एक murine मॉडल में अधोमूत्र पिंडीय उदर महाधमनी clamping द्वारा प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य धमनी अनाच्छादन चोट

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Summary

धमनी अनाच्छादन चोट के बाद फिर से endothelialization के सेलुलर और आणविक तंत्र को समझना घनास्त्रता और धमनियों की restenosis को रोकने में सर्वोपरि महत्व का है। यहाँ हम अधोमूत्र पिंडीय उदर महाधमनी की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य धमनी अनाच्छादन की चोट के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। प्रक्रिया अंतर्निहित तंत्र कि endothelial उत्थान माउस मॉडल का उपयोग करने को विनियमित जांच करने के लिए विकसित किया गया था।

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Shirali, A. S., McDonald, A. I., Mack, J. J., Iruela-Arispe, M. L. Reproducible Arterial Denudation Injury by Infrarenal Abdominal Aortic Clamping in a Murine Model. J. Vis. Exp. (117), e54755, doi:10.3791/54755 (2016).

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Abstract

Percutaneous संवहनी हस्तक्षेप समान रूप से धमनी अनाच्छादन चोटों कि बाद में घनास्त्रता और restenosis के लिए नेतृत्व में परिणाम। इन जटिलताओं घाव मार्जिन के भीतर फिर से endothelialization में दोष के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। फिर भी, फिर से endothelialization के सेलुलर और आणविक तंत्र में परिभाषित किया जा रह है। जबकि धमनी अनाच्छादन के बाद फिर से endothelialization अध्ययन करने के लिए कई पशु मॉडल उपलब्ध हैं, कुछ क्योंकि शल्य सीमाओं के माउस में प्रदर्शन कर रहे हैं। इस ट्रांसजेनिक माउस लाइनों का फायदा उठाने और फिर से endothelialization की प्रक्रिया के लिए विशिष्ट जीन का योगदान की जांच करने के अवसर को नजरअंदाज। यहाँ, हम अधोमूत्र पिंडीय उदर महाधमनी बाहरी संवहनी clamping का उपयोग करने में धमनी अनाच्छादन चोट का एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य murine मॉडल बनाने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल उपस्थित थे। फाइब्रिनोजेन और β-catenin के लिए घायल aortas के Immunocytochemical धुंधला हो जाना एक समर्थक थ्रोम्बोटिक सतह एक के जोखिम का प्रदर्शनक्रमशः बरकरार endothelium की सीमा घ। यहाँ प्रस्तुत विधि ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में धमनी अनाच्छादन चोट लगाने के लिए एक विशिष्ट व्यावहारिक उपकरण बनाने, गति, उत्कृष्ट समग्र जीवित रहने की दर, और रिश्तेदार तकनीकी आसानी के फायदे हैं। इस विधि का प्रयोग, जांचकर्ताओं को सामान्य या रोग की स्थिति के तहत फिर से endothelialization के तंत्र को स्पष्ट कर सकता है।

Introduction

घनास्त्रता और restenosis जो इस तरह के endovascular बैलून एंजियोप्लास्टी और स्टेंटिंग 1,2 के रूप में percutaneous संवहनी हस्तक्षेप से गुजरना रोगियों में गंभीर जल्दी और देर उलझने हैं। कई रणनीतियों इन जटिलताओं, विशेष रूप से दोहरी antiplatelet चिकित्सा और दवा eluting स्टेंट को संबोधित करने के लिए नियोजित किया गया है। हालांकि, छोटे फोकस घनास्त्रता और restenosis, अर्थात् endothelial सेल कवरेज (अनाच्छादन) के नुकसान का मूल कारण पर रखा गया है। अनाच्छादन चोट रक्त वाहिनियों की दीवार के लिए यांत्रिक आघात के कारण हस्तक्षेप प्रक्रियाओं का एक अनिवार्य परिणाम है। इस यांत्रिक आघात रक्त 3 घूम को होने वाले नुकसान और सुरक्षात्मक endothelial परत और तहखाने झिल्ली और संवहनी चिकनी पेशी के जोखिम को हटाने में परिणाम कर सकते हैं। इन क्षेत्रों में endothelial कोशिकाओं के नुकसान एक समर्थक थ्रोम्बोटिक और समर्थक भड़काऊ वातावरण है कि न केवल प्लेटलेट आसंजन और बाद घनास्त्रता को बढ़ावा देता है बनाता है, लेकिन एकLSO प्रवास और संवहनी चिकनी मांसपेशियों neointimal मोटा होना और restenosis 4 में जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं के प्रसार को उत्तेजित करता है। इन जटिलताओं, और उनके संबद्ध चिकित्सा, महत्वपूर्ण रुग्णता, सबसे विशेष रूप से आवर्तक इस्कीमिक रोग और खून बह रहा है घटनाओं है कि मानव स्वास्थ्य को प्रभावित करने के लिए नेतृत्व।

पुनः endothelialization घाव मार्जिन से denuded चोट के घनास्त्रता और restenosis 5 को रोकने में सर्वोपरि महत्व का है। शव परीक्षा परिणाम और पशु मॉडल को प्रभावी ढंग से घनास्त्रता की कम दरों का प्रदर्शन किया स्टेंट के कवरेज के साथ struts 6.7 है। दवा eluting स्टेंट, चिकनी मांसपेशियों प्रसार और neointimal हाइपरप्लासिया बाधा restenosis की दरों में कमी धमनी फिर से endothelialization में महत्वपूर्ण दोष और देर थ्रोम्बोसिस 3 की बढ़ती दरों में परिणाम के लिए तैयार कर लिया। दुर्भाग्य से, फिर से endothelialization के लिए तंत्र को समझने के लिए एक धीमी प्रक्रिया है, मोटे तौर पर एपी की कमी से सीमित किया गया हैpropriate पशु मॉडल 8।

Endothelial कोशिकाओं और धमनी की चोट के बाद संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की भूमिका को समझने के लिए कई पशु मॉडल 7,9,10 बनाया गया है। चूहे कैरोटिड धमनी गुब्बारा चोट मॉडल सबसे अच्छा विशेषता है और सकल सेलुलर और आणविक स्तर पर 11 अनाच्छादन चोट के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है। फिर भी, उत्कृष्ट जीवित रहने की दरों के साथ धमनी अनाच्छादन चोट का एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य murine मॉडल याद आ रही है और बहुत कई ट्रांसजेनिक बेहतर एकाधिक सेटिंग्स में संवहनी उत्थान को स्पष्ट करने के लिए उपलब्ध लाइनों का लाभ लेने की जरूरत है।

यह पांडुलिपि धमनी अनाच्छादन चोट है कि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और प्रदर्शन करने के लिए सरल है की एक murine मॉडल प्रस्तुत करता है। दृष्टिकोण कई ट्रांसजेनिक लाइनों में कम से कम रुग्णता और मृत्यु दर को दिखाया गया है। आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनों के व्यापक संख्या के कारण, इस मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैअनाच्छादन की चोट के बाद फिर से अंतर्निहित endothelialization आणविक तंत्र को स्पष्ट।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल कैलिफोर्निया लॉस एंजिल्स के विश्वविद्यालय में पशु अनुसंधान समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. शल्यक्रिया पूर्व तैयारी और संज्ञाहरण

  1. प्रक्रिया के दौरान बाँझ तकनीक का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें।
  2. एक भाप आटोक्लेव का उपयोग कर सभी शल्य चिकित्सा की आपूर्ति जीवाणुरहित।
  3. संवेदनाहारी प्रेरण के लिए पहले से गरम कृंतक शल्य मंच पर बारी इतना है कि यह शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान उचित तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) और दृश्य के लिए stereomicroscope के तहत जगह पर गर्म हो सकता।
  4. संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में माउस प्लेस और 1 एल / मिनट की एक प्रवाह दर पर 4% isoflurane के साथ प्रेरित।
    1. ध्यान से प्रेरण के दौरान माउस के श्वसन दर और लुटेरा त्वचा के रंग की निगरानी।
    2. श्वसन दर के धीमा करने के बाद, प्रेरण कक्ष से माउस को हटाने और 2.5% की अलग nosecone और रखरखाव isoflurane एकाग्रता में चेहरे के साथ शल्य चिकित्सा की तैयारी के लिए गरम पैड पर जगह है।
    3. एनेस्थेटिक की पर्याप्तता का आकलन करने के लिए पैर की अंगुली चुटकी प्रदर्शन करना।
  5. कॉर्निया को नेत्र मरहम लागू करें और (5 मिलीग्राम / किग्रा) subcutaneously preoperative Carprofen प्रशासन।
  6. जगह माउस लापरवाह और उपयोग कतरनी पेट से बालों को हटाने के लिए।
  7. povidone आयोडीन की तीन बारी scrubs और 70% isopropyl शराब बाँझ धुंध पैड के साथ आवेदन के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयार करें।
  8. nosecone में चेहरे के साथ गरम कृंतक शल्य चिकित्सा मंच पर जगह माउस लापरवाह और सभी पांव सुरक्षित और सावधानी से स्थिति ऐसी है कि माउस पेट stereomicroscope के साथ दिख रहा है।
  9. बाँझ, चिपकने वाला ड्रेसिंग तैयार शल्य चिकित्सा क्षेत्र के प्रत्येक बढ़त के साथ रखें।
  10. isoflurane एकाग्रता titrate सर्जरी के दौरान पर्याप्त संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए, जबकि सहज श्वास को बनाए रखने।

2. अधोमूत्र पिंडीय महाधमनी Clamping

  1. , एक छुरी का उपयोग कर approximatel शुरू पेट के midline नीचे एक 3 सेमी चीराजिफाएडा प्रक्रिया को नीचा Y 0.5 सेमी।
  2. धीरे संदंश के साथ त्वचा वापस लेना और त्वचा पेट की दीवार ठीक कैंची का उपयोग ठीक संयोजी ऊतक में कटौती करने से दूर काटना।
  3. मांसपेशियों की दीवार को 0.5% Bupivacaine की 0.05-0.1 मिलीलीटर लागू करें और पेट अंगों को बेनकाब करने के लिए पेट की दीवार में एक 2 सेमी चीरा बनाते हैं।
    1. खून बह रहा है पेट की दीवार के साथ होता है, तो एक कपास इत्तला दे दी applicator के साथ कोमल दबाव लागू होते हैं।
  4. धीरे खारा लथपथ कपास इत्तला दे दी applicators का उपयोग कर आंतों उठा।
    नोट: एक गर्म, बाँझ खारा लथपथ धुंध उदर गुहा के बाहर स्पंज पर मध्यांत्रीय और ileal धमनियों और जगह पर कुंद आघात से बचने के लिए सावधान रहें।
    1. एक और गर्म, बाँझ खारा लथपथ धुंध स्पंज के साथ आंतों कवर नमी नुकसान से बचने के लिए।
  5. मलाशय lateralize और retroperitoneum बेनकाब करने के लिए एक प्रतिकर्षक रखें।
  6. आवश्यक के रूप में छोटे धुंध पैड retroperitone के दृश्य के लिए जगहउम इस्तेमाल किया संख्या का ट्रैक रखते हुए।
  7. सही गुर्दे के अवर पोल के स्तर पर, एक retroperitonotomy महाधमनी के लिए पार्श्व बनाने के लिए तेज विदारक संदंश का उपयोग करें।
    ध्यान दें: अवर रग Cava या आसपास के जहाजों को चोट पहुंचाना नहीं सावधान रहें।
    1. दो टूक महाधमनी बंद retroperitoneal ऊतक काटना अवर रग Cava या आसपास के वाहिका छेदना के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है।
  8. कम से कम 1 मिनट, या अन्य निर्दिष्ट समय के लिए महाधमनी से अधिक संवहनी दबाना प्लेस, और नेत्रहीन बाहर का महाधमनी में pulsatility की कमी को देख कर रोड़ा सत्यापित करें।
  9. संवहनी दबाना निकालें और रक्तस्तम्भन सत्यापित करें। रक्तस्तम्भन हासिल की और यह सुनिश्चित किया जब रक्त का कोई सक्रिय परिस्त्राव देखा जाता है।
    1. उदर गुहा में 0.5 मिलीलीटर खारा जोड़ने और यदि खारा तेजी से खून से रंग बन जाता है का आकलन करने से परिस्त्राव की पुष्टि करें। यदि यह मामला है, खारा लथपथ applicator का उपयोग कर 1 मिनट सुनिश्चित करने के लिए कोमल दबाव लागूरक्तस्तम्भन।
  10. किसी भी धुंध retroperitoneum के दृश्य में सहायता और पेट में सीटू आंतों को बदलने के लिए रखा पैड निकालें।
  11. पूर्व गर्म बाँझ खारा का उपयोग उदर गुहा की सिंचाई।

3. Laparotomy और त्वचा की बंद

  1. 5-0 लट, absorbable एकल चल सीवन का उपयोग कर पेट की दीवार मांसपेशी परत को बंद करें।
  2. घाव क्लिप के साथ बाद में बहुलक चिपकने की 1-3 बूँदें और फिर साथ बंद त्वचा एक बार चिपकने वाला सेट है।

4. वसूली और पश्चात आकलन

  1. माउस पिंजरे के फर्श पर भोजन और पानी के साथ एक हीटिंग पैड पर एक वसूली पिंजरे के लिए स्थानांतरण।
  2. बारीकी से श्वसन संकट के संकेत के लिए माउस की निगरानी। संस्था के दिशा निर्देशों के अनुसार 48 घंटा postoperatively के लिए प्रशासन Carprofen (5 मिलीग्राम / किग्रा) दैनिक।
    1. एक जानवर की पहुंच से बाहर मत छोड़ो जब तक यह पर्याप्त होश आ गया है स्टर्नल recum बनाए रखने के लिएbency।
  3. भोजन और पानी के साथ एक सामान्य पिंजरे के लिए माउस लौटें।
    1. एक जानवर जब तक पूरी तरह से ठीक है कि अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी आया है वापस नहीं है।
  4. स्फुटन के लिए एक दैनिक आधार पर घाव का आकलन और पश्चात 14 दिन पर क्लिप को हटा दें।

5. महाधमनी विच्छेदन और धुंधला

  1. बलिदान के लिए चूहों का चयन अनाच्छादन चोट के बाद हित के विशिष्ट समय बिंदु पर आधारित है।
  2. Isoflurane साँस लेना के माध्यम से चूहों बलिदान और तुरंत संवहनी चिकनी मांसपेशी छूट पैदा करने के लिए 5 मिलीग्राम methacholine क्लोराइड के साथ इंजेक्षन।
  3. सांस की समाप्ति, कॉर्निया पलटा और आंदोलन की कमी की कमी से मौत की पुष्टि होने पर 10 मिनट के लिए छोड़ दिया है दिल वेंट्रिकल के माध्यम से 100 एमएमएचजी के एक छिड़काव दबाव में फॉस्फेट बफर खारा में 4% paraformaldehyde के साथ छिड़कना।
  4. एक विदारक stereomicroscope का प्रयोग सावधानी से बरकरार उदर महाधमनी अलग करने के लिएआसपास के ऊतकों।
  5. श्रोणिफलक विभाजन को गुर्दे धमनियों और दुम को महाधमनी व्याख्यान चबूतरे आड़ा काट और पृष्ठीय सतह के साथ एक अनुदैर्ध्य चीरा के माध्यम से खोला।
  6. महाधमनी कोई कम से कम 2 घंटे के लिए ऊपर निर्धारण के लिए ल्यूमिनल पक्ष के साथ एक 35 मिमी सिलिकॉन लेपित पकवान लेकिन कोई अधिक से अधिक 12 घंटा पर फ्लैट पिन। बाद में, ऊतक या तो सेक्शनिंग के लिए एम्बेडेड या एन चेहरे पूरे माउंट immunocytochemistry में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  7. माउंट दाग confocal माइक्रोस्कोपी के लिए कांच की स्लाइड्स पर coverslip का सामना करना पड़ ल्यूमिनल पक्ष के साथ aortas।

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Representative Results

पचासी चूहों अस्तित्व सर्जिकल तकनीक अधोमूत्र पिंडीय उदर महाधमनी clamping के लिए इस रिपोर्ट में वर्णित आया है। समग्र जीवित रहने की दर 85.9% थी। ऑपरेटिव जटिलताओं आंतों से खून बह रहा है और महान पोत वेध, 5.9% और 3.5% मृत्यु दर में जिसके परिणामस्वरूप क्रमश: (1 टेबल) शामिल थे। संज्ञाहरण से वसूली के बाद, चूहों सामान्य रूप से चलने के लिए और अवर अंग को इस्कीमिक चोट के कोई निशान नहीं दिखा। कोई वजन घटाने या भूख की कमी का उल्लेख किया गया था।

(ए) के बिना और (बी) महाधमनी clamping के साथ stereomicroscope के तहत laparotomy और retroperitoneal विच्छेदन निम्नलिखित अधोमूत्र पिंडीय उदर महाधमनी के आंकड़े 1 ए और 1 बी शो छवियों। दिखाया गया है, यह महाधमनी की चौड़ाई के साथ अनाच्छादन सुनिश्चित करने के लिए अपनी संपूर्णता में महाधमनी चौड़ाई शिकंजा कसने के लिए महत्वपूर्ण है। हमारी प्रोटोकॉल में पाया गया कि तेज मोड़ श्वार्ट्ज माइक्रो Serre का उपयोग कर1.75 मिमी और 'मजबूत' दबाना प्रेस के एक जबड़े चौड़ाई के साथ जुर्माना कम से कम समय के साथ दबाना महाधमनी की पूरी चौड़ाई में सबसे बड़ा निरंतर घाव का उत्पादन किया। हालांकि, अन्य अकड़न चर चोट आकार (चित्रा 1 सी) के साथ कई रोड़ा समय अंतराल पर परीक्षण किया गया। प्रस्तुत परिणामों के शेष के ऊपर उल्लेख किया दबाना का उपयोग कर उत्पादन किया गया था।

महाधमनी के histological मूल्यांकन अंतर्निहित चिकनी पेशी सेल परत के रूप में एच एंड ई धुंधला द्वारा प्रदर्शन करने के लिए मध्यम क्षति के साथ endothelial अस्तर की पूरी अनाच्छादन को दर्शाता है। Endothelium के अनाच्छादन विभिन्न डिग्री (चित्रा 2) के लिए हालांकि, दोनों 10 सेकंड और 10 मिनट पर होता है। इष्टतम महाधमनी clamping समय अंतराल पूरा धमनी अनाच्छादन के लिए आवश्यक निर्धारित करने के लिए, चूहों 10 सेकंड, 1 मिनट और 10 मिनट के लिए clamping कराना पड़ा और ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में तुरंत विश्लेषण के लिए बलिदान किया गया। Areअनाच्छादन की एक दबाना समय बढ़ रही है (चित्रा 3) के साथ वृद्धि हुई है। 10 सेकंड, लगभग 0.75 मिमी 2 की एक अधूरी और बद अनाच्छादन चोट पर बद फाइब्रिनोजेन धुंधला हो जाना, जहां फाइब्रिनोजेन अनाच्छादन की चोट के लिए एक मार्कर के रूप में कार्य करता है के द्वारा की पहचान की थी। महाधमनी clamping के दस मिनट के लगभग 1.2 मिमी 2 की एक पूरी तरह denuded endothelial क्षेत्र, हालांकि clamping के समय की इस राशि अंग ischemia और चोट के लिए उच्च जोखिम माना जाता था का उत्पादन किया। जैसे, हम इस्कीमिक चोट के सबूत के बिना पास पूरा धमनी अनाच्छादन चोट में परिणाम के लिए पर्याप्त महाधमनी clamping, जो औसतन अनाच्छादन की एक 0.88 मिमी 2 क्षेत्र का उत्पादन 1 मिनट समझा।

महाधमनी clamping के 1 मिनट के साथ अनाच्छादन चोट की हद तक बेहद प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, एक 600 मीटर व्यास और अनाच्छादन की 0.88 मिमी 2 क्षेत्र के उत्पादन (आंकड़े 3 और 4)।फाइब्रिनोजेन धुंधला की तीव्रता बाद में समय बिंदुओं पर मूल चोट की पहचान करने के लिए पर्याप्त है। चित्रा 4 तीन चूहों कि महाधमनी 24 घंटा पूर्व के बलिदान करने के लिए clamping के 1 मिनट कराना पड़ा, एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट बनाने के फाइब्रिनोजेन धुंधला से पता चलता। फाइब्रिनोजेन छह aortas की चोट के बाद 24 घंटे धुंधला करने का मापन लगभग 0.81 मिमी 2 (चित्रा 5 ए), सांख्यिकीय 0.88 मिमी 2 चोट करने के लिए इसी तरह की चोट के बाद तुरंत ध्यान दिया (पी = 0.14) है। रिहाई endothelium की तुलना में, अनाच्छादन चोट (चित्रा 5 ब) में फाइब्रिनोजेन धुंधला overlying, फिर से endothelialization अंकन के साथ endothelial कोशिकाओं पलायन चोट शो के बाद घाव मार्जिन 24 घंटा। औसत पर, 0.88 मिमी 2 अनाच्छादन की चोट के पूर्ण फिर से endothelialization लगभग 3 दिनों के लिए। हालांकि, इस दृष्टिकोण भी आगे बड़ा अनाच्छादन चोटों का उत्पादन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता ले लिया। कई बार, हर Clamping1 मिनट के लिए, व्याख्यान चबूतरे से अधोमूत्र पिंडीय महाधमनी साथ दुम करने के लिए एक 3.7 मिमी 2 अनाच्छादन चोट का उत्पादन किया। हालांकि इस दृष्टिकोण को भी नुकसान Tunica मीडिया, हम दबाना चोट का एक परिणाम के रूप में उदर महाधमनी विच्छेदन की कभी नहीं देखा है।

इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कि अधोमूत्र पिंडीय उदर महाधमनी clamping सुरक्षित रूप से एक धमनी अनाच्छादन चोट बनाने और endothelial उत्थान को मापने के प्रयोजनों के लिए एक murine मॉडल में प्रदर्शन किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। पृथक अधोमूत्र पिंडीय उदर महाधमनी पृथक अधोमूत्र पिंडीय उदर महाधमनी (ए) के बिना और (बी) के साथ एक नाड़ी दबाना दिखाया गया है। विभिन्न लंबाई और दबाना प्रेस शक्ति के अनेक अकड़न एक है कि लगातार चोट (सी) प्रदान करता है का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। श्वार्ट्ज माइकro Serrefine (तीर) के सबसे बड़े निरंतर घाव का उत्पादन किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। एक गैर घायल माउस में एक अधोमूत्र पिंडीय उदर महाधमनी खंड (ए) के endothelial अनाच्छादन एच ई धुंधला की क्षमता और 10 सेकंड (बी) और महाधमनी clamping (सी) के 10 मिनट के बाद। संवहनी clamping पूरी तरह से, endothelial परत denudes के रूप में नाभिक धुंधला की अनुपस्थिति से सत्यापित किया जा सकता। इसके अलावा चिकनी पेशी सेल नाभिक के नुकसान Tunica मीडिया को नुकसान से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3:। दबाना समय का रिश्ता लंबाई घाव को अधोमूत्र पिंडीय उदर महाधमनी clamping 10 सेकंड, 1 मिनट और 10 मिनट के लिए प्रदर्शन किया था। इसके तत्काल बाद चोट के बाद, immunocytochemistry एक नकली सर्जरी और दिखाया (ए) के रूप में और उच्च संकल्प (बी) में ये समय बिंदुओं के लिए एन चेहरे प्रदर्शन किया गया था। (बैंगनी) में फाइब्रिनोजेन चोट के क्षेत्र को पहचानती है। β-catenin (लाल रंग में) endothelial सीमाओं को पहचानती है। तारांकित (*) दबाना आवेदन क्षेत्र के निशान। β-catenin की अनुपस्थिति चोट के क्षेत्र में endothelial कोशिकाओं की कमी को दर्शाता है। (सी) clamping समय बढ़ बढ़ जाती है कि अनाच्छादन क्षेत्र (एन = 2 हर समय बिंदु के लिए) को दिखाने के लिए अनाच्छादन चोट क्षेत्र के एक मार्कर के रूप में फाइब्रिनोजेन धुंधला उपयोग करता है। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते। ज क्लिक करेंअरे यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 4
चित्रा 4:। 1 मिनट के लिए महाधमनी clamping निम्नलिखित चोट क्षेत्र चौबीस घंटे की पहचान, महाधमनी विच्छेदित और Tunica intima बेनकाब करने के लिए काट दिया गया। 4% paraformaldehyde में निर्धारण के बाद, immunocytochemistry एन चेहरे प्रदर्शन किया गया था। फाइब्रिनोजेन (बैंगनी) में चोट के क्षेत्र को पहचानती (ए)। घाव मार्जिन (बी) और घाव (सी) के भीतर दिखाए जाते हैं, के उच्च बढ़ाई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: अनाच्छादन के reproducibilityचोट और पुनः endothelialization की पहचान। चौबीस घंटा के चोट के बाद, महाधमनी एन चेहरे और कहा कराना पड़ा immunocytochemistry के रूप में विच्छेदित किया गया था। अनाच्छादन की चोट के लिए एक मार्कर के रूप फाइब्रिनोजेन का प्रयोग, एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट 0.81 मिमी 2 का एक मतलब अनाच्छादन क्षेत्र के साथ (ए) में मनाया जाता है (एन = 6)। उच्च संकल्प छवियों चलता है कि घाव मार्जिन दर्शाती फाइब्रिनोजेन धुंधला और पलायन endothelial कोशिकाओं (तीर, बैंगनी धुंधला) (बी) रिहाई endothelium (सी) की तुलना में। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1:। ऑपरेटिव और पश्चात की मृत्यु एक 85 चूहों की कुल underwईएनटी अस्तित्व 85.9% की जीवित रहने की दर के साथ infrafrenal उदर महाधमनी clamping। आठ चूहों (9.4%) आंतों नकसीर या महान पोत वेध के कारण सर्जरी जीवित नहीं था। चार चूहों postoperatively मृत्यु हो गई।

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Discussion

इस तरह के बैलून एंजियोप्लास्टी और स्टेंटिंग नाड़ी के रूप में percutaneous हस्तक्षेप के कारण धमनी अनाच्छादन चोट, जल्दी और देर संवहनी घनास्त्रता और restenosis में परिणाम और आवर्तक इस्कीमिक घटनाओं 3,12 करने के लिए योगदान देता है। दिलचस्प है, शल्य संवहनी clamping भी धमनी अनाच्छादन का एक कारण के रूप में फंसाया गया है, किसी भी संवहनी प्रक्रिया के दौर से गुजर रोगियों के लिए समस्या के दायरे का विस्तार, चाहे percutaneous या 13 खुला। जबकि बिगड़ा फिर से endothelialization घनास्त्रता और restenosis के एक काफी मान्यता प्राप्त कारण है, आणविक आसपास फिर से endothelialization तंत्र को स्पष्ट करने के लिए मुश्किल हो गया है। पशु मॉडलों एक आवश्यकता धमनी अनाच्छादन चोट के बाद फिर से endothelialization के आगे समझ हासिल करने के लिए बन गए हैं।

मौजूदा पशु मॉडल धमनी अनाच्छादन चोट के सेलुलर और आणविक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सूअर, खरगोश और कृंतक 7,9-11 में उन लोगों में शामिल हैं। कृंतक आधुनिकएल्स अक्सर चूहे कैरोटिड धमनी गुब्बारा चोट मॉडल, माउस तार चोट मॉडल, और चूहा और माउस बंधाव मॉडल 14,15 शामिल किया करते थे। जबकि चूहे कैरोटिड धमनी गुब्बारा चोट मॉडल सबसे अच्छा विशेषता है और सबसे अधिक इस्तेमाल किया, मन्या चोट प्रक्रियाओं चूहों में Lindner द्वारा वर्णित ट्रांसजेनिक उपभेदों 16,17 के उपयोग की संभावनाओं चौड़ी है। आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल संभावित बंद लक्ष्य प्रभाव और औषधीय अवरोधकों के साथ जुड़े मुद्दों विशिष्टता की घटनाओं में कमी आई है, और हित के विशिष्ट तत्वों के ऊतक विशेष और सशर्त पृथक के लिए अनुमति हो सकती है। बहरहाल, माउस में मन्या चोट अत्यंत चुनौतीपूर्ण और प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है।

यहाँ वर्णित अधोमूत्र पिंडीय उदर महाधमनी के murine धमनी अनाच्छादन मॉडल लागू करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है और इन विवो में एक बड़े कैलिबर धमनी की फिर से endothelialization के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है। सर्जरी एक स्वीकार्य सुर का प्रदर्शन85.9% की दर vival। घाव की लंबाई दबाना जबड़े आयाम, दबाना प्रेस की ताकत है, और समय संवहनी दबाना पोत occluding है की लंबाई पर निर्भर है। इस मॉडल को 1 मिनट के लिए एक 10 x 1.75 मिमी जबड़े आयाम और 'मजबूत' दबाना प्रेस का उपयोग करता है एक 0.88 मिमी 2 अनाच्छादन चोट है कि अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है उत्पादन। घाव लंबाई में परिवर्तनशीलता अलग जबड़े आयामों और पोत रोड़ा की लंबाई के साथ मनाया गया। इसके अलावा, अनाच्छादन के क्षेत्र क्रमानुसार व्याख्यान चबूतरे से दुम को अधोमूत्र पिंडीय उदर महाधमनी clamping द्वारा विस्तारित किया जा सकता है। जैसे, इस मॉडल है कि एक अध्ययन का उद्देश्य फिट करने के लिए चालाकी से किया जा सकता है अनाच्छादन चोट आकार में बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है।

चोट और endothelial बंद होने के बाद चोट दरों की सीमा का आकलन करने के लिए, immunocytochemistry endothelial सेल जंक्शनों या एर्ग की पहचान करने के endothelial सेल नाभिक और टी की पहचान करने के फाइब्रिनोजेन की पहचान के लिए β-catenin के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी के साथ विभिन्न बिंदुओं पर समय प्रदर्शन किया गया थावह क्षेत्र घायल हो गए। फिर से endothelialization के रूप में हुई, फाइब्रिनोजेन धुंधला फिर से endothelialization की हद तक की तुलना में मूल चोट की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। फाइब्रिनोजेन का मजबूत धुंधला काफी endothelium के regrowth के बाद तनु है, वहाँ पर्याप्त तीव्रता कम से कम 4 दिनों के बाद सर्जरी के बाद भी मूल चोट की पहचान करने के लिए बनी हुई है।

यह मॉडल सीमाओं के बिना नहीं है। किसी भी जानवर मॉडल के साथ के रूप में, murine सर्जरी अच्छा सर्जिकल तकनीक की आवश्यकता है और एक सीखने की अवस्था पर जोर देता। चूहे जल्दी से पोत छेदों को परास्त कर सकते हैं अगर विच्छेदन की देखभाल, जो कभी कभी को नियंत्रित करने के लिए असंभव है के साथ नहीं किया जाता है। ऑपरेटिव मौत का सबसे आम कारण आंतों नकसीर और महान पोत वेध, 5.9% और 3.5%, क्रमशः में शामिल थे। हालांकि, सावधान विच्छेदन के साथ, नकसीर दुर्लभ है और खून की कमी आम तौर पर हमारे अनुभव में नीचे 0.1 मिलीलीटर करने के लिए रखा जा सकता है। इसके अलावा, महाधमनी और उचित दबाना की पर्याप्त विच्छेदननियुक्ति एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट का अभिन्न अंग है। बाहर का महाधमनी pulsatility की जांच पूरी महाधमनी रोड़ा पुष्टि करने के लिए, महाधमनी के लिए सभी retroperitoneal ऊतक पक्षपाती को हटाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि एक साफ, निर्बाध घाव प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। जैसा कि पहले उल्लेख, Tunica मीडिया को नुकसान महाधमनी clamping की इस प्रक्रिया के साथ उल्लेख किया है। हालांकि, औसत दर्जे का चिकनी मांसपेशियों मौत बाद neointimal हाइपरप्लासिया 18 में स्टेंट आरोपण के कारण लंबे समय तक या पुरानी संवहनी विस्तार, और परिणामों के एक जाने-माने परिणाम है। हमारे मॉडल में औसत दर्जे का नुकसान वैकृत sequelae है के रूप में हम कोई पश्चात मृत्यु है और इन चूहों 2 महीने postoperatively अप करने के लिए बच गया है प्रकट नहीं होता है।

हम अधोमूत्र पिंडीय उदर महाधमनी कि अच्छा जीवित रहने की दरों के साथ प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है की धमनी अनाच्छादन चोट का एक बहुमुखी murine मॉडल प्रस्तुत करते हैं। यह मॉडल ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की एक भीड़ के साथ धमनी चोट के अध्ययन के लिए एक जरूरत भर जाता है। दत्तक ग्रहण ओइस murine मॉडल च सामान्य और वैकृत शर्तों के तहत फिर से endothelialization की आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम के लिए MLIA स्वास्थ्य (HL130290) के राष्ट्रीय संस्थानों एली और पुनर्योजी चिकित्सा के EDYTHE ब्रॉड केंद्र से अनुदान द्वारा समर्थित और गधा और लक्ष्य, फिलिप जे Whitcome फैलोशिप उद्देश्य के लिए करने के लिए यूसीएलए प्रशिक्षण कार्यक्रम में स्टेम सेल अनुसंधान किया गया था, और।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Discovery.V12 Stereomicroscope Zeiss 495037-9904-000
Rodent Heated Surgical Platform Protech International RES4000 Heated platform for body temperature maintenance with nosecone for anesthestic maintenance and on which surgical procedure is performed
Isoflurane Henry Schein 50033 4% Induction; 2.5% Maintenance
Isoflurane Vaporizer Summit Medical Equipment 470062
Stryker T/Pump Warm Water Recirculator Kent Scientific TP-700
Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment Akorn Animal Health 17478-162-35
Carprieve (Carprofen) Norbrook Laboratories NDC 55529-131-01
Oster™ A5 Professional Animal Clipper M.Schneider & Sons Inc. 78005010 Use with animal clipper size 40
Adjustable Wire Retractor Fine Science Tools 17004-05
Schwartz Micro Serrefines - Sharp Bend Fine Science Tools 18052-03
Surgical Instruments Fine Science Tools sharp dissecting forceps, blunt forceps, fine scissors, spring scissors, hemostat
0.5% Marcaine Hospira 0409-1610-50
5-0 Suture, Vicryl Fisher Scientific NC0189890 tapered needle
Vetbond Fisher Scientific NC0304169
Falcon® 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish Corning 351008
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004
Dissecting pins Fisher Scientific NC9681411

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References

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