입체 슈퍼의 간섭 광 활성화 현지화 현미경으로 F-액틴 필라멘트의 해상도 현미경 (iPALM)

Biology

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Summary

우리는 접착 포유류 세포에서 액틴 세포 골격의 이미징에 간섭 광 활성화 지역화 현미경 (iPALM), 3 차원 단일 분자 지역화 초 해상 현미경 법의 적용 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 다른 기존의 회절 제한 광학 현미경으로 해결되지 않은 남아있을 것입니다 나노 구조적 특징의 빛 기반 시각화 할 수 있습니다.

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Wang, Y., Kanchanawong, P. Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). J. Vis. Exp. (118), e54774, doi:10.3791/54774 (2016).

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Abstract

형광 현미경은 세포 내 특정 생체 분자를 직접 시각화 할 수 있습니다. 그러나, 종래의 형광 현미경, 공간 해상도는 광축을 따라 결상면과> 내지 500nm에서 ~ 200 nm의 회절에 의해 제한된다. 결과적으로, 형광 현미경은 오랫동안 심각한 세포 내 미세 기능의 관찰에 한정되었다. 초 해상 현미경 방법의 최근 발전은 이러한 한계를 극복하고있다. 특히, 광전 환성 형광체의 출현 분자 길이 스케일에 접근 해상력을 제공하는 기반 지역화 초 해상 현미경을 가능하게한다. 여기서는 간섭계 광 활성화 지역화 현미경 (iPALM)이라는 단일 분자 파악 현미경 다상 간섭에 기초하여 입체 초 해상 현미경 법의 적용을 설명한다. 이 방법은에 거의 등방성 해상도를 제공세 가지 차원에서 20 나노 미터의 순서. iPALM 악기의 시료 준비 및 운영을 포함하여 사상 액틴 세포 골격을 시각화 프로토콜, 여기에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 세포에서 다른 미세 구조 기능 연구에 쉽게 적응과 교훈입니다.

Introduction

복잡한 세포 구조의 시각화는 오랫동안 생물 통찰력과 발견을 통합하고있다. 형광 현미경은, 그 해상력이 ~ 200 화상면에 나노 (X, Y, 또는 측 방향 치수) 및> 500 nm의 광학 축 방향 (Z, 또는 축 방향 치수)에 회절 고분자 특이성 화상 세포 제한 할 수 있지만 1, 2. 따라서, 미세 기능 관찰 역사적 전자 현미경 (EM)로 제한되어왔다. 100 nm의 범위 1-6 - 다행히, 슈퍼 해상도 현미경의 최근 발전은 10에서 공간 해상도를 가능하게,이 제한을 회피했다. 특히, 슈퍼 해상도는 같은 PALM (광 활성화 현지화 현미경) 4, FPALM은 (형광 광 활성화 현지화 현미경) 5 (d)에 STORM (직접 확률 광학 재건 현미경) 6, 7, PAINT (같은 약어로 알려진 단일 분자 현지화에 기반 접근 방법 포이미징 나노 지형) 8 INT의 축적은, GSDIM (접지 상태 고갈 현미경 9) 개별 분자 반환 한 다음, 또는 SMACM (단일 분자 액티브 제어 현미경) (10),뿐만 아니라 그들의 3 차원 (3D) 구현, 간섭 PALM (iPALM) 11 3D-STORM (12)는 신경 세포의 축삭을, 다수의 생물학적 구조의 나노 조직에 새로운 통찰력을 드러내는 포함 귀중한되었습니다 및 초점 유착 14, 15, 세포 - 세포 접합 (16), 원자력이 17 모공, 13 시냅스 및 중심체 18 ~ 20 등이 있습니다.

슈퍼 해상도 현미경은 잠재적으로 유용하는 세포의 또 다른 미세 기능은 액틴 세포 골격이다. 셀 피질 필라멘트 (F) 액틴의 복잡한 그물 세공은 세포 형태 및 기계적 특성 (21)의 제어에 중요한 역할을한다. 조직 오F의 F-액틴 적극적 동적 강하게 중합, 가교, 회전율, 안정성 및 네트워크 토폴로지 (22)에 영향을 미치는 수많은 조절 단백질 비록 조절된다. 그러나, F - 굴지 그물 세공 구조의 특성은 세포 과정의 다양한 범위, 기존의 회절 제한 광학 현미경으로 자신의 관찰을 방해은 F-액틴 필라멘트의 작은 크기 (~ 8 ㎚)에 기계적인 통찰력에 대한 중요하지만, 따라서 액틴 미세 구조의 시각화 종래 독점적 EM에 의해 수행되었다. 여기서는, 접착 포유류 세포에서 액틴 세포 골격 F-시각화 3D 11,23에 매우 높은 정밀도 기능을 활용할 iPALM 초 해상 현미경 기술을 사용하는 프로토콜을 기술한다. iPALM 악기는 매우 전문 있지만, 이러한 장비를 설정하는 방법에 대한 지시는 최근 23 설명되어있는 호 주최 iPALM 현미경에 액세스하는 동안구 휴즈 의학 연구소는 또한 최소의 비용으로 연구 커뮤니티에 제공하고있다. 또한, 본원에 기재된 시료 제조 방법은 더 광범위하게 사용할 수있는 등의 점 확산 함수 (PSF)의 난시 디 포커싱 기반으로하는 다른 3D 슈퍼 해상도 방법, (12) 또는 이중면 검출부 (24)에 직접적으로 적용될 수있다.

우리는 일반적으로 단일 분자 현지화 기반의 초 고해상도 현미경을위한 필요한 성분이 충족되어야 단일 분자 현지화 기반의 초 고해상도 현미경을위한 세 가지 핵심 요구 사항을 수있는 광전 환성 형광 25이므로주의 : ⅰ) 높은 단일 분자 배경 신호의 밝기 및 대비 상대; ⅱ) 소정의 이미지 프레임 내의 단일 분자의 희박한 분포; 또한 나이 퀴 스트 - 샤로 알려진 기본 구조 (의 프로필을 캡처하기에 충분한 라벨 및 ⅲ) 높은 공간 밀도nnon 샘플링 기준) 26. 따라서, 만족스러운 결과를 위해, 형광체의 강조 photoswitching을 최적화하고 기본 미세 구조를 보존 할뿐만 아니라, 실험 기기 및 수집 측면하는 시험편의 적절한 준비를 모두 동등하게 배치되어야한다.

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Protocol

1. 이미징 표본 준비

  1. 배경 형광 신호는 형광 라벨 형광을 방해하기 때문에, 제 (DDH 2 O) 탈 이온수로 세정을 한 후, 압축 공기를 사용하여 공기 건조하여 coverglasses 청소. 그 후, 15 초 동안 플라즈마 클리너에 플라즈마 에칭을 수행하거나, 필요 이상.
  2. 드리프트 보정 및 iPALM 보정을 사용하려면, # 1.5 라운드 (22-mm 직경) 신뢰할 수있는 교정 및 드리프트 보정과 같은 높은 광 안정성 기점를 제공 기준 마크, 형광 나노 입자에 포함 된 사전 청소 coverglasses를 사용합니다. 때문에 충분한 형광 밀도 축적하는데 필요한 긴 획득 시간 (> 15-30 분), 샘플 드리프트는 불가피하다.
  3. 6 잘 조직 배양 플레이트에 각 fiducialed 커브 글라스를 놓습니다. 15 분 동안 층류 후드에서 자외선 (UV) 조사에 의해이를 멸균.
  4. 멸균 층류 후드에서 석면을 제조10 μg의 / ㎖ - 최종 농도 2 무균 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS) 1 ㎎ / ㎖ 피브로넥틴 원액을 희석함으로써 커브 글라스 코팅 nectin 용액. 각 DPBS로 3 회 커브 글라스 씻어 4 ℃에서 하룻밤 피브로넥틴 용액 2 ㎖로 배양. 이어서, 피브로넥틴 용액을 흡인하고 DPBS 회 헹군다.
  5. DPBS 짧게 세포를 씻어. 세포를 분리하여 신선한 혈청 - 함유 세포 배양 배지 ~ 10 ㎖로 급냉 될 때까지 37 ° C에서 몇 분 동안 2 ㎖ 트립신 - 1 부화. 예를 들어, 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)의 경우, 큰 혈관 내피 성장 인자 및 페니실린 또는 스트렙토 마이신이 보충 된 대형 혈관 내피 세포 배양 배지를 사용한다.
    1. (희소 밀도 판 <커브 글라스 당 50,000 세포) 피브로넥틴 - 코팅 된 커버 글라스 위에 세포를 Replate하고 유지 배양액 95 % 습도, 5 % CO 2에서 설정된 항온 및 37 #176; C.
  6. f를 액틴 세포 골격의 미세 구조의 적절한 보존을 위해, 좋은의 버퍼 시약 (27)에 따라 완충 용액을 사용한다.
    1. 예를 들어, 2 × 원액으로 PHEM 버퍼를 준비 (120 mM의 파이프의 50 mM HEPES, 20 mM의 EGTA, KOH 4 밀리미터의 MgCl 2, pH를 7.0) HEPES 6.5 g, EGTA 3.8 g, 190 mg을 용해하여 진한 KOH 용액을 적하하여 7.0로 조정 된 pH를 2 O의 DDH ~ 300 ㎖, 2에서의 MgCl; 이어서, 500㎖의 발 부피를 가지고 DDH 2 O를 추가한다. , 0.22 μm의 필터를 사용하여 버퍼를 소독 4 ° C에서 보관하고, 1 희석 : 사용하기 전에 DDH 2 O 1이 (가)되었습니다.
  7. F - 굴지의 고밀도 라벨과 최상의 결과를 위해 사용 팔로이 딘은 다음과 같이 세포를 수정, 이러한 세포의 replating 후 원하는 시점에서 알렉사 플 루어 647 등의 유기 형광 물질과 결합 :
    1. 잘 가전을 포함하는 각 문화 미디어를 대기음LL 표본. 부드럽지만 신속 0.25 % 트리톤 X-100으로 PHEM 버퍼 0.25 % 글루 타르 알데히드를 포함 따뜻한 (37 ° C)의 추출 고정 제 2 ㎖를 분배. 2 분 - 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션을. 후속 단계는, 고정 제 2 ㎖를 사용하거나 달리 지시되지 않는 한, 당 커브 글라스 버퍼 급냉.
    2. PHEM 버퍼에 2.5 % 글루 타르 알데히드 정착액으로 추출 정착액을 교체하고 샘플 10 품어 보자 - 12 분. 이것과 다음의 단계는 모두 실온에서 수행된다.
    3. 고정 제 대기음 부드럽게는 PHEM 버퍼로 교체. 틸트 및 소용돌이 부드럽게 한 다음 PHEM 다시 씻는다. 두 번 반복합니다.
    4. 원하는 형광 신호를 압도 PHEM 0.1 %의 질량 농도의 NaBH 4 함유 새로 제조 급냉 버퍼 시험편 부화 수 글루 타르 알데히드에서자가 형광을 켄칭. 넘치 거품이 관찰됩니다. 때때로 disl에 부드럽게 샘플 요리를 누릅니다거품을 odge. 10 분 - 그것은 5 품어 보자.
    5. 담금질 버퍼 대기음 부드럽게는 PHEM 버퍼로 교체합니다. 거품을 멀리 취소 몇 번 씻어. PHEM 2 ㎖에 피펫 버퍼는 5 분 동안 어둠 속에서 배양한다하자. 두 번 반복 할 때 PHEM 버퍼의 표본 휴식을 할 수 있습니다.
    6. DDH 2 O. 10 ㎖ - 페트리 접시는 넉넉한 5에 적신 종이 타월의 조각으로 채워 큰 플라스틱을 사용하여 배양을 Phalloidin의의 습도 챔버를 준비 젖은 종이 타월 위에 깨끗한 파라 필름의 큰 시트를 놓습니다.
    7. 때문에 표지 팔로이 딘의 상대적으로 높은 비용, 각 라벨을위한 작은 볼륨을 사용합니다. 고밀도 라벨링 0.3 μM의 농도로 시작한다. PHEM 버퍼에 팔로이 딘 - 알렉사 형석 647를 사용하여 커브 글라스 당 ~ 60 μl를 준비합니다.
    8. 피펫 55 - 습도 챔버 내의 파라 필름 시트 상 팔로이 딘 용액 60 μL. 미세 집게를 사용하면 부드럽게 표본 coverg를 제거젊은 여자. 올바른 세포 함유 얼굴에 유의주의하십시오.
    9. 빠르고 부드럽게 섬세한 흡수 종이의 접힌 부분과 커브 글라스의 가장자리를 터치하여 여분의 버퍼를 멀리 누른 후 파라 필름에 팔로이 딘 솔루션의 드롭에 아래로 향하게 커브 글라스 세포 측면을 배치합니다. 커브 글라스에 의해 갇혀 기포가 없는지 확인합니다.
    10. 습도 실에 덮개를 놓습니다. 주변 광으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 싸서 챔버, 샘플 4 ℃에서 하룻밤 부화하자. 샘플을 며칠 동안이 상태를 유지할 수있다. 긴 저장을 계획하는 경우 습도 챔버는 습기가 남아 있는지 확인합니다.
  8. 촬영에 앞서, 부드럽게 PHEM 버퍼 2 ㎖ 당 잘 된 새로운 6 웰 플레이트에 가입 커브 글라스 세포 측면을 배치합니다.
  9. 다음의 원액을 사용하여 산소 소기 티올 계 영상 버퍼를 준비한다 : 1 M 글루코스, 1 M의 시스 테 아민 및 100X 포도당 산화 효소 / 카탈라제 효소를 믹스트URE (카탈라아제의 4 mg을하고 텍싱하여 잘 혼합 PHEM 버퍼 100 ㎕, 포도당 산화 효소 10 mg)을 28. 오른쪽 촬상 전에, 1 M 글루코스 용액 75 μL, 1 M 시스 테 아민 용액 30 μL 및 100X 스톡 효소 혼합물의 3 μL를 혼합한다. PHEM 버퍼 300 μL에 볼륨을 조정하고 샘플을 탑재 혼합 후 즉시 사용할 수 있습니다.
  10. iPALM 들어, 사전 세정 # 1.5 커브 글라스 (22 mm 직경)을 사용하여 영상 샘플을 준비한다.
    1. 대안 적으로, 비 점수차 기반 3D-STORM (12) 대신 사용되는 경우, 조립에 도움이 양면 접착 스페이서 유리 슬라이드 (3 "× 1")를 사용한다.
    2. 이미징 샘플을 조립, 부드럽게 잘 버퍼에서 표본 커브 글라스를 제거하는 미세 집게를 사용합니다. 그런 다음, 신속하고 부드럽게 접혀 흡수 종이와 커브 글라스의 가장자리를 터치하여 여분의 버퍼를 멀리 누릅니다.
    3. 깨끗한 렌즈 종이에 위를 향 커브 글라스 세포 측면을 배치합니다. 샘플을 씻어30 배치하여 - 그리고, 샘플에 영상 버퍼의 50 μl를 기울 접혀 흡수 종이로 눌러 여분의 버퍼를 제거합니다.
    4. 헹굼 단계를 몇 번 반복 한 다음 30 배치 - 샘플에 영상 버퍼의 50 μl를. 얼룩은 커브 글라스의 가장자리를 건조 및 건조 지역에 빠른 경화 에폭시의 여러 매우 작은 점을 배치합니다.
    5. 천천히 세포 함유 22 mm의 커브 글라스의 중심 상에 다른 사전 청소 # 1.5 커브 글라스 (일반, 둥근 커브 글라스, 18 mm 직경) 낮 춥니 다. 상기 영상 버퍼는 모세관 작용에 의해 두 coverglasses 젖은하자. 빠른 경화 에폭시의 작은 점은 모두 coverglasses을 준수해야합니다.
    6. 부드럽게 골고루 압력을 확산 접힌 흡수 종이를 사용하여 조립 샘플에 키를 누릅니다. 심지어 샘플 셀 얇고 (<15 μm의)를 만들 수있는 충분한 압력을 사용하지만, 세포를 분쇄 정도로 많지 않다. 뉴턴 링의 패턴을 관찰함으로써 적절한 두께 게이지. 또한,이 일을 수행해야합니다EP 부드럽게 공기 방울을 최소화한다. 필요한 경우, 사전에 빈 coverglasses 여러 번 연습.
  11. 용융 바셀린 - 라놀린 - 파라핀으로 샘플을 밀봉 (29) (VALAP가, 주식, g 바셀린, 라놀린, 파라핀 각각 100에서 준비 함께 용융), DDH 2 O와 함께 밀봉 된 샘플을 씻어, 압축 공기로 바람을 불어 건조. 샘플은 지금 이미징을위한 현미경에 장착하기위한 준비가되어 있습니다.

2. 샘플 배치 및 iPALM 정렬

  1. 샘플 홀더의 제거를 허용하도록 상향 스프링 상부 대물 렌즈를 이동. 샘플 홀더에 단계 1.10에서 제조 된 밀봉 된 시료를 놓고 여러 개의 작은 희토류 자석으로 고정합니다. 촬상 샘플의 양측에 액침 오일을 적용한다. 광학 경로로 다시 샘플 홀더를 놓고 조심스럽게 상단 대물 렌즈를 내립니다.
  2. 여기 레이저를 켭니다. 합니다 (전자 배가 전하 결합 소자에 EMC를 돌려프레임 전송 모드 CD) 카메라.
    1. 적절한 방출 필터에 돌립니다. 상단 빔 경로 (그림 1A)를 차단하고 바닥 빔 경로를 열 수있는 기계식 셔터를 활성화합니다. 압전 액추에이터를 사용하여 조금씩 번역에 의해 초점에 바닥 대물 렌즈를 가져옵니다.
    2. 기점 초점이되면, 하부 빔 경로를 차단하는 동안 상부 빔 경로를 열어 유사한 방법으로 초점 가기 대물 렌즈를 가져온다. 최적의 초점의 컴퓨터 디스플레이의 기점의 폭을 모니터링합니다.
  3. 적절한 자기 중심, 개방 상단 양쪽과 하단 빔 경로하십시오. 바닥 목적 초정밀 나사 세트의 쌍을 사용하여 일정하게 유지되는 동안 기점 이미지 이상적 하나의 화소 내에서, 가능한 한 밀접하게 중첩 될 때까지 수동으로 가기 대물 렌즈를 조정한다.
    1. 그 후, 미세 조정을 수행 EMCCD 픽셀의 10 분 이내 단계의 기점 이미지가 2.3 중첩되도록. 상단 조정제어 소프트웨어를 통해 2 축 압전 미러 마운트 모두 대물 렌즈를 유지하면서 바닥 반사 미러 상수. 프로세스를 안내하는 LCD 화면을 통하여 위쪽의 기점과 하단 대물 뷰의 중심을 비교한다.

iPALM 설치 3. 교정

주 : 형광 방출이 간섭하기 때문에 간섭 iPALM에서 관찰 될 때까지, 경로가 정상으로 길이와 하부 목적이 몇 마이크론 내에서 서로 가까이 있어야한다. 이는 다음과 같이 달성 될 수있다 :

  1. 카메라가 연속적으로 스트리밍 양쪽 상부 및 하부 빔 경로 개방에 레이저를, 400 nm의 크기에 걸쳐 연속 Z 축 진동에 대한 제어 소프트웨어에 의해 생성되는 정현파 전압 파형을 사용하여 샘플 홀더 Z-피에조를 발진 .
  2. 사실을 활용하면, 때 최적의 정렬 밖으로 것을 기점 강도는 t에 작은 변화그 발진 수동으로 인해 원하는 단일 광자 간섭 효과 위아래 기점 진동의 강도까지 전동식 빔 스플리터 조립체 번역. 이 광로 길이의 근접 매칭을 의미한다. > 10의 산곡 비는 최적의 경우 (도 1D)으로 달성 될 수있다.
  3. 간극과 경사 각도를 미세 조정할 작은 단계 빔 스플리터 조립체의 하부 미러 조정 각 표면에서의 진폭 및 위상 모두가 필드에 걸쳐 가능한 한 균일되도록. 800 nm의 이상 8 나노 Z-단계에서 샘플을 변환하여 빔 스플리터 잘 정렬을 수행합니다.
    1. 이러한 카메라 #의 발진 단계 1 상대 카메라 2가 최대화되도록, 이상적으로는 작은 스텝 빔 스플리터 조립체 내의 하부 미러의 높이 위치 및 기울기를 조정하여 3 - 카메라 # 1 사이의 기점 강도 모니터링 120 ° (그림 1B-D)에서.
    2. 초기되면정렬이 완료되면 인근 이미지와 여러 기점에게 모두 셀이보기의 적절한 필드를 검색하기 위해 샘플을 번역합니다. 미광 주위 교란을 차단하는 시스템 주위에 인클로저를 놓습니다. 이미징 영역이 발견되면, 다시 단계 34의 절차를 수행하고, 주요 인터페이스에서 "샘플 피에조 위치 VS 교정 스캔을 취득"명령을 사용하여 후속 Z 좌표 추출에 사용하는 보정 곡선을 기록한다.

4. 데이터 수집

  1. 원하는 영역이 발견되고, 검량선이 획득되면, 소프트웨어에 해당하는 파일명을 입력한다. 상단과 하단 빔 경로를 모두 엽니 다. 최대로 642 나노 레이저의 여기 전력을 증가. 알렉사 형석 647 들어 스위치 오프 형광의 초기 기간 (도 2A)를 필요로 할 수있다.
    1. 시 때까지 5 분, 또는 필요 이상 동안 일정한 642 나노 미터 여기에 노출깜박 ngle 분자 (그림 2B) 관찰된다. 이 소프트웨어는 수집 과정에서 405 nm의 포토 활성화 자동 증가를 허용한다. 필라멘트 기능을 명확하게 볼 수 있도록하기위한 포착 프레임의 큰 숫자는 일반적으로 필요합니다 (> 50,000 프레임). 준비가되면, 메인 인터페이스에서 명령 "시작 iPALM 취득"을 사용하여 RAW 이미지 세트의 인수를 시작.
  2. (도 2b의 예를 참조), 필요에 따라 취득하는 동안 조정은 405 나노 미터의 레이저의 세기를 조절하여 photoactivation 레벨 적절한 점멸 밀도를 유지한다.
    참고 취득이 완료되면, 소프트웨어는 자동으로 적절한 바이너리 포맷으로 화상 파일을 변환한다. 연산 서버의 데이터 저장소는 데이터가 직접 상기 처리가 복사 될 수 있도록, 네트워크 드라이브로 장착된다.

5. 데이터 처리및 분석

  1. 모든 단일 분자뿐만 아니라 기점 11,15,23위한 최적의 매개 변수를 추출하는 사용자 정의 개발 소프트웨어를 사용하여 현지화 분석을 수행합니다. 이것은 X, Y 좌표, 또한 검량선을 분석에 사용되어 강도뿐만 아니라 산출한다.
    1. 명령을 사용하여 단계 3.5에서 획득 한 원시 교정 데이터를 가져 오기 단일 분자 현지화을 수행하기 위해 '파일'메뉴에서 '봉우리 여러 레이블의 압축을 풉니 다 ". 초기 위치 파악 분석에 따라, 하나의 카메라 번호로부터 얻어지는 좌표 - (3)은 각각 적색, 녹색 및 청색 채널에 존재하고, 아래의 명령을 사용하여 추가 분석 "(.sav) IDL로 처리 저장"을 저장할 수있는 " 파일 "메뉴를 선택합니다.
  2. 카메라 # 1에서 데이터를 가져 - (즉, 커버 슬립에 포함 된 형광 기준점을 사용하여 등록에 3 중앙 이미지의 범위를 제공하기 위해 여러 밝은 기준점을 선택 예를 들면,"영상의 변환 '메뉴에서'앵커의 기준점 포인트"명령을 사용하여 그림 1B). 카메라 # 2 레지스터에 카메라 # 1과 # 3을 가져올 것이다 회전과 스케일링 행렬을 계산하는 단계 5.1의 밝은 기점에서 얻은 3 - 현지화가 카메라 # 1에서 좌표의 트리플 세트를 사용합니다. 기점 충분히 많은 수, 고차 다항식 휘어짐이 더 적합 행할 수있다.
  3. 합산 된 원시 데이터를 얻기 위해 함께 3 - 변환 매트릭스가 계산되면, 카메라 # 1의 원시 데이터를 변환. y 좌표와 합산 된 원시 데이터에 각 카메라 채널의 상대적 기여도를 결정하기 위해,보다 정확한 X를 산출하기 위해 현지화 분석의 또 다른 라운드를 수행; 명령이 "이미지 변환"메뉴에서 "원시, 저장 및 저장 합계 (.DAT)를 변환"를 사용합니다. 이 강도 비는 Z 좌표 정보가 포함되어 있습니다.
  4. 밝은 기준점을 선택하고 Z- 수행교정은 "특수 기능"메뉴에서 "작업을 Z 좌표"를 클릭하여 팝업 대화 상자에서 기능 "테스트 바람 포인트 3D"를 사용하여 피팅. 이 검량선을 결정하기 위해 3 개의 카메라 채널의 명암도 3 정현파 함수에 적합 할 것이다. 교정 파일은 메인 데이터 세트에 대한 자세한 사용을 위해 저장됩니다.
  5. 검량선의 품질을 테스트하기 이전에 23 바와 같이 추출 Z 좌표를 수행한다. 교정 데이터 세트가 Z-위치에서 선형 스위프로 촬영하고 있기 때문에 잘 보정 시스템에서 잘 작동 기점를 들어, Z 좌표는 선형 적으로 확장해야합니다. 또한, 모든 기준점의 z 위치는 동일한 기울기로 확장한다.
  6. 양호한 보정이 획득되면, 단계 5.1-5.3에서 설명한 동일한 절차에 따라, 단계 4에서 취득 된 원 화상 데이터 세트 지역화 및 변환 분석을 수행한다. 완료되면, 5 단계에서 보정 파일을로드합니다.(4) 수행 "WND 파일을 선택"과 "특수 기능"메뉴에서 "작업을 Z 좌표"를 클릭하여 팝업 대화 상자에서 "Z는 좌표 추출"기능을 사용하여 추출 Z는 좌표입니다.
    주 : 상기 취득 시간이> 15 분이기 때문에, 기계적 드리프트 예상한다.
  7. X에서 드리프트 보정을 수행하려면, y를, 현지화 좌표에서 밝은 기준점을 선택합니다. 이 기준점은 모든 프레임에 존재해야한다. 그런 다음, "이미지 변환 '메뉴에서'가이드 스타 / 쓰기 테스트"기능을 사용하여 (그림 3A-B) 등록에 다시 동일한 프레임 내에서 다른 모든 좌표를 정렬 기점의 드리프트를 y 좌표, X를 사용합니다. Z 좌표 등록은 "특수 기능"메뉴에서 "작업을 Z 좌표"를 클릭하여 "테스트 가이드 스타"팝업 대화 상자에서 "가이드 스타를 쓰기"기능에 액세스하여 유사하게 수행 할 수 있습니다.
  8. 샘플이 약간의 경사를 나타내고있는 바와 같이, "링크를 클릭 팝업 다이얼로그"XYZ 틸트 삭제 '기능을 사용하여 레벨을 설정해야 할 평면을 정의하는 세 참조 점의 X, Y, Z 좌표를 제공하여 틸트 보정을 수행 특수 기능 "메뉴의"에서 "작업을 Z는 좌표입니다.
  9. 드리프트 및 기울기 보정 이후, 현지화 좌표를 저장합니다. 메인 인터페이스의 "렌더링"명령을 사용하여 추가 분석 (그림 4A-D)에 대한 슈퍼 해상도 이미지를 재구성. 컬러는 Z 좌표를 나타 내기 위해 사용될 수있다. 선택적으로, 선택 영역의 측면도도 표현 될 수있다. 지역화 좌표는 더 정량 텍스트 파일로 내보낼 수 있습니다, 또는 재구성 된 이미지는 .tif 파일로 저장할 수 있습니다.

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Representative Results

iPALM 중요 요건은 광학 시스템의 정렬, 등록 및 교정된다. 추출 Z 좌표에 대한 이들 3 방향 빔 스플리터 내에서 필요한 적절한 간섭을 보장하기 위해 필요하다. 지속적인 모니터링을 사용하려면, 형광의 일정 지점 소스가 필요합니다. 이것은 형광 금 또는 그 포토 루미 국소 표면 플라즈몬 공명 (LSPR)에서 발생하는 이중 금속 나노 입자 (23)를 사용하여 달성 될 수있다. 그들은 조명에 따라 안정적인 단일 다이폴 안테나의 역할을 일반적으로 5 지역화 할 수 있습니다 - 10 nm의 정확도. 이들 시판의 나노 입자는 채도가없는 (도 1b)의 형광체와 기점 모두가 EMCCD 카메라의 여진 강도 및 게인 설정 유사한 이미지화 될 수있는 대부분의 단일 분자 형광의 범위 내의 휘도 레벨을 방출한다. 또한,이 기점 크게 FAC도기점의 외관상의 폭은 상기 포커스 조정시에 모니터링 될 수있다 ilitate 포커싱. 관리법 또는 불완전 세정 coverglasses의 스퓨리어스 배경 형광 용이하게 단일 분자 신호를 압도 할 수 있기 때문에 전술 한 바와 같이 또한 이러한 피라냐 에칭 또는 플라즈마 세정하여 같은 커브 글라스 표면의 엄격한 세정, 또한 필요하다.

iPALM 높은 정밀도 (x의, y)에 PALM 동시에 측정을 Z 좌표를 사용하는 다중 간섭에 의존한다. iPALM 기기에서, 각각의 형광 방출 광자이어서 맞춤 제작 된 3 방향 빔 스플리터에서 자기 간섭 모두 광로를 통해 전파하는 것으로 간주 될 수있다. Z 축 좌표 따라서 간섭 된 광자의 위상 인코딩된다. 120 ~ 3가 camer의 단일 분자 이미지의 강도 변화의 3 방향 빔 스플리터 결과의 출력 빔 °의 상호 위상차검량선으로부터 추출 좌표 - Z는 수있다. 이 정렬 및 교정에 사용될 수있는 나노 Z 정밀도 변환 허용 압전 액츄에이터의 쌍 장착되어 있기 때문에 이것에 기초하여, iPALM 샘플 홀더 어셈블리는, 필수 성분이다.

적절한 초점과 정렬에서, Z 축을 따라 샘플의 번역은 간섭 효과를 생성합니다. 이는 세 개의 카메라 채널 (도 1C-D) 사이의 세기 기점의 진동으로 발현된다. 이러한 진동은 단일 광자의 간섭을 허용하는 상부 및 하부 광 빔 경로 모두가 거의 일치하는 것을 나타낸다. 일반적으로 기기를 켜기에, 각 카메라의 초기 단계는 최적이 아닐 것입니다 및 z 위치의 스캔 교정 및 정렬을위한 진단 도구로 필요합니다. 최적의 단계에서 상기 빔 스플리터의 아래쪽 미러 도착(도 1a)는 압전 팁 틸트 스테이지를 사용하여 조절 될 수있다. 20 나노 미터 조정 - Z 위치의 교정 검사는 각각의 작은 (10) 후 촬영됩니다. 각 채널에서의 기점의 강도는 (즉, 2 차원 가우스 함수로 피팅) 지역화 분석에 의해 결정된다. 총 강도로 정규화 강도는 위상 기간이 계산 될 수 있도록, 정현파에 의해 근사 될 수있다 도 1c에 도시 된 바와 같이, 따라서, 각각의 카메라에 대응하는 위상이 결정될 수있다. 우리 iPALM에서 사용 된 단일 광자 간섭 원리는 훨씬 간단 양방향 빔 스플리터를 사용하여 설명 될 수 있습니다. 그러나, 양방향 빔 스플리터에서 보낸 또는 상쇄 간섭 한계 근처 3D 초 해상 현미경 비실용적이며, 하나의 채널의 신호를 효과적으로는 Z 좌표를 제한하는 강도 및 지역화 좌표 잡음 추정 결과 최소화 울렸다로 결정두 카메라는 상당한 강도 (<100 nm의)가 전자. 이러한 효과를 극복하기 위해 필요한 채널들의 최소 수는 3이고, 3 및 4 방향 투영 시스템 11,30 문헌에 기재되어있다.

최적의 조건 하에서, 3 방향 빔 스플리터를 들어, 3 카메라 사이의 위상 차이는 120 °가되어야한다. iPALM의 3 방향 빔 스플리터는도 1a에 도시 된 바와 같이, 반사 형 3 인터페이스를 포함한다. 빔 스플리터로의 미세 조정은 빔 스플리터 내에서 길이 있도록 최적 위상차를 달성하기 위해, 굴절률 매칭 오일로 채워진 갭 얇은 평평한 유전체 미러 위에 배치된다. 도 1C-D에 도시 된 바와 같이, iPALM 대한 적절한 정렬시, 카메라는 서로 120 °의 위상차에 가깝다. 실제로, 위상차 105 ° 이상이 일반적으로 허용된다. 이러한 교정 모두 산업사시스템이 잘 정렬되도록 icates하고 후속 Z 좌표 추출을 위해 사용될 것이다. 또 다른 기준점을 이용하여 생성 검량선을 평가하는 것이 도움이된다. 적당한 밝기 대부분의 기점은 일반적으로 잘 행동 교정 곡선을 산출 단일 다이폴로 방출한다. 그러나 기점 가끔 집계 (극단적 인 밝기 종종 사람들은) 신뢰할 수없는 보정 곡선을 산출 변칙적 인 방법으로 작동 할 수 있습니다. 이 촬상 영역의 중앙 부근과 iPALM 설정에 사용 된 고 NA 목적 렌즈 보정 플랫 필드가 아닌 특히 때문에 생물학적 관심 영역 (도 1b) 근방 기점을 선택하는 것도 바람직하다. 유효 시야는 필드의 가장자리를 향해 큰 폭 기점으로부터 명백 중앙 영역에 한정된다.

초기 정렬 이후, 바람직 미주리와 세포를 포함하는 필드 -보기좋은 교정을 보장하기 위해 rphology 여러 기점 이미징을 위해 선택된다. 이는 천천히 2 축 서보 모터 드라이브를 사용하여 샘플 홀더를 변환함으로써 달성 될 수있다. 샘플은 항상 완벽하게 평탄하지 않기 때문에 시료의 번역 일부 디 포커싱 될 것이다. 따라서 초점은 지속적으로 번역하는 동안 조정해야합니다. 촬상 영역이 선택되면, 교정의 또 다른 라운드는 검량선이어서 미세 조정 시스템 정렬을 행한다 최적화하고 실제 검량선을 얻었다. 이러한 길이가 Z 좌표 왜곡 상대 경로의 상당한 변화를 야기하기 때문에 중요 이종 굴절률 (예를 들면, 기포)을 핵 또는 근처 영역 아래 영역은, 일반적으로 피해야한다.

고밀도 라벨링 등 알렉사 647 형석 등의 유기 형광 물질로부터의 형광 신호는 매우 밝게 할 수있다. 내가 도시 된 바와 같이,도 2a는 N, 티올 (-SH) 그룹 (31)의 높은 농도를 함유하는 적절한 버퍼를 준비하여, 형광 물질이 빠르게 고 여진 조명하 스위치 오프되어야한다. 이 분자의 대부분에서 형광 신호의 억제를 초래한다. 주어진 예에서, 형광체의 아주 작은 소수는 확률 적를 "ON"상태로 돌아갑니다. 이들은 드문 드문 분산시킬 수있어 하나 하나의 분자 또는 전환하기 전에 몇 프레임으로 시각화 할 수있는 것으로 예상된다 "꺼져." 이 - (647 내지 640)를 photoswitching 역학 여진 강도 및 -SH의 농도에 따라 크게 의존적이며, 따라서, 특정 시스템의 경우, 치료는 특히 비교적 높은 여진 강도가 있기 때문에, 적절한 표시 밀도를 최적화하기 위해 수행해야 알렉사 플 루어 647 분자의 대부분을 전환 할 필요가 있었다. 여기가 충분히 강한 알렉스 플 루어 647 의지의 상당 부분이 아닌 경우높은 배경의 결과로, "ON"상태로 유지, 궁극적으로, 품질이 낮은 단일 분자 현지화 결과를 단일 분자 형광을 관찰하고, 어려움. 각 분자가 명확한 탐지 및 현지화 분석을 허용 할 정도로 부족한 상태에서 적절하게 균형 잡힌 상태에서, 단일 분자 원시 데이터는, 프레임 (그림 2B) 당 분자 (수백)의 충분히 큰 수를 포함해야합니다. 그것은 iPALM 들어 photoswitching의 원리 PALM 또는 STORM 동일하다 또한 무가치, 따라서 적절 iPALM 작성된 샘플 직접 간단한 3D-PALM 또는 3D-STORM 시스템에서 사용될 수있다. 나이 퀴 스트 샘플링을 만족하는 분자의 충분히 높은 밀도를 얻기 위해, 일반적으로 원시 데이터 50,000 이상의 프레임이 요구된다 (즉, 3 개의 카메라에 대한 총 15 프레임). 인수가 진행됨에 따라, 형광의 증가 비율은 스파링 결과, 파괴 광표백에 의해 고갈 될 수있다산이 단일 분자 밀도. 이를 보상하기 위해, 405 nm의 청색광 (405 ㎚)의 짧은 펄스는 형광 활성화를 촉진하기 위해 간격으로 시료에 조사 할 수있다.

때문에 필요한 긴 획득 시간에 최적의 iPALM에 대한 결과 (또는 일반적으로 단일 분자 현지화 현미경) 낮은 샘플 드리프트 및 / 또는 좋은 드리프트 보정이 필요합니다. 예를 들어, 프레임 전송 모드 (20 Hz의 프레임 레이트) 50 밀리의 노출 시간을 사용하여, 5 프레임에 대한 총 획득 시간은 42 분이다. 이 기간 동안, 수십 ㎚ 이상의 기계적 드리프트 예상된다. 실제로, 높은 위치 파악 정확성과 높은 표시 밀도 외에, 해상도는 드리프트 보정 품질에 의존한다. 열 변동이 주요 원인 인 이러한 드리프트 여러 기원이 있습니다. 인해 iPALM 부품 인바, 저 열팽창 합금, 또는 스테인레스 스틸을 사용하여 사용자 - 기계 가공이 가능한 대가로,이는 모두 황동, 알루미늄보다 낮은 열팽창 특성을 갖는다. 불행하게도,이 또한 기계 훨씬 저렴하고 쉽게되고, 현미경 구성 요소에 대한 더 일반적으로 사용되는 금속 알루미늄에 추가 비용이 상대적를 부과한다. 드리프트의 다른 소스는 주변 장치, 주변 환경, 또는 공기 흐름에서 기계적 진동이 될 수 있습니다. 이들은 적절한 케이스에 시스템을 배치하여 상기 현미경 영역에서 공기 흐름의 방향 재 지정함으로써 최소화되어야한다. 가능한, 팬 함유 성분이 광학 테이블을 배치해야하는 경우 설치 프로그램은 연구 등급 광학 테이블에 구축되어야한다. 그럼에도 불구하고, 모든 예방 조치에도 불구하고, 드리프트 어느 정도는 유지됩니다. 결정적으로, 이러한 감도 이미지는 획득 시간에 걸쳐 포커스 유지되도록 최소화되어야한다. 우리의 시스템에서, 이러한 수동 방법은 허용 가능한 수준으로 드리프트를 최소화하기 위해 충분하다. 그러나, 활성 드리프트 COM을 구현할 수 있어야보정 : 방법은 장기 및 고정밀 화상 (32)을 사용한다.

세트 당 천만 단일 분자 피크 - 원시 데이터의 처리에 따라, 3 차원 좌표 위치 파악은 통상적으로 5를 얻을 수있다. 도 3에 도시 바와 같이, 시간의 함수로서의 드리프트는 기점의 위치 파악 좌표에서 가시화 될 수있다. 다중 기점 평균 드리프트 보정 궤도 (도 3A-B)를 계산하기 위해 사용될 수있다. 또한, 현지화 분석시 2 차원 가우시안 함수에 제대로 맞는 피크를 필터링하는 것이 관례이다. 이 가짜 소음 또는 부분적으로 중복 단일 분자 피크로 인해 수 있으며 피팅 과정에서 계산 된 큰 잔류 제곱 오차에 의해 구별 될 수있다. 따라서 낮은 밝기 (광자 계수로 나타낸 바와 같이)과, 높은 불확실성과 봉우리 (즉, ~ 25 나노 미터보다 큰) 또한, 필터링됩니다이러한 가능성 비특이적 백그라운드 형광으로부터 발생이야. 얻어진 Z 좌표가 신뢰할 마찬가지로, 3 개의 카메라 채널의 강도가 검량선을 제대로 맞게되는 피크는 거절된다. iPALM (및 일반적으로 위치 파악 현미경)의 전체 정보 콘텐츠가 형광 좌표, 또한 이러한 단 강도, 폭, 밝기, 여러 추가적인 파라미터뿐만 아니라, 그 분석 결과를하기 때문에, 대규모 인 것을 주목해야한다 실제로, 이후 상대적으로 적은 계산 도구 좌표 공간에서의 분석을 위해 현재 사용할 수있는 현지화 좌표는 일반적으로 렌더링 또는 추가 분석을 위해 픽셀 기반의 이미지로 재구성된다.

iPALM 이미지 재건을 위해 일반적으로 사용되는 방법은 가우로 설정 한 현지화 불확실성, 각각의 현지화가 정규화 된 2 차원 가우시안 함수로 좌표를 표현하는 것입니다ssian 폭 33. 저 정밀 좌표 값 (전형적으로 낮은 밝기 높은 배경 단일 분자 피크) 조광기 및 광범위한으로 표시하면서 따라서, 고정밀도의 좌표 (낮은 배경 고휘도 일반적으로 단일 분자 피크), 날카로운 좁은 피크를 나타 봉우리. 이러한 방식으로, 각 분자는 이미지 강도의 동일한 양에 기여한다. 3 차원 데이터 세트를 들어, Z 좌표는 통상적으로 색조 스케일 (도 4c-D)에 기초하여 컬러를 사용하여 표현 될 수있다. 선택적으로, 이미지는 측면도 (X, Z 또는 Y, Z)로 투영 또는 볼륨으로 나타낼 수있다. 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어의 수는 이러한 데이터 (34)를 시각화 할 수있다.

도 4-6에 도시 된 바와 같이, iPALM 이미지 회절 제한된 형광 현미경에 비해 상당한 개선을 얻었다. HUVEC 세포의 F 액틴 구조는 매우 향상된 공간 RESO 가시화 될 수있다lution. 스트레스 섬유, 번들 및 lamellipodia에서 조밀 F - 굴지 네트워크가 사상 질감을 가지고 관찰되는 반면, 개별 필라멘트가 구별되지 있지만 피질의 지역에서 별개의 필라멘트의 네트워크는, 볼 수 있습니다. 이것으로 인해 형광체의 휘도 및 위치 파악 정확성 모두 한계 쉽다. 별개 피질 필라멘트의 존재는 F 액틴 네트워크의 미세 구조가 충분히 잘 보존 된 것을 시사; 따라서, iPALM는 대뇌 피질의 구조를 특성화하기위한 유용한 도구가 될 수 있습니다. 도 5에서, HUVEC 세포의 하위 영역 정량 액틴 필라멘트의 정보와 함께 표시된다. 이 필라멘트의 z 히스토그램 iPALM가 Z 해상도 대하여 상당한 해상도 향상을 얻을 수 있음을 도시하는, 횡 방향 (X, Y) 뷰 ~ 45 ㎚에 비해 상대적으로 작은 폭이 약 15 nm 인 것을 알 수있다 는 x, y를 평면은 예상대로. 그러나, ACTU 이후F 액틴 등의 입경은 관찰 된 섬유는 단일 필라멘트 또는 몇 필라멘트 다발인지 불분명 ~ 8 ㎚이다. 이 방법은 F - 굴지 아직 23을 연구하기 위해 적용되지 않은 있지만 상호 이미징, iPALM를 사용하여 EM은 F - 굴지 건축의 또 다른 특성에 유용한 전략이 될 수있다.

그림 1
그림 1 : iPALM 3-D 슈퍼 해상도 현미경의 회로도. iPALM 광학의 A) 회로도. 이중 대물 렌즈 (니콘, NA 1.49 60X)는 각 방출 형광 광자 상부 및 하부 광 빔 경로 모두를 통해 전파 될 수 있도록, 그들은 22.5 °로 배향 된 미러 쌍에 의해 상기 빔 스플리터에 방해로 리디렉션된다. 자기 간섭 광자의 위상 따라서 형광의 Z 좌표 인코딩 ΔZ에 정비례하고, 우리를 측정 할 수있다세 개의 출력 광선들 간의 ~ 120 °의 상호 위상차를 갖는 3 방향 빔 스플리터를 보내고. 그들은 튜브 렌즈 (L1-L3, F = 400 ㎚)에 의해 집광 및 배출 필터에 의해 필터링 (F1 - F3). 각각의 단일 분자 따라서 y 좌표, 카메라 (EMCCD1-3)과 비슷하지만 X에서 다른 강도로 나타납니다. (A) 재생 및 참고 문헌에서 수정했습니다. 알렉사 플 루어 647 밝은 관광 명소와 F - 굴지 표지 HUVEC 세포의 11 (B) 회절 제한 이미지는 금 나노 입자의 기점을 나타낸다. 카메라 1의 위상 각 -, 3- - 3 카메라 # 1 사이의 위상차 각 기점을 중심으로 각각 적색, 녹색 및 청색 라인으로 표시된다. 스케일 바 :. 5 μm의 (C)에 간섭 효과를 보여주는 케이트 표준 이미지. (맨 아래 행에 나노에서,)은 z 위치로 촬영 한 각각의 카메라 (CCD1-3) 또는 총 (합)를위한 금 나노 입자 기점의 이미지는 교정 검사한다. 개 내에서 강도(B). (D) iPALM 검량선에 나타낸 바와 같이 CH 카메라는 위상 관계 진동을 알 수있다. 샘플은 Z 축을 따라 변환된다. EMCCD1-3을위한 금 나노 입자 기준점의 강도는 적색, 녹색, 청색 라인 각각 (위)로 표시됩니다. 이들은 다음 정규화 및 위상 차이 (아래)를 결정하는 데 적합. 정렬하는 동안, 시스템은 세 개의 카메라들 사이의 최대 위상 차이를 달성하기 위해 조절된다. 교정 곡선의 추출에 사용하기 위해 각 이미지 사이트에서 가져온 것입니다은 z 좌표를 각각의 단일 분자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : Photoswitching 알의 단일 분자 이미징굴지의 레이블로 EXA 플 루어 647 - 팔로이 딘. (A) 초기 photoswitching 단계. 고정 된 세포에서 F - 굴지 대부분의 형광의 빠른 스위치 오프에 티올 함유 이미지 버퍼 결과에 알렉사 플 루어 647 높은 강도 조명에 접합 Phalloidin의에 의해 고밀도로 표시된다. (B) 원시 단일 분자의 대표 프레임 프레임입니다. 정상 상태 점멸에서 활성화 된 알렉사 플 루어 647은 각각의 단일 분자는 PSF 크기의 자리로 표시 충분히 희소해야한다. 역 콘트라스트 나타낸 (A)에 도시 된 바와 같은 세포의 사진. 스케일 A의 바, B :. 5 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : Multip를 사용하여 편차 수정. 제작 기점 현지화 네 개의 기준점 좌표가 (A, x 좌표, B가, y 좌표) 다항식 피팅을 사용하여 드리프트를 계산하는 데 사용되었다 (5 순서 번째, 오른쪽 상단 모서리에 맞게 매개 변수). 평균 표류 궤도 하위 5 나노 미터 정밀도 편차의 보정 할 수 있습니다 (X를 : 3.085 nm의, Y : 3.606 ㎚). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : iPALM 3-D의 F - 굴지 구조의 시각화. (A) 알렉사 형석-647 표지 팔로이 딘에 의해 F 액틴과 HUVEC 세포의 회절 제한된 이미지 (도 2의 셀의 서브 영역에 대응). 밝은 장소는 금 나노 입자 기점 때문이다. (C)의 영역 iPALM 분석 재구성 iPALM 이미지에 의해 결정 좌표를 2 차원 가우스 폭을 파악 불확실성에 대응하여 렌더링 좌표. 다음은 컬러 바에 따라 착색 Z는 좌표입니다. 고밀도 및 저밀도 사상 기능 영역을 알 수있다. 스케일 바 (AC) : 1 ㎛ (D) 확대 된 사상 피질 굴지 토폴로지를 보여주는 C에서 박스 영역의보기.. 스케일 바 :. 250 nm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : iPALM 시각화 F - 굴지의 나노 치수. (A) F - 굴지 표시 b를 재구성 iPALM 이미지 HUVEC 세포 Y 알렉사 플 루어 647 - 팔로이 딘. 색상은 색상 막대에 따라 Z 좌표를 나타냅니다. 스케일 바 :. 1 ㎛ (B) ×의 가로 단면 히스토그램, Y-지역화의 박스 영역의 장축 (A)에 따라 조정합니다. 히스토그램을 얻으려면 좌표가 상자의 긴 축에 투영하고 5 나노 빈 - 크기 비닝된다. 회색 곡선은 절반 최대 43.88 nm 인 (FWHM)에서 전체 폭, 히스토그램에 가우스 최적를 나타냅니다. 현지화의 z 위치 (C) 히스토그램 (A)의 박스 영역에서 조정합니다. Z 축 위치는 1 nm의 빈 크기로 비닝된다. 회색 곡선은 17.50 nm의 FWHM와 히스토그램에 가우스 가장 적합한을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6 :. F - 굴지의 iPALM 영상의 비교 다른 레이블 시약을 사용하여 알렉사 플 루어 647 - 복합 팔로이 딘 (A), 알렉사 플 루어 568 - 복합 팔로이 딘 (B)를 사용하여 표시된 F - 굴지의 재구성 iPALM 이미지, 또는 액틴과 형질 전환에 의해 -mEos2 융합 단백질 발현 벡터 (C). 스케일 바 (AC) :. 1 ㎛ 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

도 1a에 도시 된 바와 같이 iPALM의 광학계는, 4 π 이중 대향 대물 설계에 기초한다. 1에 이전 (23) 설명 및 나열된 설정은 사용자 정의 가공 및 상업 모두 광학 기계 부품을 사용하여 구성된다. 우리의 설치뿐만 아니라, 하워드 휴즈 의학 연구소 (HHMI)는 Janelia 연구 캠퍼스에서 고급 이미지 센터에서 과학계에 액세스 할 수있는 시스템을 호스팅합니다. 전체 기계 도면, 제어 회로도 및 소프트웨어의 경우, 독자는 자세한 내용은 HHMI에서 랄드 헤스에 문의하는 것이 좋습니다. F 액틴을 시각화 iPALM뿐만 아니라 다른 단일 분자 파악 현미경 방법을 사용하는 주요 장점은 EM의 일반적 거친 샘플 처리를 필요로 기술 힘들고 준비, 숙련 된 실무자 3,23 비교 샘플 준비의 상대적 용이성 . AdditionallY는 형광 EM 어려운 남아 멀티 채널 영상에 자연스럽게 의무입니다. 추가로 후술되는 바와 같이 그럼에도 불구하고, 시료 준비 및 화상 형성 공정의 관점에서 모두 접근을위한 여러 전류 제한이있다. EM 샘플 준비를위한 경우와 같이 먼저,주의가 나노 수준에서 심각한 교란을 일으킬 수있는 해상도의 회절 제한 레벨에 적합한 프로토콜 이후, 시편 (35)의 양호한 미세 구조의 보존을 보장하기 위해주의해야한다. 액틴 이미징, 세포의 적절한 고정은 시편의 품질에 영향을 미치는 중요한 요소이다. 항체와 공동 얼룩의 경우, 에피토프 사이트가 영향을받을 수 있지만 그것은 아주 잘 세포 골격과 멤브레인을 유지하기 때문에 글루 타르 알데히드는 바람직한 정착입니다. 더 나은 항체 에피토프 부위를 보존하는 경향이 같은 경우에는, 파라 포름 알데히드가 허용 타협을 제공 할 수있다. 중요한 것은 단일 분자 현지화 현미경을 위해,이 고정 제는 경향이있다배경 형광도를 생성하는 단계; 따라서 보로 하이드 라이드에 의한 고정 이후 담금질, 특히 글루 타르 알데히드의 경우에 필요하다.

또한 형광 및 표지 전략의 적절한 선택은 성공적인 실험 중요한 요인들이다. 나이 퀴 스트 샘플링 정리 (36)에 의해 규정 된 때문에 F 액틴의 나노 사이즈로 라벨 고밀도는 기본적인 사상 네트워크를 포착해야한다. 액틴 들어 팔로이 딘은 여러 업체에서 제공 유기 형광의 넓은 범위로 매우 높은 밀도 라벨링 할 수있다. 팔로이 딘은 독성 때문에, 셀 및 permeabilization 정착이 필요하다. 라이브 셀 호환 굴지 라벨의 대체 전략은 단량체 굴지 또는 작은 액틴 결합 폴리 펩타이드와 중, 형광 단백질 (FP)의 융합을 사용하는 것을 포함한다. 그러나 이러한 (팔로이 딘에 비해 낮은 라벨 밀도를 산출하는 경향이 발견 (37)에 의해 살아있는 세포에 도입하지만,이 방법은 많은 비용과 노동력이 될 것으로 예상 될 수 있다는 점에 유의하라. 형광의 측면에서, 알렉사 형석 647은 일반적으로 현지화 현미경 지속적으로 좋은 성능을 제공하는 것으로 확인되었습니다. 이는 단일 분자 피크와 형광 배경 (38) 사이의 콘트라스트 비 - 밝기 지수의 관점에서 설명 될 수있다. 배경이 누적 파악 정확성을 저하시킬 수 있기 때문에 높은 라벨 밀도, 높은 콘트라스트 비를 필요로한다. 이하 일관된 결과가 강력한 photoswitching 성능을에서 제공하는 알렉사 플 루어 647, 비교와 함께하지만, 우리의 경험에서, 이러한 ATTO488, ATTO520, 알렉사 플 루어 568 (그림 6B)와 같은 여러 가지 다른 형광,,,은 F - 굴지을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다 영상 버퍼 광범위한 조건.

39. 이 동등하게 iPALM의 장점과 한계에 적용됩니다. 다른 3 차원 슈퍼 해상도 현미경 기술에 비해 iPALM는 X, Y 해상도 11보다 약 2 배 더 Z 축 해상도, 특히 z 축을 따라, 지금까지 최고 해결 광학 방식을 유지하고있다. 검량선은 주기적이기 때문에, 높은 해상도, Z 간섭계에 iPALM의 의존도는 또한 촬상 깊이에 대한 제한을 부과한다. 즉, Z 좌표마다 250 nm의 정도 (알렉사 형석 647 ~ 700 nm의 발광 대 파장)을 반복한다. 실제로, 이것은의 산장 깊이 내에서 여진 구역을 제한 TIRF 조명을 사용함으로써 해결 될 수있다 <커브 글라스에서 200 나노 미터. 시편 흥분하지 않으며 눈에 보이지 않는 남아에 따라서, 깊은 형광. 그러나,이 또한 더 많은 내부 구조의 손이 닿지 않는 반면, 같은 초점 유착, 대뇌 피질의 세포 골격 및 복부 세포막과 커브 글라스에 근접들로 이미지화 할 수있는 생물학적 구조를 제한합니다. 고정 된 시료를 들어, 하나의 구제 (40) 냉동 절편 수행하는 것입니다. 그러나, 이러한 접근 방식은 매우 힘든이며, 일반적으로 액세스 할 수없는 전문 지식을 필요로한다.

대안 적으로, 3 차원 iPALM 폭풍에 사용 된 비 점수차 방식 - 디 포커스 (12)과 간섭을 결합하여 확장 범위 (Z)에 대해 적응 될 수있다. 이러한 접근 방식은 이중 Z 좌표 판독 고정밀하지만 주기적 간섭에 의해 상기 제, 덜 정확하지만, 비 주기적 점수차 디 포커스에 의한 제를 제공한다. 후자는 "언 래핑"또는 퇴화를 파괴하는 데 사용될 수간섭계 Z 좌표, 따라서 효과적으로 높은 NA 대물 렌즈의 초점 심도 극한 접근은 ~ 750 ㎚에 iPALM 촬상 깊이 배화를 가능하게한다. 위상 언 래핑으로 iPALM 인해 추가 40 디 포커싱을 3 차원으로 약간 감소 정밀도이라도 같은 미토콘드리아 깊은 샘플 내의 화상 구조에 사용되어왔다.

iPALM의 다른 본질적인 한계는 촬상 속도이다. 프레임이 많은 수의 위치 파악 좌표의 높은 밀도를 얻기 위해 필요하기 때문에, 카메라의 속도 인수 속도에 제한이 일반적이다. 현재 EMCCD 카메라는 10에서 실행으로 - 20 MHz의 판독 속도, 분 수십 프레임의 충분한 수의 필요합니다. 이러한 긴 시간 규모는 표본이 고정되어야합니다. 여기서, 예 훨씬 빠르게 과학적 상보성 금속 산화물 반도체 (sCMOS) 카메라와 같은 카메라 기술의 최근 발전은, IM의 급격한 증가를 가능하게 할 수있다이 iPALM 아직 구현되지 않았지만, 속도 41 노화. 일부 단일 분자 파악 현미경 방식의 경우, 고밀도 단일 분자 필드 변형 알고리즘 (42)을 사용하여 분석 또는 43 감지 압축 될 수있다. 이러한 전략의 적응도, 따라서, 더 적은 프레임을 조밀 단일 분자 영상시킴으로써 iPALM 속도를 높이고있다.

공간 해상도의 속도 및 이미징 범위의 제한 및 강점으로, iPALM의 주요 응용 프로그램은 특정 단백질 14,15,44의 나노 조직을 공개하는 형광 라벨의 장점을 활용하는 미세 방법으로합니다. 또한 개선, 모두 광학 및 형광 기술의 관점에서, iPALM 공간 해상도에서 더 향상을 가능하게한다. 예를 들어, iPALM 이미지 처리는 현재 2 차원 가우스 함수에 의해 모델링 된 바와 같이 각각의 단일 분자와, 비교적 간단한 일차 근사 방법을 이용하는을로 소비되는 동위 원소 다이폴 평균. 이것은 상당히 공간 해상도를 향상시키는 점 - 확산 함수와 다이폴 방향 또는 시야각에 걸쳐 광학 수차의 명확한 치료보다 정확한 모델을 이용하는 최근의 방법으로 증강 될 수있다. 마찬가지로, photocaging는 크기 45의 주문에 의해 형광의 밝기를 향상하는,보고되었다. 자신의 미세 조직의 핵심 요소가 잘 특성화 된 이후 실제로는 F-액틴 세포 골격은 iPALM에 추가 방법론 개발을 테스트하기위한 매우 가치있는 모델 시스템이 될 수 있습니다. 사실 EM 수준의 해상력과 광학 현미경에 의해 단백질 조직을 분석 할 수있는 능력은 크게 세포의 구조와 기능의 무수한 측면에 대한 우리의 이해를 향상시킬 것으로 예상된다.

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Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgments

YW 및 PK는 감사 PK (NRF-NRFF-2011-04 및 NRF2012NRF-CRP001-084)에게 수여 싱가포르 국립 연구 재단에서 자금 지원을 인정합니다. 우리는 또한 인프라 지원을위한 MBI 개방 실험실과 현미경의 핵심 시설을 주셔서 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
optical table Newport, CA RS4000 iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators
vibration isolator for optical table Newport, CA S-2000
laser-642 Newport, CA 1185055 output power=100 mw
laser-561 Newport, CA 1168931 output power=200 mw
laser-488 Newport, CA 1137970 output power=200 mw
laser-405 Newport, CA 1142279 output power=100 mw
broadband dielectric mirrors Thorlabs, NJ BB1-E02 laser combiner
dichroic beamsplitter Semrock, NY LM01-427-25
acousto-optic tunable filter AA Opto-Electronic, France AOTFnC-VIS-TN
Linear polarizer Newport, CA 05LP-VIS-B
baseplate local workshop customized
turning mirror (22.5°) Reynard Corpporation, CA customized 22.5° mirror
motorized optic mounts New Focus, CA 8816
motorized XYZ translation stage Thorlabs, NJ MT3/M-Z6 sample holder
T-Cube DC servo motor controller Thorlabs, NJ TDC001
Piezo Phase Shifter Physik Instrumente, Germany S-303.CD
objective lens Nikon, Japan MRD01691 objective. Apo TIRF 60X/1.49 oil
translation stage New Focus, CA 9062-COM-M
Pico Motor Actuator New Focus, CA 8301
rotary Solenoid/Shutter DACO Instruments, CT 5423-458
3-way beam splitter Rocky Mountain Instruments, CO customized beamsplitter
Piezo Z/Tip/Tilt scanner Physik Instrumente, Germany S-316.10
motorized five-axis tilt aligner New Focus, CA 8081
Picmotor ethernet controller New Focus, CA 8752
Piezo controllers/amplifier/digital operation module Physik Instrumente, Germany E-509/E-503/E-517
band-pass filter Semrock, NY FF01-523/20 filters
band-pass filter Semrock, NY FF01-588/21
band-pass filter Semrock, NY FF01-607/30
band-pass filter Semrock, NY FF01-676/37
notch filter Semrock, NY NF01-405/488/561/635
motorized filter wheel with controllter Thorlabs, NJ FW103H
EMCCD Andor, UK DU-897U-CSO-#BV 3 sets
Desktop computers for controlling cameras and synchronization Dell Precision T3500 PC, 4 sets
coverslips with fiducial Hestzig, VA 600-100AuF sample preparation. fiducial marks with various density and spectra available
fibronectin Millipore, MT FC010
paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, PA 15710 fixation. 16%
glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences, PA 16220 25%
triton X-100 Sigma aldrich, MO T8787
HUVEC cells Life Technologies, CA C-015-10C
Medium 200 Life Technologies, CA M-200-500
Large Vessel Endothelial Factors Life Technologies, CA A14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 14190367
Pennicillin/Streptomycin 15140122
Trypsin/EDTA Life Technologies, CA 25200056
PIPES Sigma aldrich, MO P1851 PHEM
HEPES 1st base, Malaysia BIO-1825
EGTA Sigma aldrich, MO E3889
MgCl2 Millipore, MT 5985
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen, CA A22287 staining
sodium borohydride (NaBH4) Sigma aldrich, MO 480886 quenching
glucose 1st base, Malaysia BIO-1101 imaging buffer
glucose oxidase Sigma aldrich, MO G2133
catalase Sigma aldrich, MO C9322
cysteamine Sigma aldrich, MO 30070
Epoxy Thorlabs, NJ G14250
vaseline Sigma aldrich, MO 16415 sample sealing
lanolin Sigma aldrich, MO L7387
parafin wax Sigma aldrich, MO 327204
Immersion oil Electron Microscopy Sciences, PA 16915-04 imaging. Cargille Type HF

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References

  1. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
  2. Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
  3. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
  4. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  5. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
  6. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
  7. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
  8. Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
  9. Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
  10. Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
  11. Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
  12. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
  13. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
  14. Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112, (35), E4864-E4873 (2015).
  15. Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
  16. Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32, (2), 139-154 (2015).
  17. Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
  18. Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
  19. Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
  20. Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
  21. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-492 (2010).
  22. Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
  23. Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
  24. Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
  25. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
  26. Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).
  27. Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry. 5, 467-477 (1966).
  28. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
  29. Shin, W. D., et al. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
  30. Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
  31. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
  32. Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
  33. Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. Visualization of Localization Microscopy Data. Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).
  34. El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
  35. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
  36. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
  37. Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
  38. Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
  39. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
  40. Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
  41. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
  42. Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279 (2011).
  43. Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
  44. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
  45. Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).

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