सेल वंश मार्करों के सह स्थानीयकरण और टमाटर सिग्नल

Developmental Biology

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Summary

इम्यूनोफ्लोरेसेंस साथ 2.3Col1a1-GFP के साथ एक (विशिष्ट अस्थिकोरक करने के लिए) और एक (अस्थि कोशिकाओं के लिए विशिष्ट): हम दो Rosa26 tdTomato (सर्वत्र सभी कोशिकाओं में व्यक्त) / Cre (विशेष chondrocytes में व्यक्त) चूहों में संयोजनों ट्रेसिंग के सेट विकसित की है। डेटा अस्थि कोशिकाओं में chondrocytes के प्रत्यक्ष परिवर्तन प्रदर्शित करता है।

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Jing, Y., Hinton, R. J., Chan, K. S., Feng, J. Q. Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal. J. Vis. Exp. (118), e54982, doi:10.3791/54982 (2016).

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Abstract

सेल वंश अनुरेखण प्रणाली विकासात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन में मुख्य रूप से इस्तेमाल किया गया है। Cre recombinase के उपयोग के लिए एक विशेष सेल लाइन और सभी संतान में रिपोर्टर के सक्रियण के लिए अनुमति देता है। यहाँ, हम दिखाना है कि chondrocytes सीधे लंबी हड्डी और जबड़े कंद विकास Cre, Col10a1 Cre और Aggrecan-CRE ERT2 (Agg-CRE ERT2) के दो प्रकार का उपयोग दौरान अस्थिकोरक और osteocytes में बदलना सेल वंश तकनीक अनुरेखण इस्तेमाल किया, Rosa26 के साथ पार tdTomato। दोनों Col10 और aggrecan chondrocytes के लिए अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त हैं मार्करों।

इस आधार पर, हम एक नई विधि-सेल वंश विशेष सेल मार्कर की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करके फ्लोरोसेंट immunohistochemistry करने को परिभाषित सेल भाग्य के साथ संयोजन के रूप में विकसित किया अनुरेखण। Runx2 (प्रारंभिक अवस्था osteogenic कोशिकाओं के लिए एक मार्कर) और Dentin मैट्रिक्स protein1 (DMP1; देर चरण osteogenic कोशिकाओं के लिए एक मार्कर) थेउपास्थिकोशिका व्युत्पन्न अस्थि कोशिकाओं और उनके भेदभाव स्थिति की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया। इस संयोजन न केवल सेल वंश ट्रेसिंग के आवेदन broadens, लेकिन यह भी यौगिक चूहों की पीढ़ी को सरल। इससे भी महत्वपूर्ण बात, माता पिता सेल संतान की संख्या, स्थान, और भेदभाव स्थितियों को एक साथ प्रदर्शित कर रहे हैं, सेल वंश अकेले ट्रेसिंग की तुलना में अधिक जानकारी प्रदान करते हैं। अंत में, सेल वंश अनुरेखण तकनीक और immunofluorescence के सह आवेदन vivo में कोशिका जीव विज्ञान की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

Introduction

विकास के दौरान, endochondral हड्डी गठन कंकाल की मात्रा का 80% से अधिक के लिए खातों। यह व्यापक रूप से माना जाता है कि यह hypertrophic chondrocytes की apoptosis के साथ शुरू होता है। बाद में, अंतर्निहित अस्थि मज्जा से कोशिकाओं पर आक्रमण और angiogenesis, हड्डी marrow- और periosteum व्युत्पन्न कोशिकाओं 1,2 द्वारा नई हड्डी बयान से पीछा आरंभ करें। Hypertrophic chondrocytes की सेल भाग्य (एचसीएस), तथापि, दशकों 3 के लिए बहस का एक मुद्दा रहा है। प्रारंभ में, HCS उपास्थिकोशिका भेदभाव मार्ग के अंत माना जाता था, और apoptosis आम तौर पर HCS के अंतिम भाग्य होने लगा था। अब, कुछ शोधकर्ताओं का सुझाव है कि कम से कम कुछ HCS जीवित है और endochondral हड्डी गठन के लिए योगदान कर सकता है। हालांकि वे कहते हैं कि विकास का प्रस्ताव प्लेट chondrocytes फैटी, immunohistochemical धुंधला के आधार पर अस्थिकोरक में transdifferentiate करने की क्षमता थी, और इन विट्रो में 46 अध्ययन, इन तरीकों में से कोई भी wअस्थिकोरक वंश को उपास्थिकोशिका योगदान के प्रदर्शन में निश्चित अरे।

सेल वंश अनुरेखण तकनीक सेल भाग्य का अध्ययन करने के लिए एक और अधिक कठोर हो गए हैं। संक्षेप में कहें, तो recombinase एंजाइम है, जो केवल सेल का एक विशिष्ट प्रकार में व्यक्त किया जाता है, रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति को उत्तेजित करता है। इस रास्ते में, सेल के इस प्रकार के और उनके वंशजों को स्थायी रूप से चिह्नित कर रहे हैं 7। Cre पर loxP प्रणाली सामान्यतः वंश का पता लगाने में किया जाता है। Cre (recombinase एंजाइम) दो loxP साइटों के बीच रोकें अनुक्रम आबकारी एवं एक विशेष सेल लाइन (चित्रा 1 ए) में रिपोर्टर को सक्रिय करेंगे। कुछ मामलों में, अन्वेषक एस्ट्रोजन रिसेप्टर (सीआरई ERT2) 8 का एक संशोधित रूप को फ्यूज करने के लिए Cre के कारण इस तरह के tamoxifen के रूप में एक दवा का उपयोग करके Cre सक्रिय करने के लिए एक अनुकूल समय बिंदु का चयन कर सकते हैं। फ्लोरोसेंट संवाददाताओं प्रयोगों अनुरेखण क्योंकि वे नाटकीय रूप से जटिलता को कम वंश में मानक बन गए हैंऔर सटीकता और सेल भाग्य 8,9 ट्रेसिंग की दक्षता में सुधार होगा। tdTomato फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के बीच में सबसे अच्छा विकल्प बनने के बाद से यह प्रतिभाशाली फ्लोरोसेंट प्रोटीन और मजबूत epifluorescence है, जिससे यह आसानी से कल्पना 7 (चित्रा 1 ए) है।

Rosa26 tdTomato वंश अनुरेखण प्रणाली का उपयोग करके, हमारे समूह और अन्य जांचकर्ताओं से पता चला है कि एचसीएस विकास 10-14 के दौरान अस्थि कोशिकाओं में उनके phenotype बदल सकते हैं। 2.3Col1a1-GFP (अस्थिकोरक के लिए विशिष्ट) और immunofluorescence (अस्थि कोशिकाओं के लिए विशिष्ट): यह पूरा करने के लिए, हम Rosa26 tdTomato (सर्वव्यापक अभिव्यक्ति सभी कोशिकाओं में) / CRE (chondrocytes के लिए विशिष्ट) चूहों के साथ संयोजन ट्रेसिंग के दो सेट विकसित की है। डेटा दिखाना है कि दोनों तरीकों विवो में सेल भाग्य का अध्ययन करने के लिए व्यवहार्य तरीके हैं।

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Protocol

सभी प्रोटोकॉल की समीक्षा की और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) टेक्सास ए एंड एम विश्वविद्यालय के दंत चिकित्सा कॉलेज में द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. पशु प्रजनन

  1. इस अध्ययन में तीन पशु मॉडल का प्रयोग करें। , पहला प्रयोग Col10a1-Cre 15 चूहों कंद गठन में भ्रूण chondrocytes के भाग्य की जांच करने और उन्हें Rosa26 tdTomato के साथ क्रॉस (बी -6, 129S6- जी.टी. (रोजा) 26Sor tm9 (सीएजी-tdTomato) Hze / जम्मू) चूहों Col10a1- प्राप्त करने के लिए Cre और Rosa26 tdTomato चूहों। अगले, 2.3Col1a1-GFP चूहों 16 के साथ इन चूहों को पार। Col10a1-CRE का उपयोग करें; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP चूहों सेल वंश अनुरेखण प्रयोगों (चित्रा 1 बी) के प्रदर्शन करने के लिए।
  2. प्रसव के बाद chondrocytes के भाग्य का अध्ययन करने के लिए, 1.1 चरण में के रूप में एक ही प्रक्रिया का पालन करें, लेकिन Aggrecan-सीआरई ERT2 (Agg-CRE ERT2 का उपयोग) 17,18 लाइन और Agg-CRE ERT2 रखना; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP चूहों सेल वंश अनुरेखण प्रयोगों (चित्रा 1 सी) प्रदर्शन करने के लिए। प्रसव के बाद 14 दिन पर tamoxifen इंजेक्षन।
  3. सेल वंश immunofluorescence के साथ तकनीक अनुरेखण गठबंधन करने के लिए, Agg-CRE ERT2 चूहों और Rosa26 tdTomato चूहों को पार। चूहों कि प्रयोग में दोनों जीन ले जाने का प्रयोग करें और प्रसव के बाद 3 दिन (चित्रा -1) पर tamoxifen इंजेक्षन।

2. सामग्री तैयारी

  1. 10 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में 10% इथेनॉल और 90% मक्का का तेल में tamoxifen पाउडर भंग। इंजेक्शन के लिए खुराक 75 मिलीग्राम / किग्रा है।
  2. , 4% की एकाग्रता के लिए पीबीएस में paraformaldehyde (पीएफए) पाउडर भंग 2 एम सोडियम हाइड्रेट का उपयोग कर 7.4 पीएच मान को समायोजित करने के लिए। 4% पीएफए ​​समाधान का उपयोग बलिदान के बाद ऊतक (जबड़े कंद और हिंद पैर यहां इस्तेमाल किया जाता है) ठीक करने के लिए। इसके वजह सेविषाक्तता, दस्ताने और एक facemask साथ हुड में पीएफए ​​संभाल।
  3. 10% की एकाग्रता के लिए आसुत जल में EDTA पाउडर भंग 2 एम सोडियम हाइड्रेट का उपयोग कर 7.4 पीएच मान को समायोजित करने के लिए। जबड़े कंद और हिंद पैर decalcify करने के लिए 10% EDTA का प्रयोग करें।
  4. 15% और 30% की सांद्रता में पीबीएस में सुक्रोज पाउडर भंग। विकैल्सीकरण बाद ऊतक निर्जलीकरण sucrose के समाधान का प्रयोग करें।
  5. 2 मिलीग्राम / एमएल, पीएच 5.0 की एकाग्रता में पीबीएस में hyaluronidase पाउडर भंग। यह समाधान immunofluorescence प्रतिजन पुनः प्राप्ति के लिए है।
  6. एक अवरुद्ध समाधान है कि Runx2 या DMP1 immunofluorescent धुंधला के लिए पीबीएस में 3% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 20% बकरी सीरम शामिल तैयार करने के लिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब का प्रयोग करें।
  7. एक प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान है कि Runx2 या DMP1 immunofluorescent धुंधला के लिए पीबीएस में 2% बकरी सीरम शामिल तैयार करने के लिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब का प्रयोग करें। DMP1 के लिए 100: और Runx2 के लिए 400 1: प्राथमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता 1 है।
  8. तैयार करने के लिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब का प्रयोग करेंimmunofluorescent धुंधला के लिए नियंत्रण झूठी सकारात्मक परिणाम से बचने के लिए के रूप में खरगोश आईजीजी समाधान। समाधान पीबीएस में 2% बकरी सीरम शामिल हैं। Runx2 नियंत्रण के लिए खरगोश आईजीजी की एकाग्रता 1: 400; 100: DMP1, 1 के लिए। एक साथ प्रयोग और नियंत्रण धुंधला प्रदर्शन करना।
  9. एक माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान है कि Runx2 या DMP1 immunofluorescent धुंधला के लिए पीबीएस में 2% बकरी सीरम शामिल तैयार करने के लिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब का प्रयोग करें। 500: 1 के कमजोर पड़ने पर माध्यमिक एंटीबॉडी का प्रयोग करें।

3. स्लाइड confocal माइक्रोस्कोपी के लिए तैयारी (सेल वंश केवल ट्रेसिंग, इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ कोई संयोजन)

  1. एक अनुकूल समय बिंदु पर Agg-सीआरई ERT2 चूहों में tamoxifen इंजेक्षन।
    1. सबसे पहले, अपने पिंजरे से एक माउस को हटा दें। फिर, माउस की पीठ पर त्वचा हड़पने के लिए और इसे मोड़ पर, पेट को उजागर करने के लिए बाएं अंगूठे और तर्जनी का उपयोग करें। सिरिंज धारण करने के लिए दाहिने हाथ का प्रयोग करें। इंजेक्शन के लिए इष्टतम प्रवेश बिंदु एल पर हैईएफटी या पेट का निम्न भाग के दाईं ओर, जिगर और मूत्राशय से परहेज।
    2. माउस के पिछले पैरों के लिए सिरिंज समानांतर रखें और intraperitoneally इंजेक्षन। इंजेक्शन के लिए खुराक 75 मिलीग्राम / किग्रा है। 9 ग्राम, 11 - - 13 ग्राम, और 16 - 18 ग्राम, क्रमश: 2 सप्ताह, 3 सप्ताह, और 4 सप्ताह पुरानी की उम्र में चूहों का वजन लगभग 7 रहे हैं।
  2. एक Xylazine / Ketaset संयोजन के साथ चूहों anesthetize।
    1. काम कर समाधान तैयार करने के लिए, पहली Xylazine और Ketaset आसुत जल के साथ 1 मिलीग्राम / एमएल और 5 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए क्रमश: पतला। 2 अनुपात: अगला, एक 1 में Xylazine और Ketaset मिश्रण। इंजेक्शन के लिए खुराक 30 μl / g है।
    2. 3.1 कदम के रूप में इंजेक्षन। माउस के टखने pinching द्वारा anesthetization की पुष्टि करें। माउस बेहोश है अगर यह कोई प्रतिक्रिया होती है।
  3. anesthetization के बाद 4% पीएफए ​​के साथ चूहों छिड़कना।
    1. माउस के बाद होश खो देता है, entirel करने के लिए एक बोर्ड पर माउस के चार पैर ठीकY पेट बेनकाब।
    2. 70% इथेनॉल के साथ पेट तर और मध्य रेखा के साथ गर्दन को पेट के निचले हिस्से से एक छांटना बनाते हैं। चुटकी और एक साथ पेरिटोनियल झिल्ली प्रकट करने के लिए पार्श्व पक्षों के लिए त्वचा खींच। विच्छेदन कैंची का प्रयोग एक अनुदैर्ध्य छांटना बनाने के लिए।
    3. कट और दिल को बेनकाब करने के लिए सामने पसलियों को हटा दें। एक 22 जी सिरिंज के साथ बाएं वेंट्रिकल से दिल पंचर, सिरिंज पकड़ है, और एक साथ सही अलिन्द में एक स्लॉट में कटौती।
    4. धीरे-धीरे 4% पीएफए ​​है, जो हृदय प्रणाली के साथ भरकर रखा जाता है इंजेक्षन जबकि सही अलिन्द से कटौती के बाहर खून flushes। छिड़काव के लिए पीएफए ​​की मात्रा 1 मिलीग्राम / ग्राम है। एक कक्षा मैं जैव सुरक्षा कैबिनेट कि कड़ी मेहनत से ducted इमारत निकास व्यवस्था करने के लिए है में इस कदम को पूरा करें।
  4. माउस की त्वचा छील और एक 50 मिलीलीटर polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब कि 4% पीएफए ​​के 40 मिलीलीटर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ठीक करने के लिए होता है में पूरे शरीर को डाल दिया।
  5. विच्छेदन कैंची और # 3 और # 5 संदंश का प्रयोग सावधानी से शरीर से जबड़ा और हिंद पैर को दूर करने और सतह पर मांसपेशियों और tendons हटा दें। एक कक्षा मैं जैव सुरक्षा कैबिनेट कि कड़ी मेहनत से ducted इमारत निकास व्यवस्था करने के लिए है में इस कदम को पूरा करें।
  6. तीसरे दाढ़ के बाहर का क्षेत्र में दो टुकड़ों में जबड़ा कट। इसी तरह, आदेश विकैल्सीकरण तेजी लाने के लिए अस्थि मज्जा गुहा का पर्दाफाश करने के लिए midshaft में फीमर और टिबिया काटा। बात यह है कि कंद और वाहकनलिका प्रक्रिया में शामिल रखो और 10% EDTA के 40 मिलीलीटर में हिंद पैर के साथ-साथ 2 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर decalcify करने के लिए - एक 50 मिलीलीटर polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब में 4 दिनों के लिए।
  7. एक 50 मिलीलीटर polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस पर कंद और हिंद पैर रात भर निर्जलीकरण के लिए 15% sucrose के 50 मिलीलीटर का प्रयोग करें।
  8. एक 50 मिलीलीटर polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कंद और हिंद पैर निर्जलीकरण के लिए 30% सुक्रोज का प्रयोग करें।
  9. बाण के विमान के साथ, साथ नमूना एम्बेडअक्टूबर cryosection मशीन में काटने की थाली पर।
    1. क्षैतिज कंद या बढ़ते सांचे में हिंद पैर रखना। अक्टूबर में ऊतक डूब और cryosection मशीन में छोड़ जब तक अक्टूबर जमा देता है।
    2. काटने की थाली पर अक्टूबर ब्लॉक माउंट। यह सुनिश्चित करने के लिए अक्टूबर से पूरी तरह से स्थिर है काटने से पहले लगभग 15 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
  10. कंद और 10 माइक्रोन वर्गों में हिंद पैर कट। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड और दुकान पर वर्गों लीजिए।
  11. धुंधला से पहले पानी निकालने के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस कक्ष में स्लाइड सेते हैं।
  12. 5 मिनट के लिए आसुत जल के साथ दो बार स्लाइड्स धो लें।
  13. प्रत्येक अनुभाग के चारों ओर पानी से साफ कर लें। वर्गों चक्र और सर्कल में DAPI या गैर fluorescing विरोधी फीका बढ़ते समाधान ड्रॉप करने के लिए एक हाइड्रोफोबिक बाधा कलम का प्रयोग करें। ध्यान से नीचे कवर पर्ची लेट गई।

4. Runx2 और DMP1 के लिए immunohistochemical धुंधला

नोट: आईजीजी चोरimmunohistochemical धुंधला झूठी सकारात्मक संकेतों से बचने के लिए trol आवश्यक है। प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों के लिए धुंधला हो जाना एक साथ प्रदर्शन करने की जरूरत है।

  1. धुंधला से पहले पानी निकालने के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस के चैम्बर में स्लाइड्स सेते हैं।
  2. स्लाइड आसुत जल के साथ दो बार धोएं।
  3. स्लाइड पर सभी वर्गों के सर्कल के लिए हाइड्रोफोबिक बाधा कलम का प्रयोग करें। इस कदम से, पूरी तरह से वर्गों को कवर करने के लिए सर्कल में तैयार समाधान के सभी जोड़ सकते हैं।
  4. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक नम कक्ष में hyaluronidase के साथ वर्गों समझो। समाधान (4.5 कदम में - 4.8) की मात्रा खंड के आकार पर निर्भर करता है। लंबी हड्डी के लिए कंद के लिए समाधान के 50 μl और 100 μl का प्रयोग करें। PBST (पीबीएस कि 0.1% होता बीच 20) तीन बार से धो लें।
  5. तैयार है और प्रत्येक अनुभाग के लिए अवरुद्ध समाधान लागू करते हैं और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक नम कक्ष में उन्हें सेते हैं।
  6. प्राथमिक साथ वर्गों सेतेएंटीबॉडी समाधान (खरगोश विरोधी माउस Runx2, या खरगोश विरोधी माउस DMP1) 4 डिग्री सेल्सियस रात भर। पीबीएस तीन बार से धो लें।
  7. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान (बकरी विरोधी खरगोश, एलेक्सा स्त्राव 488) के साथ वर्गों सेते हैं। पीबीएस तीन बार से धो लें।
  8. खंड के चारों ओर पानी से साफ कर लें और स्लाइड पर अनुभाग को कवर करने के लिए सर्कल में DAPI ड्रॉप। ध्यान से नीचे कवर पर्ची लेट गई।

5. Confocal माइक्रोस्कोपी

  1. 488 माइक्रोन (हरा) से 561 माइक्रोन (लाल) को लेकर तरंग दैर्ध्य में एक confocal खुर्दबीन का उपयोग फ्लोरोसेंट सेल छवियों पर कब्जा। 200 हर्ट्ज पर कई खड़ी छवियों लो 10X, 20X, 63X और लेंस का उपयोग 19 (1024 × 1024 के आयाम)।

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Representative Results

Chondrocytes सीधे जबड़े कंद और लंबी हड्डी में अस्थि कोशिकाओं (अस्थिकोरक और osteocytes) में बदलना।

Aggrecan, उपास्थिजनन के लिए एक महत्वपूर्ण जीन, मुख्य रूप से जल्दी और परिपक्व chondrocytes 18 में व्यक्त किया जाता है। नतीजतन, Agg-CRE ERT2 में उम्र के 2 हफ्तों में tamoxifen के इंजेक्शन; Rosa26 tdTomato चूहों सभी chondrocytes और उनकी बेटी की कोशिकाओं में लाल टमाटर रिपोर्टर सक्रिय है। 2.3Col1a1-GFP लाइन 1 व्यक्त अस्थि कोशिकाओं, विशेष अस्थिकोरक और पूर्व osteocytes कोलेजन में एक हरे रंग की fluorescing रंग को जन्म दिया है। पीले रंग (लाल, हरे के साथ संयुक्त) उपास्थिकोशिका व्युत्पन्न अस्थि कोशिकाओं है कि कोलेजन 1 जीन व्यक्त की उपस्थिति का संकेत दिया। चित्रा 2A में, वाहकनलिका प्रक्रिया उपास्थि के नीचे में अस्थि कोशिकाओं के सबसे लाल या वाई थेellow (एक लाल सेल कि हरी-fluorescing Col1a1, जिससे पीला दिखने जब दो fluorophores आरोपित थे छिपाना शुरू कर दिया था)। इन परिणामों के पुख्ता सबूत है कि इन अस्थि कोशिकाओं chondrocytes से प्राप्त किए गए प्रदान की है। इसी तरह के परिणाम भी लंबी हड्डी विकास, जहां अस्थि कोशिकाओं के बहुमत दोनों एपिफ़ीसिस (चित्रा 2 बी) और रक्ताधान (चित्रा -2) में chondrocytes से प्राप्त किए गए दौरान मनाया गया।

आगे इन परिणामों की जांच करने के लिए, हम Rosa26 tdTomato साथ Col10al-Cre चूहों को पार; 2.3Col1a1-GFP चूहों। Col10a1 HCS के लिए एक अत्यधिक विशेष मार्कर, केवल HCS और उनके वंश में व्यक्त किया है। इसके अलावा, Col10a1-CRE जो (E14.5 पर) Col10a1 अभिव्यक्ति के शुरू से ही सेल भेदभाव को दर्शाता गैर inducible है। 3 सप्ताह पुराने चूहों, लाल और एस की उपास्थि की हड्डी इंटरफेस (वरिष्ठ स्तर) के पास trabeculae मेंome पीले fluorescing कोशिकाओं, प्रमुख थे जबकि हरी fluorescing कोशिकाओं दुर्लभ थे। एक से थोड़ा अधिक अवर क्षेत्र (मध्यम स्तर) में, कोशिकाओं के बहुमत पीले fluorescing, थोड़ा कम fluorescing लाल के साथ थे। ग्रीन fluorescing कोशिकाओं .इस प्रवृत्ति को इंगित करता है कि वाहकनलिका विकास ज्यादातर HCS से बदल अस्थि कोशिकाओं से करने के लिए योगदान दिया है केवल वाहकनलिका प्रक्रिया (अवर स्तर) (चित्रा 3) का सबसे घटिया क्षेत्र में हावी दिखाई दिया। वाहकनलिका प्रक्रिया में लाल और हरे रंग की fluorescing कोशिकाओं का वितरण भी वाहकनलिका विकास के अवर करने वाली बेहतर दिशा के अनुरूप है।

सेल वंश अनुरेखण तकनीक स्पष्ट रूप से दर्शाता है कि apoptosis HCS के लिए केवल भाग्य नहीं है। दोनों Agg-CRE ERT2 और Col10a1-CRE लाइनों से संकेत मिलता है कि उपास्थिकोशिका व्युत्पन्न अस्थि कोशिकाओं वाहकनलिका प्रक्रिया में हड्डी के विकास के लिए और एपिफ़ीसिस में प्रमुख स्रोत हैंऔर लंबी हड्डी में रक्ताधान।

Immunofluorescent धुंधला और सेल वंश ट्रेसिंग के सह आवेदन सेल भेदभाव की ट्रैकिंग सक्षम बनाता है।

सेल वंश अनुरेखण तकनीक को भी एक सेल विशिष्ट मार्कर का पता लगाने के द्वारा सेल प्रकार का निर्धारण करने के लिए फ्लोरोसेंट immunohistochemistry के साथ जोड़ा जा सकता है। इस विधि सेल भाग्य के अध्ययन के लिए कई फायदे हैं। सबसे पहले, शोधकर्ता अभी भी उचित मार्कर का चयन, यहां तक ​​कि विशेष GFP माउस लाइन है, जो सेल वंश तकनीक पता लगाने के लिए आवेदन broadens बिना द्वारा सेल विशेषताओं को परिभाषित कर सकते हैं। दूसरे, यह यौगिक चूहों की पीढ़ी को सरल। उदाहरण के लिए, हम केवल Agg-CRE ERT2 उत्पन्न करने के लिए की जरूरत है; Rosa26 tdTomato यौगिक चूहों, (प्रसव के बाद 3 दिन में) Cre सक्रिय करने के बाद लाल रंग का उत्पादन करने के बजाय Agg-CRE बनाने कीERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato चूहों, जो अधिक से पार की आवश्यकता है।

इस अध्ययन में, हम immunofluorescent धुंधला के लिए दो एंटीबॉडी चुना है। एक Runx2, अस्थिकोरक परिपक्वता के दौरान एक महत्वपूर्ण कारक ट्रांसक्रिप्शनल (osteogenic कोशिकाओं के प्रारंभिक चरण) के खिलाफ था; अन्य DMP1 के खिलाफ था, परिपक्व osteocytes (osteogenic कोशिकाओं की देर चरण) में व्यक्त किया। चित्रा 4 में, हरे रंग की रोशनी 2 सप्ताह पुराने वाहकनलिका प्रक्रिया में Runx2 या DMP1 एंटीबॉडी अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करता है। चित्रा -4 ए में, subchondral हड्डी में रंग कोशिकाओं के तीन प्रकार मौजूद हैं। पीले रंग (लाल और हरे रंग की रोशनी के superimposition) नाभिक में उपास्थिकोशिका व्युत्पन्न अस्थि कोशिकाओं Runx2 व्यक्त, यह दर्शाता है कि इन कोशिकाओं की हड्डी सतह पर अपरिपक्व अस्थिकोरक थे प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, वहाँ थे लाल fluorescing अस्थि कोशिकाओं है कि Runx2 व्यक्त नहीं किया (लाल चआरोपित हरी बिना luorescence)। इन कोशिकाओं को हड्डी मैट्रिक्स में परिपक्व उपास्थिकोशिका व्युत्पन्न अस्थि कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। कम से कम आम कोशिकाओं केवल हरी-fluorescing नाभिक के साथ उन लोगों के थे, Runx2 अभिव्यक्ति या एक परिवर्तन है कि Cre सक्रियण से पहले हुई के साथ गैर उपास्थिकोशिका व्युत्पन्न अस्थि कोशिकाओं का संकेत है। चित्र को पता चलता है कि लाल अस्थि कोशिकाओं और पीले रंग के नाभिक के साथ उन लोगों के बहुमत सेल वाहकनलिका subchondral हड्डी गठन के लिए योगदान जनसंख्या थी।

दूसरी ओर, लगभग हर लाल, उपास्थिकोशिका व्युत्पन्न हड्डी हड्डी मैट्रिक्स में सेल अपने सेल शरीर के चारों ओर DMP1 धुंधला था। कुछ osteocytes DMP1 के लिए सकारात्मक थे लेकिन लाल सेल निकायों (चित्रा 4 बी) का अभाव है। वहाँ भी इन कोशिकाओं के लिए दो संभावित व्याख्या कर रहे हैं: या तो वे गैर उपास्थिकोशिका व्युत्पन्न अस्थि कोशिकाओं हैं, या वे उपास्थिकोशिका व्युत्पन्न अस्थि कोशिकाओं है कि tamoxifen के इंजेक्शन से पहले बदल रहे हैं। इसके अलावा, कोई लाल अस्थि कोशिकाओंहड्डी की सतह पर यह दर्शाता है कि वे osteocytes परिपक्व नहीं थे, DMP1 व्यक्त किया।

साथ में ले ली, osteogenic कोशिकाओं के दोनों early- (Runx2) और देर चरण मार्कर (DMP1) के लिए अभिव्यक्ति पैटर्न से डेटा पिछले परिणाम Cre 2.3Col1a1-GFP के साथ संयुक्त का उपयोग के साथ संगत कर रहे थे। ये आंकड़े दर्शाते हैं कि immunofluorescence और Rosa26 tdTomato ट्रेसिंग के संयोजन सेल भाग्य का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा तरीका है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, जांचकर्ताओं, सेल प्रकार के भेद भेदभाव चरण की पहचान है, और विभिन्न मार्कर, जो अधिक से Rosa26 tdTomato अकेले अनुरेखण अधिक जानकारी प्रदान के साथ immunofluorescence का उपयोग करके तब्दील सेल नंबर एक साथ निरीक्षण कर सकते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. सेल वंश ट्रेसिंग और वीं के लिए तंत्रयौगिक चूहे की ई पीढ़ी। ए) Cre पर loxP प्रणाली सामान्यतः वंश का पता लगाने में किया जाता है। Cre दो loxP साइटों के बीच रोकें अनुक्रम, और tdTomato प्रोटीन (लाल fluorescing) स्थायी रूप से विशेष सेल लाइन में व्यक्त किया है Excises। ख) तीन पशु मॉडल इस पत्र में उल्लेख किया है। हम 2.3 Col1a1-GFP इस्तेमाल किया; Rosa26 tdTomato चूहों और उन्हें Col10a1-Cre चूहों के साथ पार कर गया। Col10a1-CRE जो (E14.5 पर) Col10a1 अभिव्यक्ति के शुरू से ही सेल भेदभाव को दर्शाता गैर inducible है। सी) Aggrecan-CRE ERT2 (Agg-CRE ERT2) एक और रचनात्मक लाइन भी 2.3Col1a1-GFP के साथ पार है; Rosa26 tdTomato चूहों। (: Tamoxifen टीएम) Cre एक tamoxifen इंजेक्शन द्वारा उम्र के 2 हफ्तों में सक्रिय हो गया था। डी) के क्रम में सेल वंश ट्रेसिंग के साथ गठबंधन करने के लिए immunofluorescence में, हम Agg-CRE ERT2 उत्पन्न; <उन्हें> Rosa26 tdTomato चूहों, प्रसव के बाद 3 दिन में Cre सक्रिय है, और Runx2 और DMP1 immunofluorescence प्रदर्शन (टीएम: tamoxifen)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. जबड़े कंद और लंबी हड्डी में अस्थि कोशिकाओं (अस्थिकोरक और osteocytes) Agg-CRE ERT2 का उपयोग करने के लिए Chondrocytes से परिवर्तन; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato यौगिक चूहे। ए) Cre प्रसव के बाद 14 दिन पर tamoxifen से सक्रिय हो गया था, और चूहों 4 सप्ताह की उम्र में बलिदान किया गया। वहाँ में तीन रंग की कोशिकाओं थे वाहकनलिका प्रक्रिया: शुद्ध लाल (उपास्थिकोशिका व्युत्पन्न अस्थि कोशिकाओं), पीला (लाल, हरे के साथ संयुक्त, उपास्थिकोशिका व्युत्पन्न अस्थि कोशिकाओं है कि कोलेजन 1 जीन व्यक्त दर्शाता है), और शुद्ध हरे (कोलेजन 1 जीन के साथ गैर उपास्थिकोशिका निकाली गई अस्थि कोशिकाओं) । वाहकनलिका प्रक्रिया उपास्थि के नीचे में अस्थि कोशिकाओं से अधिकांश, पीले या शुद्ध लाल (सफेद तीर) थे, जबकि कुछ अस्थि कोशिकाओं हरे (नीले तीर) थे। (:; सी tamoxifen: उपास्थि, बी: हड्डी टीएम) ये आंकड़े मजबूत सबूत है कि Chondrocytes सीधे विकास के दौरान अस्थि कोशिकाओं में बदलना और वाहकनलिका प्रक्रिया के गठन में योगदान प्रदान करते हैं। बी, सी) एपिफ़ीसिस और रक्ताधान में अस्थि कोशिकाओं के बहुमत उपास्थिकोशिका-प्राप्त किए गए (सफेद तीर: पीले या शुद्ध लाल रंग में तब्दील उपास्थिकोशिका हड्डी कोशिकाओं, नीले तीर: गैर उपास्थिकोशिका व्युत्पन्न शुद्ध हरे रंग में अस्थि कोशिकाओं, एसी: जोड़दार उपास्थि, जीपी: विकास की थाली)।blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
जबड़े कंद Col10al-CRE का उपयोग करने में अस्थि कोशिकाओं को Chondrocytes से परिवर्तन 3. चित्रा; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato यौगिक चूहे। ए) 3 सप्ताह पुराने चूहों से वाहकनलिका प्रक्रिया में, हरे अस्थि कोशिकाओं उपास्थि की हड्डी इंटरफेस के पास trabeculae में एक विशिष्ट अल्पसंख्यक (वरिष्ठ स्तर, A1), लाल और पीले रंग की कुछ कोशिकाओं प्रमुख थे जबकि थे। मध्यम स्तर (A2) में, पीले रंग की कोशिकाओं से थोड़ा कम लाल कोशिकाओं के साथ, बहुमत में थे। हरी कोशिकाओं केवल सबसे अवर क्षेत्र में बहुमत में हो दर्शन (ए 3)यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. वाहकनलिका प्रक्रिया में वंश अनुरेखण पृष्ठभूमि के साथ osteogenic प्रकोष्ठों के लिए दो मार्करों 2 सप्ताह पुराने Agg-CRE ERT2 का उपयोग करने के सह स्थानीयकरण; Rosa26 tdTomato यौगिक चूहे। ए) नाभिक में पीले रंग उपास्थिकोशिका व्युत्पन्न अस्थि कोशिकाओं कंद उपास्थि के नीचे घरनदार हड्डी की सतह पर Runx2 (सफेद तीर) को व्यक्त करने का प्रतिनिधित्व करता है। Runx2 अभिव्यक्ति के बिना शुद्ध लाल अस्थि कोशिकाओं हड्डी मैट्रिक्स (पीले तीर) में परिपक्व उपास्थिकोशिका व्युत्पन्न अस्थि कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। feweसेंट कोशिकाओं केवल हरी नाभिक को ले जाने के लिए उन, Cre सक्रियण (: tamoxifen टीएम) से पहले chondrocytes से या तो गैर उपास्थिकोशिका व्युत्पन्न अस्थि कोशिकाओं या बदल अस्थि कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व कर रहे थे। बी) कंद उपास्थि के नीचे घरनदार हड्डी में, लगभग हर लाल उपास्थिकोशिका व्युत्पन्न हड्डी मैट्रिक्स में हड्डी सेल अपने सेल निकायों (सफेद तीर) के आसपास DMP1 धुंधला किया। osteocytes के केवल कुछ DMP1 के लिए सकारात्मक थे लेकिन उनके सेल निकायों (पीले तीर) में लाल रंग का अभाव है। गैर उपास्थिकोशिका व्युत्पन्न अस्थि कोशिकाओं या उपास्थिकोशिका व्युत्पन्न अस्थि कोशिकाओं tamoxifen के इंजेक्शन से पहले उत्पन्न होने वाले: इन कोशिकाओं के लिए दो संभावनाएं हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

तकनीकी सीमाओं के कारण, यह हमेशा विवो में कोशिकाओं के व्यवहार की जांच के लिए मुश्किल है। हालांकि, सेल वंश अनुरेखण तकनीक कोशिका जीव विज्ञान 7-9 अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण साबित हो रही है। इस अध्ययन में, हम आगे immunofluorescence साथ संयोजन के द्वारा इस प्रोटोकॉल में सुधार होगा। इस रास्ते में, सेल भाग्य एकाधिक संबंधित मार्कर, जो वंश ट्रेसिंग के आवेदन broadens द्वारा परिभाषित किया जा सकता है। इसके अलावा, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और टमाटर का संकेत के इस सह स्थानीयकरण एक साथ, संस्थापक सेल, उनके स्थान है, और उनके भेदभाव स्थिति की संतान की संख्या प्रदर्शित करता सेल वंश अकेले ट्रेसिंग की तुलना में अधिक जानकारी प्रदान करते हैं। इसके अलावा, सेल विशिष्ट मार्कर के उपयोग यौगिक चूहों की पीढ़ी को आसान बनाने में कर सकते हैं, जांच में तेजी।

Cre की विशिष्टता के वंश का स्पष्ट रोपण और परिणाम 20,21 की सटीकता के लिए महत्वपूर्ण है। यह बहुत im हैसेल भाग्य सत्यापित करने के लिए उचित Cre लाइनों का चयन करने के लिए अहम। इस अध्ययन में, हम Col10a1 क्योंकि यह है, क्योंकि यह भी chondrocytes 18 के लिए एक अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त मार्कर है hypertrophic chondrocytes 10,11, और aggrecan के लिए एक विशिष्ट मार्कर माना जाता है चुना है। वहाँ भी अन्य क्षेत्रों में उपयोग किया अच्छा Cre मॉडल हैं। Scleraxis-CRE (SCX-सीआरई) लाइन, उदाहरण के लिए, के बाद से scleraxis एक बुनियादी हेलिक्स पाश-हेलिक्स प्रतिलेखन कारक पट्टा और बंध सेल वंश 22 के लिए एक मार्कर है वह यह है कि पट्टा और बंध अनुसंधान के क्षेत्र में उपयोगी है। एक और रचनात्मक बुलाया DMP1-CRE सामान्यतः skeleton- और दांत से संबंधित अध्ययन में प्रयोग किया जाता है क्योंकि DMP1 अत्यधिक ओडॉन्टोब्लास्ट में व्यक्त किया और 23,24 osteocytes है।

गैर inducible Cre सिस्टम के साथ तुलना में, inducible Cre की सक्रियता के स्थानिक और अस्थायी 20 प्रतिबंधित किया जा सकता है। हालांकि, कुछ सीमाएँ जब प्रयोग डिजाइन और के परिणामों की व्याख्या विचार किया जाना चाहिएinducible Cre मॉडल। सबसे पहले, tamoxifen की खुराक Cre सक्रियण की दक्षता और लेबल की कोशिकाओं की संख्या बदल सकते हैं। कम खुराक एक प्रतिरूप घनत्व 25 पर ब्याज की आबादी लेबल होगा; उच्च खुराक पूरे पूर्वज पूल 7,26 लेबल कर सकते हैं। इस प्रकार, खुराक के प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर चुना जाना चाहिए। दूसरा, tamoxifen के संभावित विषाक्तता, विशेष रूप से उच्च खुराक 27,28 में है। इस कारण से, यह खुराक जब गर्भावस्था के दौरान 29 इंजेक्शन लगाने देर तक गर्भपात से बचने के लिए कम करने के लिए बेहतर है।

अंत में, सेल वंश अनुरेखण तकनीक और immunofluorescence के सह आवेदन vivo में कोशिका जीव विज्ञान की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। भविष्य में, जांचकर्ताओं को एक साथ टमाटर का संकेत पृष्ठभूमि पर दो अलग अलग एंटीबॉडी के साथ immunofluorescence प्रदर्शन करने का प्रयास कर सकते हैं। इस विधि से एक खंड में दो मार्करों के लिए अभिव्यक्ति पैटर्न दिखा सकते हैं, यह आसान बनाने के लिएअन्वेषक तुलना और परिणामों का विश्लेषण करने के लिए। इसके अलावा, इस सह-आवेदन आगे से सीटू इम्यूनोफ्लोरेसेंस में गैर विशिष्ट धुंधला है कि पारंपरिक immunofluorescence के माध्यम से मौजूद हो सकता है कम करने के लिए सुधार किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tamoxifen  Sigma T5648 activate the Cre event 
Paraformaldehyde Sigma  P6148 fix the sample
Ethylenediaminetetraacetic acid Alfa Aesar A10713 decalcify the hard tissue
Sucrose  Sigma S0389 dehydrate the tissue
Hyaluronidase from bovine testes  Sigma H4272 retrieve antigen for immunochemical staining
Bovine serum albumin Sigma  A3059 blocking solution 
primary antibody for Runx2  Cell Signal D1L7F primary antibody for immunochemical staining
primary antibody for DMP1 provided by Dr. Chunlin Qin primary antibody for immunochemical staining
anti-rabbit IgG Sigma 18140 control for immunochemical staining
secondary antibody  Invitrogen A11008 second antibody for immunochemical staining
OCT Tissue-Tek 4583 embed the sample for frozen section
Tween 20 Fisher Scientific BP337 PBST
non-fluorescing antifade mountant Life technologies P36934 mounting slides
DAPI Life technologies P36931 nuclear staining
Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratories circle the section on the slide for for immunochemical staining 
Xylazine AnaSed anesthetization 
Ketaset  Zoetis anesthetization 
cryosection machine Leica CM1860 UV
confocal microscope Leica DM6000 CFS 

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References

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