protocolo foi concebido para a purificação de um complexo a partir de 4 L de cultura de células, aproximadamente 40 g de peso molhado de células. Uma vez preparada, todos os tampões devem ser armazenadas a 4 ° C e utilizadas dentro de um mês da sua preparação. Redutores inibidores de protease e agente são apenas adicionados aos buffers imediatamente antes da utilização.

1. Preparação do extracto celular total para purificação de afinidade em tandem

  1. Crescimento de S. células cerevisiae
    1. Streak a TAP desejado marcado S. cerevisiae do armazenamento (-80 ° C) em uma dextrose de levedura peptona (YPD) placa. Incubar durante 3 - 5 dias (30 ° C), até que as células fúngicas aparecem em branco e fofo.
    2. Inocular uma sequência de cerca de 2 mm 2 das células frescas de placa em 10 ml de meio YPD em um tubo de centrífuga de 50 ml de polipropileno cónico. Agitar o tubo a 180 revoluções por minuto (rpm) durante a noite (30m ° C).
    3. Inocular 2 ml da sobrecultura noite, por litro de meio YPD em um L Erlenmeyer 2 ou frasco cónico. Agitar a 180 rpm (30 ° C). Monitorizar o crescimento celular a uma densidade óptica de 600 nm (OD 600) até a fase log tardia, OD 600 entre 1,8 e 2, tipicamente 20-24 horas.
  2. Colheita S. células cerevisiae
    1. Células colheita por centrifugação a 5400 xg durante 15 minutos (4 ° C).
    2. decantar o sobrenadante rapidamente e manter as células a 4 ° C ou sobre gelo.
    3. Suspender cada litro de pelete de células com 2 ml refrigeradas tampão de lise (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 300 mM; KCl 10 mM; EDTA 0,2 mM, pH 8,0; imidazole 5 mM, pH 8,0; 10% de glicerol; 0,1% v de NP-40 / v). Suspender as células por agitação e / ou de repetição pipetagem usando uma pipeta de 10 ml sorológica.
      Nota: A importância de NP-40 no que se refere à qualidade do complexo e a análise pós-purificação é discutido abaixo.
    4. Transferir a suspensão de células para um vazio de 50 ml de polipropileno cónico tubo de centrífuga KEPT no gelo. Lava-se cada frasco de centrífuga com um adicional de 2 ml de tampão de lise arrefecida e adicionar a suspensão de células no tubo de 50 ml.
    5. Determinar o peso húmido do sedimento celular por pesagem do tubo e subtraindo o peso do tubo vazio, bem como o tampão de lise adicionado.
      Nota: Um litro de cultura de células tendo uma densidade óptica de 1,8 a 600 é de aproximadamente 10 g.
    6. Criar um banho de azoto líquido num tubo de centrífuga de 50 ml de polipropileno cónico. Desenhar células em suspensão em uma seringa de 5 ml. Conectar uma agulha G 16 da seringa. Congelar a suspensão de células por passagem através de seringa / agulha para gerar células de "gotículas". Velocidade de congelação deve ser de aproximadamente 1 min / mL.
    7. Armazenar gotículas de células congeladas (-80 ° C) ou proceder à lise.
  3. Lise Células e Lysate Esclarecimento
    1. Lyse as células de levedura usando um moedor de café. células Lyse oito a nove vezes com 25 segundos de moagem rajadas, agitando o cmoedor offee. Antes de usar, pré-resfriar o moedor de café com nitrogênio líquido. De dois em dois ciclos de moagem, adicionar uma camada superficial de azoto líquido para o moinho e permitir que ela se evapore.
    2. Mexa com uma espátula de nitrogênio líquido refrigerado como necessário para manter as células de aglomeração. Tome cuidado para evitar o descongelamento das células, o que pode resultar em agregação celular. As células devem aparecer como um pó branco fino após a lise. Uma pelete de células máximo de 4 L de cultura de levedura (~ 40 g) pode ser moído de cada vez.
      Nota: Observações sobre método de lise são discutidas abaixo.
    3. Avaliar o grau de lise de células utilizando um hemocitómetro ou método de contagem celular alternativa. Para fornecer uma análise adequada, tomar as seguintes amostras: (1) antes de lise; (2) após quatro rondas de lise; e (3) após a lise. Para verificar essas amostras, tomar uma pequena quantidade de células com um nitrogênio espátula refrigerados líquido e coloque em um tubo de 1,5 ml.
    4. Uma vez que as células são descongeladas, de pipeta 5 ul de célulase misturar com 495 ul de água. Se 40 - é observada 60% de lise de células, avance para o próximo passo no protocolo.
      Nota: Observações relativas efeito de longos períodos de lise são discutidos abaixo.
    5. Uma vez lise adequada é observada, loja lisadas células (-80 ° C) ou prosseguir para a próxima etapa.
    6. Preparar dois tubos de 50 ml de centrífuga de polipropileno cónico de 15 ml, cada um com um tampão de lise, incluindo 1 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF), 1 mM de ditiotreitol (DTT), e um cocktail comercialmente disponíveis de inibidores de protease.
      Nota: Se a proteólise é observada significativa, considerar o uso de uma estirpe deficiente em protease.
    7. Use uma espátula de nitrogênio líquido refrigerado para colher o pó de células lisadas congelada nos preparados tubos de 50 ml. Adicionar o pó celular / sólido incrementalmente ao tampão de lise, contendo tanto um redutor e inibidor (es) da protease.
    8. Rodar os tubos de 50 ml suavemente à TA, a fim de descongelar / dissolver as células, mas também para evitar a formação de bolhas. UMAé o pó celular / sólido dissolve-se, adicione célula adicional sólido / pó.
    9. Encher cada um dos dois tubos de 50 ml até que cada um tem aproximadamente 20 g de células ou todas as células adicionadas. Continuar a descongelação / dissolve-se até que não existam aglomerados de células congeladas observadas nos tubos de 50 ml. Isso deve levar cerca de 50 min.
    10. Centrifuga-se o ligado de células em suspensão durante 20 minutos a 25000 xg (4 ° C). Bem células lisadas podem apresentar uma pequena quantidade de precipitado negro.
    11. Transferir os 50 ml de sobrenadante para policarbonato tubos ultra-centrifugação (26,3 ml tubos usados) e adicionar 10 ul PMSF 200 mM a cada tubo cheio.
    12. Centrifugar durante 1 h a 100000 xg (4 ° C). Quatro camadas deve ser visível, de baixo para cima: (1) um sedimento duro clara, contendo complexos ribossomais; (2) um sedimento macio ricos em lípidos; (3) uma grande camada amarelo-clara tingido contendo a maioria de proteínas e complexos solúveis da célula; e (4) uma camada de topo 'escamosa' que consiste em lípidos.
    13. Executar todas as spassos ubsequent em uma sala fria (4 ° C). Remover o máximo da camada lipídica topo 'escamosa "quanto possível, utilizando uma pipeta de 1 mL e rejeitar. Usar uma pipeta de 10 ml serológico para recuperar a maior parte da camada amarelo, claro.
    14. Recuperar os últimos ml desta camada usando uma pipeta de 1 ml para evitar perturbar as duas camadas inferiores. A partir de 40 g de sedimento celular húmido, cerca de 48 ml da camada do meio é tipicamente recuperado e 8 ml de camada lipídica removido / descartado.
      Nota: A purificação em coluna de fluxo é muito dificultado pela presença de lípidos, que também pode reduzir a qualidade do complexo, discutido abaixo.

2. Coluna etapa de purificação 1: IgG Cromatografia

  1. Resina de Equilíbrio e encadernação
    1. Prepare um 300 ml IgG Sepharose suspensão por 40 g de sedimento celular. Cortar a extremidade de uma pipeta de 1 ml de ponta para facilitar a pipetagem da lama. Lavagem / equilibrar a resina de IgG três vezes, cada vez com 5 ml IgGD150 BuffeR (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl a 150 mM; MgCl2 1 mM; imidazole 5 mM, pH 8; 0,1% v / v de NP-40; 1 mM de DTT; um comprimido de inibidor de protease por 50 ml de volume).
      1. Centrifugação para sedimentar a 160 xg (4 ° C) entre as lavagens e remover o sobrenadante.
    2. Girar a resina de IgG com o sobrenadante da fase de meio e dois comprimidos de inibidor de protease de mini por 40 g de células, utilizando um rotor adequado, durante 2 h (4 ° C). Esta é a solução do lote de IgG.
    3. Prepare duas colunas de 10 ml de poli-prep para utilização, cortando a extremidade da coluna para produzir um corte plano. Para acelerar a embalagem e lavagem da coluna de fluxo por gravidade, carregar um máximo de 200 ul de IgG de resina embalada ou ~ 25 ml da solução de lote de IgG por 10 ml de coluna.
    4. Verter a solução do lote de IgG à coluna e permitir a sedimentar por gravidade. Se a sedimentação demora mais do que 30 minutos, não mais provável era a contaminação lipídica ao recuperar a fase intermédia do centrifugador tUBEs.
    5. Lava-se a coluna empacotada com quatro sucessivos volumes de 10 ml de Tampão IgGD150.
  2. Por clivagem de TEV Coluna
    1. Selar o fundo da coluna e adicionar 1 ml de tampão IgGD150 e 100 ul de protease de TEV (0,6 mg / ml, variante mutante S219V de TEV produzido internamente). Fecha-se o topo da coluna e mistura-se durante 20 min (18 ° C) usando um misturador térmico, agitando a 750 rpm. Ressuspender a resina e misturar outra vez durante 20 minutos, repetir uma vez mais para um total de 1 hora de incubação.
      Nota: É crítico para manter o tempo de incubação para um mínimo.
    2. Retorno da coluna a 4 ° C e elui-se a proteína / complexo por gravidade. Eluir o volume morto com um adicional de 200 mL de tampão IgGD150.

3. coluna de purificação Passo 2: Cromatografia de Afinidade A calmodulina

  1. Resina de Equilíbrio e encadernação
    1. Preparar 200 ul de resina de afinidade com calmodulina por 40 g de célulassedimentar. Lava-se a resina três vezes, cada vez com 5 mL de calmodulina Tampão de Ligação (Tris 10 mM-HCl, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; MgCl2 1 mM; imidazole 5 mM, pH 8; 2 mM de CaCl2; 0,1 % v / v de NP-40; 10 mM β-mercaptoetanol), centrifugação a 160 xg (4 ° C) para sedimentar para cada lavagem.
    2. Para cada 1 ml de eluato IgG, adicionar 3 volumes de calmodulina tampão de ligação. Para manter constante o nível de cálcio, adicionar CaCl2 e β-mercaptoetanol para explicar a falta destes componentes na eluição de IgG. As concentrações finais devem ser CaCl2 2 mM e mM β-mercaptoetanol 10.
    3. Adicionar a amostra para a resina de calmodulina e ligam-se durante 1 hora (4 ° C) usando um rotor tubo.
  2. Embalagens e eluição, da calmodulina Resina
    1. Prepara-se uma coluna de 2 ml de poli-prep por 100 ul de suspensão de calmodulina, cortando a extremidade da coluna para criar uma abertura plana. Carregue não mais do que 100 � calmodulina suspensão por column para minimizar a quantidade de resina a amostra entra em contacto durante a eluição com.
    2. Encher a coluna pela força da gravidade e lava-se a resina na coluna três vezes com 5 mL de calmodulina Binding Buffer.
    3. Elui-se a proteína com a adição de 200 uL calmodulina eluição tampão (Tris-HCl a 10, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; MgCl2 1 mM; imidazole 5 mM, pH 8,0; EGTA 4 mM, pH 8,0; 0,08% v / v de NP-40; 10 mM β-mercaptoetanol). Repita seis vezes a adição de 200 ul de tampão de eluição A calmodulina.
    4. Para eluições 1 a 3, aplicam-se o volume para a coluna e recolher o eluato imediatamente. Para a eluição 4, vedar a parte inferior da coluna e incuba-se com tampão de eluição durante 2,5 min e, em seguida, desselar e deixa-se eluir por gravidade. Para a eluição 5, incubar durante 5 min e, em seguida, desselar e eluir. Para a eluição 6, incubar durante 10 minutos e, em seguida, desselar e eluir.
      Nota: A integridade do complexo pode variar entre elui�es / frações (ver secção resultados representante) <./ Li>
    5. Dialisar eluições 2 a 6 individualmente durante a noite utilizando um método de diálise micro apropriado. Dialisar as fracções contra tampão de diálise (Tris-HCl a 10, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; MgCl2 1 mM; imidazole 5 mM, pH 8; 10 mM β-mercaptoetanol).
      Nota: O NP-40 não passam sensivelmente, se de todo, através da membrana de diálise.

4. As análises pós-purificação para avaliar a qualidade do Complexo

  1. Native Gel e prata Coloração
    1. Prepara-se uma 4 - gel nativo prefabricados de 16% para análise do complexo de acordo com as instruções do fabricante. Usar um padrão de proteína de peso molecular apropriado e de carga de 15 ul de cada uma das fracções de calmodulina de eluição / dialisadas no gel.
    2. Electroforese o gel a 150 V durante cerca de 3 h (4 ° C).
    3. Silver Stain o gel para avaliar a qualidade de cada uma das seis eluições. Como alternativa, use comercial igualmente sensíveismancha fluorescente (s). Nesta fase, a concentração do complexo é muito provavelmente abaixo do nível de detecção por coloração com azul de Coomassie.
  2. Métodos de análise adicional do gel
    1. Para detectar a proteína por transferência de Western, resolver o complexo de SDS ou por PAGE nativa e, em seguida sondar o gel para o epitopo calmodulina Binding Peptide (CBP), utilizando um anticorpo etiqueta TAP de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Usando um corante fluorescente específico (s), confirmar a presença e a integridade de proteínas e / ou ácido nucleico num complexo da torneira purificada. Tome cuidado para que nenhuma sobreposição espectral é detectada entre estas manchas.
  3. Negativo Visualization Stain Electron Microscopy
    1. Use grades de carbono contínuas glow-descarregada a -15 mA durante 30 segundos, no prazo de 30 min de aplicação complexa.
    2. Aplicar 3 ul de TAP complexo purificado (tipicamente a uma concentração de 1 nM) a grade. Incubar durante um minuto. blot fROM O lado da rede para remover o excesso de tampão.
    3. Lavar duas vezes com 20 gotas de ua desionizada. blot lado entre as lavagens.
    4. Aplicar grade para um 50 pi queda coloração negativa e incubar durante um min. A coloração com acetato de uranilo (2%) ou formato de uranilo (0,75%) é recomendado.
      Cuidado: sais e soluções uranyl são fracamente radioativa e contêm metais pesados. Estes devem ser manuseados com cuidado e todo o material que entra em contato com estas soluções devem ser eliminados de seguir as orientações de resíduos recomendados institucionais.
    5. Aplicar grade para um 50 pi queda coloração negativa fresco, sem borrar. Incubar durante um minuto, em seguida, blot lado, e, finalmente, o ar seco e visualizar.
  4. Cryo Electron Microscopy (crio-EM) Visualization
    1. Execute crio-EM com a TAP purificado complexo, apesar de otimização pode ser necessário, de acordo com o protocolo do fabricante.
      Nota: A presença de detergente em concentrações elevadas MAy impedir o progresso e é discutido abaixo.

5. armazenamento Complex

  1. Preparando Complexo de Armazenamento
    1. Concentra-se o complexo, se necessário, utilizando-se um filtro centrífugo com um peso molecular de corte adequado para o complexo. Girar a 14.000 xg por 1 min incrementos até a concentração desejada seja atingida.
      Nota: concentração de NP-40 aumentarão em concentração durante a concentração, uma vez que não passa através da membrana do filtro, nem a diálise.
    2. Flash congelar o complexo em 30 mL alíquotas em azoto líquido ou gelo seco arrefecido banho de etanol e, em seguida, armazena-se a -80 ° C.
  2. Opcional remoção pós-purificação de detergente

Nota: A presença de um detergente tal como NP-40 e com uma concentração acima da sua concentração crítica de micelas podem impedir ou inibir o progresso para algumas aplicações. As consequências de sua remoção do protocol, bem como a substituição com outros aditivos ou co-solventes são discutidos abaixo. Se não NP-40 for desejado, uma opção é a utilização de uma aplicação comercial para a remoção de, por exemplo, Bio-beads.

  1. Pré-equilibrar disponíveis comercialmente de detergente em grânulos absorventes tampão de diálise. Misture cinco pérolas por 30 ul de complexo (geralmente em concentração de 10 nM).
  2. Incubar esferas equilibradas do Passo 5.2.1 com TAP complexo purificado durante 15 minutos em gelo. Use complexo dentro de algumas horas após a remoção do detergente.

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Representative Results

Um método TAP modificado foi usado para purificar a partir de S. cerevisiae U1 snRNP, um complexo ribonucleoproteico-18 subunidade. Uma purificação inicial da TAP complexo seguindo o protocolo publicado 2,3 produziu um complexo que apareceu heterogénea, que migra como três bandas sobre um gel de poliacrilamida corado com prata nativa (Figura 2A). Múltiplos ciclos de optimização do método TAP, produziu um complexo que migrou como uma única banda, principalmente num gel nativo indicativo de um conjunto mais homogéneo (Figura 2A). Usando corantes fluorescentes para manchar tanto para proteínas e ácidos nucleicos, estabeleceu-se que o complexo purificado tinha os dois biopolímeros presentes (Figura 2B).

O complexo purificado foi também analisado por SDS-PAGE e Western blotting utilizando um anticorpo etiqueta TAP (Figura 3A). Consistente com os native resultado de gel, o complexo purificado de acordo com o protocolo publicado exibiu proteólise da proteína etiquetada TAP (Snu71). A quantidade de proteólise, contudo, foi significativamente reduzida com modificações do método TAP. Quase todos os dezassete proteínas no complexo U1 snRNP foram resolvidas por SDS-PAGE e positivamente identificado por espectrometria de massa MALDI (Figura 3B). Bem como nativa e SDS-PAGE, a qualidade do complexo foi avaliada em diferentes fases da purificação por microscopia electrónica de coloração negativa (Figura 4). As partículas monodispersas observados na Figura 4A e B, mas ausentes do 4C são exemplos de boa amostra para o estudo estrutural. Este método de análise fornecida uma visão crítica quanto ao impacto de mudanças no método TAP.

O método TAP requer a inclusão do detergente não iónico NP-40 e a uma concentration acima da sua concentração crítica de micelas (CMC). A robustez dos métodos de avaliação da qualidade do complexo descrito no protocolo são bem demonstrado por uma experiência em que o surfactante zwitteriónico CHAPS, glicerol ou sem co-solvente foram substituídos para o NP-40 em todos os tampões (Figura 5). Por PAGE nativa e EM coloração negativa, o U1 snRNP aparece mais homogênea e estável em NP-40 com a diminuição da estabilidade de CHAPS a glicerol a nenhum co-solvente adicionado. Pode ser que a levedura U1 snRNP tem uma face hidrofóbica e a presença de NP-40 previne a agregação, revestindo esta superfície. Infelizmente, NP-40 não pode ser removido por diálise e a concentração do complexo, então, concentrar-se a NP-40. Enquanto a maior NP-40 não pareceu perturbar o complexo, que tinha um impacto negativo no congelamento da partícula de gelo no vítreo para Cryo-EM e grandes agregados de micelas semelhantes foram observados. Detergentes grânulos absorventes foram usadas com sucesso para remova a maioria do NP-40 a partir da amostra U1 snRNP sem aparecer para impactar o complexo estruturalmente.

Após a purificação do complexo com as modificações descritas no protocolo, um complexo adequado tanto para coloração negativa e crio-EM foi obtido, como evidenciado por imagens da relva e de partículas médias de classe representativos distintas (Figura 6).

figura 1
Figura 1. Visão geral da Tandem Affinity Purification (TAP) Método. (A) Representação esquemática do método de dois passos TAP. Complexo de interesse (cinza) inclui um TAP com etiquetas subunidade (preto; U1 snRNP subunidade Snu71) genomically fundido com uma sequência composta por um calmodulina Binding Peptide (CBP, verde), um local de reconhecimento para a protease específica do local TEV (azul), e dois IgG regiões da proteína A de ligação (Pr A , Vermelho). No primeiro passo, o lisado de células é incubada com uma resina de IgG e o complexo é retido por meio da sua interacção com a proteína A sequência. O complexo é libertado da resina por clivagem de TEV mediada. No segundo passo, o complexo é incubado com uma resina de calmodulina, uma reacção dependente de Ca 2+. O complexo é libertado através da adição de EGTA quelante do Ca2 +. (B) Western Blot seguindo uma torneira com etiquetas proteína através dos passos de purificação ilustrados em (A). Foram tomadas amostras de ligado celular, depois do primeiro passo, e depois o segundo passo do método da TAP. A proteína reativa observada em lisado celular migra mais rapidamente após a primeira etapa, após clivagem TEV protease e, portanto, perda da Proteína A sequência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. A optimização do método de TAP. (A) de prata manchado gel nativo de complexos torneira purificada. PAGE materna: padrão de proteína (pista 1); complexos purificados de acordo com o método original Toque 3 (pista 2), três bandas observadas (pontas de seta); três elui�es consecutivos a partir da mesma purificação TAP seguintes alterações para o buffer, duas bandas observadas (setas) (pistas 3 - 5); novas alterações do método TAP, produzindo principalmente uma única banda complexa migração em ~ 800 kDa (pista 6). (B) Análise da composição de um complexo purificado por coloração uma única pista gel com proteínas e RNA manchas reativos. PAGE materna: padrão de proteína (pista 1) marcadas com um corante fluorescente proteína; fotografada complexo com a proteína mancha fluorescente (pista 2), duas bandas observadas; mesma pista na pista 2, agora fotografada com um corante fluorescente ácido nucleico (pista 3), duas bandas observadas; e sinal fluorescente ao longoleigos do complexo corado nas pistas 2 e 3 (pista 4). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Optimização do método TAP. (A) análise de transferência de Western de melhoria na qualidade do complexo, após a TAP etiquetado subunidade Snu71 sondadas com anticorpo α-TAP. Várias bandas proteolisada são visíveis inicialmente (pista 1) mas as melhorias reduzir a quantidade de bandas mais baixas consideravelmente (pistas 2 e 3). (B) um gel de SDS corado com um representante de mancha de gel de proteína fluorescente. Gel resolve 12 das 17 subunidades de proteína do complexo. Identidade da proteína nas faixas foi estabelecida por espectrometria de massa. Por favor clique aqui para ver uma largversão er desta figura.

Figura 4
Figura 4. Qualidade Amostra em diferentes fases do Método TAP avaliada por Negative Stain Electron Microscopy Avaliação por microscopia eletrônica de coloração negativa de depois complexa:. (A) do st etapa da TAP 1; (B) o passo da TAP; (C ) complexo desestabilizado. Barra de escala, 125 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Impacto na qualidade da amostra de aditivos presentes em TAP Método Buffers Lanes. 1 - 4 são as primeiras quatro eluições da etapa final ou 2 nd de purificação TAP de complex purificado na presença de: (A) o detergente não iónico de nonil phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), analisados ​​por PAGE nativa (em cima) e EM coloração negativa (inferior); (B) o detergente zwitteriónico 3 - [(3- colamidopropil) dimetilamónio] -1-propanossulfonato (CHAPS), analisados ​​por PAGE nativa (em cima) e coloração negativa EM (inferior); (C) glicerol, analisadas por PAGE nativa (em cima) e EM coloração negativa (inferior); e (D) sem aditivo, analisado por PAGE nativa (em cima) e coloração negativa EM (parte inferior). Barra de escala, 50 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. Método de visualização da torneira purificada Complexo. (A) superior, uma imagem representativa de um microsco elétrons coloração negativapy (EM) micrografia. Observado é um gramado de partículas com forma semelhante, dois estão em caixa, purificado pelo método TAP otimizado. Bottom, uma seleção de médias de classe tomadas das partículas que destacam características distintivas das partículas. Barra de escala, 50 nm. (B) Top, uma imagem representativa de uma micrografia de crio-EM. Observados são regiões de maior representante contraste de partículas, ver duas dessas regiões enquadradas. Fundo, médias classe de partículas selecionados congeladas no gelo vítreo. Barra de escala, 50 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O método TAP utiliza duas marcas que equilibram a necessidade de rigorosa e selectiva de ligação a uma resina de afinidade com um desejo de manter perto de condições de solução fisiológica. Este equilíbrio serve para preservar a interação estável (s) da proteína marcada com a interação dos fatores (s) para a caracterização pós-purificação. Além disso, a TAP indivíduo com etiquetas ORFs estão disponíveis a partir de uma fonte comercial, de modo que pode obter-se qualquer estirpe de levedura com uma proteína etiquetada por qualquer complexo de levedura. A preservação da integridade de um complexo e a disponibilidade de um recurso para testar a utilização de diferentes subunidades proteicas marcadas em um complexo para a purificação são duas vantagens para a utilização do método de TAP para purificar um complexo nativo. No entanto, o protocolo TAP método original não foi concebido para assegurar que o complexo é purificado em termos de composição e estruturalmente homogénea. O método TAP tem, portanto, sido modificada, tal como descrito acima, para atingir este objectivo.

Váriospassos no método TAP foram avaliados para determinar a melhor abordagem e as condições para purificar uma composição complexa e homogênea estrutural. Um passo crítico precoce é a lise celular. Este passo requer um equilíbrio entre o nosso desejo de um rendimento elevado e assim a máxima lise, ao mesmo tempo assegurando que o complexo obtido é de alta qualidade, isto é, homogénea. abordagens diferentes para células de levedura lise foram exploradas, incluindo o uso de um talão-batedor, processador de alta fluido pura, e moinho de bolas. Uso do moinho de café menos caro foi menos eficiente do que os métodos alternativos (40 - 60% de lise), mas o complexo isolado e purificado apareceu monodispersa enquanto várias destas abordagens apareceu a integridade de partícula, quer perturb ou provocar um certo grau de agregação. No final, um número significativo de células não foram submetidas a lise, de modo a assegurar complexo de alta qualidade foi obtida. Enquanto 40 - 60% de lise é ideal para o snRNP levedura U1, otimização é sugerido ao aplicar este protocolo a um novo complexo biológico.

Era essencial identificar os passos do método que pode acelerar a purificação para assegurar que a integridade do complexo não foi comprometida por proteases celulares, a dissociação da subunidade, como resultado da diluição, e estendido de incubação a 18 ° C durante a clivagem de protease de TEV. Um simples passo para atingir o tempo de purificação eficiente era assegurar que os lipídios não transitar a partir do início de esclarecimento lisado, visto que os lipídeos impedir o fluxo durante a purificação gravidade. Outras medidas incluíram a identificação de um equilíbrio óptimo entre a resina montante e coluna tamanho / dimensões para alcançar a purificação eficiente e um caudal máximo. Um passo particularmente importante foi o de reduzir o tempo de clivagem em coluna de protease de TEV. A protease TEV utilizado foi purificado em casa para garantir que ele foi protease / nuclease livre e em uma alta concentração 17. Quantidades significativas de protease de TEV foram usadas para obter clivagem completa em menos de uma hora.

Observou onteúdo "> Em inicial proteólise purificações TAP. A proteólise durante a purificação pode ser limitada por trabalhar de forma eficiente, a adição de uma bateria de inibidores, e incluindo na purificação lavagens elevadas de sal. Uma ampla gama de inibidores de protease fornecidos através da primeira metade da purificação bastante melhorada a estabilidade da torneira com etiquetas proteína e complexas. Além disso, a proteólise foi minimizado aumentando a concentração monovalente de 300 a 500 mM durante a lise celular e passos de IgG de purificação. Mesmo com as modificações acima para o método TAP, sucessiva elua frações fora da resina de afinidade CBP variou em seu grau de homogeneidade composicional. Assim, pooling seletiva de frações de segundo, o CBP etapa de cromatografia, se justifica.

Um aspecto do método da torneira que recebeu especial atenção foi a importância do detergente não iónico NP-40 a purificação complexa e com uma concentração acima da sua CMC. A presença de NP-40 a uma concentração de 0,08% ou superior teve um efeito benéfico sobre a integridade complexo e o rendimento final. O efeito benéfico aparente (s) de NP-40 pode ser devida, em parte, para a redução de interacções não específicas entre a resina e o complexo. Enquanto NP-40 parece ter um efeito benéfico no processo de purificação, pode ser removido após a purificação, sem causar agregação complexo.

Finalmente, crítica para optimizar o método TAP para estudo estrutural foram utilizados vários ensaios complementares para avaliar a integridade e a homogeneidade do complexo. Estes dispersão de luz incluídos, SDS PAGE nativa e sondado utilizando o anticorpo TAP por transferência de Western e / ou corada com corantes fluorescentes, bem como microscopia electrónica de coloração negativa. As alterações feitas no método TAP aqui detalhado, rendeu um complexo homogênea em quantidades suficientes para microscopia eletrônica. Outras alterações podem precisar de ser submetido ao método de TAP para outros complexos, em particular um dissuadirminação da importância de NP-40.

Em resumo, o método de purificação da torneira pode ser utilizado para purificar com sucesso complexos macromoleculares de uma fonte eucariótica de qualidade adequada para estudo estrutural. Nós estabelecemos uma abordagem adequada para a purificação do S. cerevisiae U1 snRNP e detalhes as medidas tomadas, bem como a razão para muitas dessas mudanças. Para outros complexos, sugerimos que o investigador semelhante explorar os passos do protocolo, que pode produzir quantidades e qualidade do complexo adequadas. Os passos que devem ser examinadas incluem a lise celular, sal e tipo de aditivo e concentrações, incluindo detergente, e sensibilidade do complexo de cálcio e metal quelante EGTA. Além disso, é importante para os estudos de longo prazo que o complexo pode ser congelado e descongelado, sem perturbar a estrutura. Mais importante, deve-se ter várias formas alternativas para ensaiar a estrutura do complexo durante e após a purificação. Native umnd SDS PAGE, EM coloração negativa, e espalhamento de luz têm nos servido bem na nossa investigação sobre a melhor forma de purificar um complexo homogênea utilizando o método TAP.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
S. cerevisiae TAP tagged strain Open Biosystems YSC1177 This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6
Coffee grinder Mr. Coffee IDS77 Used for cell lysis
Hemocytometer, Bright Line Hausser Scientific 3120 Used to assess cell lysis
JA 9.100 centrifuge rotor  Beckman Coulter, Inc. Used to harvest the yeast cells
JA 20 fixed-angle centrifuge rotor Beckman Coulter, Inc. Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material
Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor Beckman Coulter, Inc. Used to further clear the soluble cell extract
Thermomixer Eppendorf R5355 Temperature controlled shaker
Novex gel system Thermo Fisher Scientific 
IgG resin GE Healthcare 17-0969-01 Sepharose 6 fast flow
Calmodulin resin Agilent Technologies, Inc. 214303 Affinity resin
Protease inhibitor cocktail, mini tablets Sigma Aldrich 589297 Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets
Protease inhibitor cocktail, large tablets Sigma Aldrich 5892953 cOmplete ultra EDTA-free tablets
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Dissolved in isopropanol
2 ml Bio-spin column Bio-Rad Laboratories, Inc. 7326008 Used to pack and wash the Calmodulin resin
10 ml poly-prep column Bio-Rad Laboratories, Inc. 7311550 Used to pack and wash the IgG resin
Precast native PAGE Bis-Tris gels Life Technologies BN1002 Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% precast polyacrylamide gels
NativeMark protein standard Thermo Fisher Scientific LC0725 Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μl for a silver stained gel and 5 μl for a SYPRO Ruby stained gel
Precast SDS PAGE Bis-Tris gels Life Technologies NP0321 Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% precast polyacrylamide gels 
PageRuler protein standard Thermo Fisher Scientific 26614 Unstained protein standard used for Western blotting
SDS running buffer Life Technologies NP0001 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer
TAP antibody Thermo Fisher Scientific CAB1001 Primary antibody against CBP tag
Secondary antibody Thermo Fisher Scientific 31341 Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated
BCIP/NBT Thermo Fisher Scientific 34042 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium 
Dialaysis units Thermo Fisher Scientific 88401 Slide-A-Lyzer mini dialysis units
Centrifugal filter units, 100kDa MWCO EMD Millipore UFC5100008 Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane
Detergent absorbing beads Bio-Rad Laboratories, Inc. 1523920 Bio-bead SM-2 absorbants
SYBR Green II Thermo Fisher Scientific S-7564 Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm
SYPRO Ruby Molecular Probes S-12000 Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm
Copper grids Electron Microscopy Sciences G400-CP

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References

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