Un semplice passo-dissezione Protocollo per tutto il montaggio Preparazione per adulti

Neuroscience

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Summary

L'adulto Drosophila cervello è un sistema utile per studiare circuiti neuronali, le funzioni cerebrali superiori, e malattie complesse. Un metodo efficace per sezionare intero tessuto cerebrale dalla testa piccola mosca faciliterà gli studi del cervello-based. Qui si descrive un semplice, one-step protocollo dissezione del cervello adulto con ben conservato morfologia.

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Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J. Vis. Exp. (118), e55128, doi:10.3791/55128 (2016).

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Abstract

Vi è un crescente interesse nell'uso di Drosophila per modellare cervello malattie degenerative umane, la mappa circuiterie neuronali nel cervello adulto, e studiare le basi molecolari e cellulari delle funzioni cerebrali superiori. Una preparazione tutto il montaggio del cervello adulto con ben conservato la morfologia è fondamentale per tali studi intero cervello-based, ma può essere tecnicamente impegnativo e richiede molto tempo. Questo protocollo descrive un approccio dissezione one-step facile da imparare, di una testa adulta mosca in meno di 10 s, mantenendo il cervello intatto attaccato al resto del corpo per facilitare le successive fasi di lavorazione. La procedura aiuta a rimuovere la maggior parte dei tessuti oculari e tracheali normalmente associati con il cervello che può interferire con la fase di imaging più tardi, e pone anche meno domanda sulla qualità delle dissettore. Inoltre, si descrive un metodo semplice che consente comoda capovolgimento dei campioni cerebrali montati su un vetrino, che è importante per l'imaging entrambi i lati della bpiogge con intensità di segnale simile e qualità. Come esempio di protocollo, presentiamo un'analisi dopaminergici (DA) neuroni nel cervello adulto di WT (w 1118) mosche. L'elevata efficacia del metodo di dissezione lo rende particolarmente utile per gli studi basati su cervello adulto su larga scala in Drosophila.

Introduction

L'organismo modello Drosophila, comunemente nota come la mosca della frutta, è stato a lungo apprezzato per i suoi eleganti strumenti genetici, tempi brevi riproduttivi, e altamente conservata percorsi molecolari e cellulari. Il moscerino della frutta è stato impiegato con successo per analizzare i percorsi di base di segnalazione, i meccanismi patterning di organismi multicellulari, nonché i meccanismi alla base dello sviluppo neuronale, le funzioni e le malattie 1,2. Con i recenti progressi nelle tecnologie di etichettatura delle cellule e di imaging, il cervello mosca della frutta è diventato particolarmente potente nella mappatura fine di circuiti neuronali e nella dissezione delle basi molecolari e cellulari delle funzioni cerebrali superiori, come l'apprendimento e la memoria, e il ritmo circadiano 1,3, 4,5,6,7,8.

Un particolare vantaggio del sistema Drosophila è la sua dimensione relativamente piccola, permettendo tutto il montaggio la preparazione e l'esame del cervello utilizzando un composto regolare o microscopio confocale. ThiFunzione s consente analisi dettagliate anatomiche e funzionali di circuiti neuronali, o anche un singolo neurone, a livello cellulare e subcellulare, nel contesto di un tessuto cerebrale intera, fornendo quindi sia una visione olistica del soggetto studiato e la sua geometria precisa all'interno dell'intero cervello. Tuttavia, date le dimensioni piuttosto miniatura del cervello, presenta anche una sfida tecnica in sezionare in modo efficiente un tessuto cerebrale intatto fuori dalla custodia protettiva testa esoscheletro in una mosca adulta. Vari metodi dissezione efficaci e relativamente semplici sono state descritte in dettaglio, che di solito comporta un'attenta e graduale rimozione del caso testa ei relativi tessuti compresi gli occhi, trachea, e grasso dal cervello corretta 9, 10. Questi metodi di dissezione microchirurgia pone spesso domande piuttosto stringenti sulla qualità delle pinze dissezione, basandosi su una pinza con punte sottili ben allineati che possono essere facilmente danneggiati. Inoltre, come i cervelli sezionati sono spesso separatcato dal resto del corpo, i cervelli possono essere facilmente perse durante i successivi processi di colorazione e lavaggio a causa delle loro piccole dimensioni e la loro trasparenza nel buffer di elaborazione. Qui, descriviamo un relativamente semplice e facile da imparare, protocollo di dissezione one-step per cervello adulto che mantiene il cervello sezionati attaccati al torso. Il processo di dissezione spesso cancella facilmente via la maggior parte dei tessuti cerebrali associate come l'occhio e la trachea e riduce la domanda di pinze dissezione di buona qualità.

Inoltre, quando l'imaging del cervello al microscopio composto fluorescente o microscopio confocale, la parte del cervello che è lontano dalla sorgente di luce fluorescente spesso produce un segnale più debole e immagini meno chiare a causa dello spessore del cervello intero montaggio. Qui, descriviamo anche un semplice metodo di montaggio che consente una facile capovolgimento dei campioni cerebrali, consentendo comoda immagini di entrambi i lati del cervello con simili intensi segnalety e qualità.

Come un proof-of-concept per l'applicazione di questo metodo per studiare il cervello adulto, abbiamo esaminato ulteriormente la presenza di neuroni DA nel cervello di w 1118 mosche; un genotipo che viene spesso utilizzato come la linea dei genitori per la generazione di mosche transgeniche e il controllo di tipo selvatico in molti studi di Drosophila.

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Protocol

1. Le soluzioni usate per Brain dissezione e colorazione di immunofluorescenza

  1. Sezionare l'adulto volare cervelli in artificiale liquido cerebro-spinale (aCSF): 119 mm NaCl, 26,2 mM NaHCO 3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 1,3 mm MgCl 2, e 10 mm di glucosio. Prima dell'uso, gas ACSF con il 5% di CO 2/95% O 2 per 10 - 15 minuti e picco con 2,5 mM CaCl 2. Sterilizzare la soluzione aCSF filtrando attraverso un filtro di 0,22 micron membrana.
    Nota: Conservare aCSF a 4 ° C per evitare la contaminazione batterica. Mosca cervello può anche essere sezionato in una soluzione salina tampone-fosfato (PBS), anche se non sono stati effettuati confronti dettagliati degli effetti delle due soluzioni dissezione sulla qualità delle immagini finale dei cervelli sezionati.
  2. Utilizzare 4% paraformaldeide (PFA) preparato in PBS 1x come soluzione fissativo, che è normalmente aliquotati e conservati a -20 ° C.
    caution: PFA è tossico e corrosivo e deve essere maneggiato con cura.
  3. Utilizzare 1x PBS per risciacquare il PFA dal cervello e dopo l'ultima fase di lavaggio, durante la colorazione immunofluorescenza dei cervelli sezionati. Preparare il 1x PBS da 10x soluzione PBS magazzino (1,37 M di NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na 2 HPO 4, e 18 mm KH 2 PO 4).
  4. Utilizzare 0,3% Tween-20 a 1x PBS (1x PBT) per tutte le successive fasi di lavaggio durante immunofluorescenza colorazione dei cervelli sezionati.

2. microchirurgica dissezione di adulti Fly Heads

Nota: La procedura di dissezione è illustrato nella figura 1.

  1. Anestetizzare le mosche adulte con CO 2. Utilizzando pinze, prendere una mosca e brevemente DEWAX sua cuticola immergendolo in etanolo al 70% per 3 - 5 s. Questo assicura che nessuna bolla aderiscano alla cuticola volo quando immerso nella aCSF o soluzione dissezione 1X PBS.
  2. Sotto undissezione microscopio con una sorgente di luce ad un angolo che non sarà bloccato da mani, impostare la lente obiettivo di raggiungere una visione chiara della mosca (1.2X ingrandimenti). Utilizzare pinze con la mano non dominante per immobilizzare l'animale ed immergere la mosca nella soluzione dissezione a freddo con il suo addome rivolto verso l'alto, come mostrato nella Figura 1A.
  3. Mantenere la pinza a 160 - Angolo ° 170 rispetto alla piastra dissezione, esercitando nel contempo una piccola forza sul ventre di volo (illustrata frecce in figura 1A). Questo passaggio immobilizzare il volo e costringerlo a spostare la testa all'indietro di 15 - 25 ° mentre si estende la proboscide verso l'alto. Nel processo, una regione morbido e traslucido della cuticola, sotto la proboscide, dovrebbe diventare apparente. Aumentare l'ingrandimento e regolare il piano focale su questa regione.
    Nota: Non tenere le pinze troppo stretto, ma piuttosto abbastanza ferma per stabilizzareil volo. Troppo forza causerà gli organi interni rottura nella soluzione.
  4. Utilizzare la mano dominante per premere i dissettore modo che le punte sono chiusi, che genererà una forza resistente lieve sulle punte della pinza, in modo che la pinza si molla aperta quando la pressione della mano che regge viene rilasciato. Posizionare la pinza perpendicolarmente alle pinze tengono la mosca, come mostrato nella Figura 1B.
    1. Pierce le punte chiuse della pinza dissezione attraverso la regione morbido e traslucido della cuticola sotto la proboscide, come illustrato dalla freccia rossa nella figura 1B. È importante non penetrare le pinze troppo in profondità che tocca il cervello. Il cervello corretta dovrebbe diventare visibile. Mantenere una stretta stabile al volo con la mano non dominante.
  5. Rapidamente ma costantemente, rilasciare le punte della pinza dissezione dalla propria forza e si basano sullo slancio da questa release di strappare via tegli esoscheletro che circonda la testa mosca. Un cervello intatto corretta dovrebbe diventare visibile (tessuto bianco immediatamente sopra la punta della pinza basso nella Figura 1C) Seguire una linea immaginaria per guidare il moto delle punte forcep rilasciati (illustrati come le frecce rosse esteriori mostrato nella Figura 1C). Ciò rimuovere delicatamente l'esoscheletro e più dell'occhio cervello associata e trachea dal cervello. La tempistica adeguata e forza applicata per aprire l'esoscheletro dipenderà esperienza del ricercatore.
    Nota: Questa è la fase più critica durante la dissezione. È importante contare sulla forza naturale generata dal moto della pinza apertura per rimuovere l'esoscheletro lasciando il cervello esposto rimane attaccato al resto del corpo.
  6. Utilizzare le pinze nella mano dominante per rimuovere con attenzione i tessuti accessori residuo, come ad esempio la tracheale che appare come strutture fibra bianca remaining attaccato al cervello. Fare attenzione a non tirare o danneggiare il cervello corretta.

3. immunofluorescenza colorazione dei cervelli

  1. Fissare i campioni di cervello sezionato con i loro torsi associati in circa 1 ml di PFA 4% per 40 - 60 min.
    Nota: Per questa e le successive fasi, mantenere i tubi o piastre con campioni su un nutator per miscelare correttamente i campioni nella soluzione.
  2. Risciacquare con 1 ml di PBS 1x pipettando la soluzione su e giù per 3 volte. Fare attenzione a non aspirare il cervello di distanza.
  3. Lavare 5 volte con 1x PBT per 5 minuti ciascuna. Mantenere i campioni sul nutator durante l'incubazione.
  4. Incubare con anticorpi primari corretta diluizione O / N a 4 ° C.
  5. Il giorno successivo, rimuovere gli anticorpi primari, e lavare i campioni 5 volte con 1x PBT. Lasciare i campioni per 5 - 10 minuti nella soluzione 1x PBT tra ogni lavaggio. Mantenere i campioni sul nutator durante l'incubazione.
  6. Incubare il lavatocampioni in opportuni anticorpi secondari con la diluizione ed il tempo di incubazione suggerite.
  7. Lavare i campioni sei volte con 1x PBT con 10 minuti di incubazione tra ogni lavaggio.
    Questo passaggio è fondamentale per la rimozione di anticorpi secondari aspecifico legati dal campione.
  8. Incubare in una diluizione 1: 10.000 1 mg / mL 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in soluzione 1x PBT per 30 min. DAPI è un colorante DNA che si lega alle regioni AT di DNA e può essere utilizzato per rivelare la morfologia complessiva del cervello.
  9. Risciacquare tre volte con PBS 1x.
  10. campioni Trasferire in un piatto dissezione, e separare i cervelli dei corpi in un piatto dissezione con pinze.
  11. Dopo la procedura di colorazione e lavaggio, montare i cervelli tra due coprioggetto e posizionare il coprioggetto sulla cima di una diapositiva montaggio. In questo modo, i campioni cerebrali possono essere facilmente capovolto in modo che entrambi i lati del cervello può essere ripreso con intensità segnale simile.
  12. Inserire un coprioggetto 18 x 18 mm in cima ad una slitta di montaggio. Ampliare l'apertura di un puntale con una lama e utilizzarlo per trasferire i cervelli in soluzione 1x PBS sul vetrino 18 x 18 mm.
  13. Posizionare il cervello a metà del vetrino, rimuovere il liquido in tutto il cervello con una multa punta della pipetta, e poi aggiungere un altro 20 - 40 ml di anti-sbiadimento mezzo di montaggio (0.2% (w / v) n-propil gallato a 99,5 % ACS grado glicerolo) sopra il cervello.
    Nota: La quantità di mezzo di montaggio aggiunto dipende dal numero di cervelli esaminati.
  14. Delicatamente diffondere il cervello, mentre spostando il mezzo di montaggio viscosa verso l'esterno. Posizionare un secondo vetrino 18 x 18 mm sulla parte superiore del cervello abbassando il vetrino da una parte fino al contatto conla superficie della barbottina di montaggio, e poi lentamente abbassare l'altro lato per minimizzare il contatto cervello con bolle d'aria.
    Nota: Non vi è alcuna necessità di utilizzare un distanziale tra le due lamelle, come il volume del mezzo di montaggio e il cervello dovrebbero fornire uno spazio sufficiente per separare le due coprioggetto.
  15. Lasciare le diapositive di stabilirsi. Rimuovere il liquido eccessivo che escono dai lati dei bollettini con un tessuto di laboratorio.
  16. Per evitare che i vetrini con il cervello montati di cadere diapositiva di montaggio durante il trasporto, utilizzare un piccolo pezzo di nastro adesivo per fissare i coprioggetti alla slitta di montaggio.
    Nota: Cervelli montati tra i vetrini possono essere esposte immediatamente o conservati a 4 ° C fino ad una settimana senza significativa perdita di segnale fluorescente, senza necessità di utilizzare un altro sigillante diapositive. Per la conservazione a lungo termine dei cervelli macchiati, il lato dei due foglietti può essere sigillato wesimo smalto e conservati in un congelatore a -20 ° C, anche se i cervelli colorati potrebbero perdere i loro segnali nel corso del tempo. Questo non è raccomandato.
  • Utilizzare un microscopio composto fluorescente appropriato o microscopio confocale a immagine il cervello.
    1. Innanzitutto, acquisire l'immagine dal lato del cervello più vicino all'obiettivo e quindi capovolgere attentamente i coprioggetti disporre i campioni sandwich nel mezzo. Questa fase facilita l'acquisizione dell'immagine dell'altro lato della stessa cervello.
    2. Utilizzare un microscopio verticale composto fluorescente e una lente obiettivo 20X all'immagine l'intero cervello (esempi della Figura 2) e un obiettivo 40X per immagini più piccole regioni del cervello, come neuroni dopaminergici nella regione di cluster appaiati anteriore mediale (PAM) (esempi in figura 3).
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    Representative Results

    La Figura 1 illustra le procedure principali per dissezione cervello adulto, come sopra descritto le figure 2 e 3 sono immagini rappresentative di 3 giorni di età WT. (Genotipo: w 1118) adulto vola cervello, che sono stati costained con un anticorpo contro la tirosina idrossilasi (TH , colorato in rosso nella figura 2 e nero in figura 3), un marker comunemente usato per etichettare neuroni dA 11, oltre al colorante DNA DAPI per etichettare tutti i nuclei delle cellule e un anticorpo contro la proteina Elav, un marcatore per tutti i neuroni dissociati in volo (colorati in verde), che insieme rivelato la struttura complessiva del cervello.

    Per gli anticorpi primari in figure 2 e 3, abbiamo usato coniglio anticorpo anti-TH ad una diluizione 1: 200 e ratto anticorpi anti-Elav ad una diluizione 1: 100, WHIch sono stati preparati in 1x PBT con il 5% di siero normale di capra per bloccare legame aspecifico. Per gli anticorpi secondari, abbiamo utilizzato Alexa Fluor 488 coniugato anticorpo di capra anti-ratto e di capra AlexaFluor596 coniugato anticorpo anti-coniglio ad una diluizione 1: 500 in 1x PBT.

    Per immagine il cervello, abbiamo usato un microscopio composto fluorescente verticale dotato di una funzione apotome di acquisire immagini Z-stack di fette di cervello che coprono tutta la profondità della regione di interesse nel cervello. Ad esempio, per ottenere una chiara visualizzazione della distribuzione generale dei neuroni dopaminergici in tutto il cervello, abbiamo utilizzato una lente obiettivo 20X per separatamente immagine ai lati anteriore e posteriore della stessa cerebrale (Figura 2). La profondità di ogni lato del cervello ripreso che può coprire tutti i neuroni DA è di circa 20 - 25 micron in totale. Per visualizzare in modo affidabile e quantificare neuroni dopaminergici nella regione gruppo PAM, che hanno più piccole dimensioni delle celle e dei più deboli TH SIsegnal (vedi sotto), abbiamo usato una lente obiettivo 40X. Inoltre, in funzione di acquisizione Z-serie dal software commerciale, abbiamo selezionato uno spessore di taglio di 0,5 - 1 um tra ogni fetta ripreso, sufficiente qualità ottimale in una ricostruzione 3D del cluster regione PAM (figura 3c). Lo spessore del cluster PAM nel cervello che copre tutti i neuroni DA è di circa 8 - 10 micron in totale. Nella nostra esperienza, la funzione apotome può ridurre significativamente il segnale di rumore nell'imaging campioni di spessore con elevato background, come un intero cervello o cluster regione PAM.

    Figure 2A-E mostrano la vista anteriore di un cervello, mentre le figure 2F-J mostra la vista posteriore della stessa cervello dopo lanciando i coprioggetti che contengono i campioni di cervello, che mostrano un analogo livello di intensità del segnale tra due lati del cervello per tutti e tre i canali creata l'immagine. Il neur DAons sono stati raggruppati in diversi cluster dopo l'inizio di designazione 11, anche se qui si usa il nome Accoppiato posteriore mediale (PPM) per includere il ppm1, ppm2, e cluster PPM3 sul lato anteriore del cervello, e il nome Accoppiato posteriore laterale (PPL ) per coprire i cluster PPL1 e PPL2 dal lato posteriore del cervello, come illustrato nelle figure 2E e 2J. figure 2E e 2J in bianco mostra anteriore e vista posteriore della stessa cervello in alto ingrandimento, rivelando i diversi cluster di dA neuroni su entrambi i lati del cervello. Il bianco linee tratteggiate evidenziano il PAM prominente e gruppi appaiati anteriore laterale (PAL) nel lato anteriore del cervello (Figura 2E) nonché il PPL e cluster ppm nel lato posteriore del cervello (Figura 2J).

    Figure 3A e 3B un re sintesi dei risultati di quantificazione per alcuni dei cluster DA in W 1118 mosche. Abbiamo contato neuroni DA fetta per fetta e anche da 3D le immagini, che dovrebbe ridurre al minimo il conteggio impreciso ricostruiti. Si stima che i 3 giorni di età W 1118 mosche hanno una media di 27 neuroni DA generale nel PPM gruppo per il cervello, 16 neuroni dopaminergici nel cluster PPL per emisfero, 5 neuroni DA in PAL gruppo per emisfero (figura 3A), e 97 neuroni dA in ognuno dei cluster PAM (Figura 3B). Figura 3C è una ricostruzione rappresentante 3D dei neuroni dopaminergici nei cluster PAL e PAM, proiettate da fette di immagini ad alto ingrandimento coprono tutti i neuroni dA in questa regione. È evidente che rispetto ad altre parti, come il PAL, neuroni DA del cluster PAM hanno relativamente piccole dimensioni delle celle e deboli segnali di colorazione TH.

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    Figura 1:. Illustrazione grafica del protocollo Dissection per adulti Drosophila Cervello (A) Le mosche sono posizionati con il lato ventrale verso l'alto, e tenuti dal torace con la mano non dominante. Force è stata delicatamente applicata (frecce rosse) per le pinze per indurre l'inclinazione all'indietro della testa mosca e leggera estensione verso l'esterno della proboscide, esponendo la regione bianca trasparente sotto. (B) Pinza dalla mano dominante sono inseriti nella zona trasparente sotto proboscide, creando una incisione superficiale (freccia rossa). Si noti che la pinza che usiamo non hanno le estremità punta molto fine. (C) Pinze sono autorizzati a sfaldarsi attraverso la propria forza, come indicato dalle frecce rosse. Lo slancio generato aprendo le pinze rimuove gli occhi e esoscheletro, esponendo un cervello Drosophila relativamente pulito. La maggior parte della trachea vengono rimossi nel processo. ( Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    figura 2
    Figura 2:. DA neuroni rivelato con anti-tirosina idrossilasi (TH) anticorpo in maschio adulto Drosophila B pioggia (acquisita con un obiettivo 20x) Questa cifra comprende le immagini rappresentative del cervello adulto sezionati, ricostruito utilizzando immagini Z-stacked della regione del cervello di interesse ottenuto con il microscopio a fluorescenza composto. (AE) anteriore e (FJ) vista posteriore della stessa cervello adulto; (A & F) nuclei delle cellule sono stati ripresi dalla colorazione DAPI (bianco) e neuroni (C & H) were etichettati da marcatori pan-neuronale anti-Elav anticorpi (verde); Neuroni (B & G) DA vengono rivelati da anticorpi anti-TH (rosso). (S & I) Sovrapposizione di immagini per DAPI, TH e il trattamento Elav. (E & J) Visualizzazione ingrandita delle regioni del cervello con neuroni DA mostrate in bianco. Le linee tratteggiate evidenziano i cluster PAL e PAM nel anteriore del cervello e cluster PPL e PPM nel posteriore del cervello. La barra della scala rappresenta il 50 micron di tutti i pannelli. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 3
    Figura 3. Quantificazione dei DA neuroni in cervelli di maschio adulto w 1118 mosche (acquisita con un obiettivo 40X). (A & B) Quantificazione del DA neurons del giorno 3 maschio w 1118 mosche, rivelati da colorazione anti-TH. I dati sono rappresentati da baffo box trame mostrano valori minimo e massimo, come i valori anomali; così come il primo (Q1), secondo (Q2) e terzo (Q3) quartili. Il secondo quartile è rappresentato come valore medio. (A) PPM {(n = 28) Min: 21, Q1: 24, media: 27, Q2: 30, Max: 32}, PPL {(n = 26) Min: 10, Q1: 12, media: 16, Q2: 18, Max: 25} e {PAL (n = 24), min: 2, Q1: 4, media: 5, Q2: 5, max: 10} cluster; Grappolo (B) PAM {(n = 20) Min: 86, Q1: 94, media: 97, Q2: 97, Max: 99}. (C) immagine proiettata Un rappresentante che mostra neuroni DA nei PAM e PAL gruppi di maschi w 1118 mosche in 3 d. Barra della scala rappresenta il 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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    Discussion

    Con un crescente interesse ad utilizzare per adulti Drosophila cervello per studiare malattie umane del cervello, circuiti neuronali, e le funzioni cerebrali superiori, è necessario sviluppare metodi semplici e veloci per ottenere il cervello della mosca intatto per tutto il montaggio analisi, che è particolarmente importante per larga scalare schermi cervello-based. Il nostro metodo fornisce una semplice e facile da imparare approccio per sezionare una testa di mosca (spesso in meno di 10 s con esperienza) con ben conservato morfologia che è in gran parte cancellata dei tessuti associati. Poiché i cervelli sezionati sono ancora attaccate al resto dei corpi mosca, di solito si depositano sul fondo della provetta velocemente e sono facili da riconoscere e raccogliere durante le fasi di lavaggio e colorazione. Questo minimizza significativamente la perdita del campione che può essere un problema di primo piano nel trattamento dei campioni di cervello di piccole dimensioni fisiche. Questo problema può essere particolarmente importante per gli studi su larga scala. Il cervello può essere facilmente rimosso dal corpodopo il completamento del processo di colorazione, prima del montaggio.

    Durante la dissezione, è importante posizionare correttamente la mosca, mantenere gli angoli corretto durante la rimozione del esoscheletro dalla testa mosca, e delicatamente esercita la forza adeguata in esecuzione di ogni passaggio. Si raccomanda che le pinze sono posti perpendicolarmente l'uno all'altro per evitare decapitazione della mosca (Figura 1B). Come mostrato nelle immagini rappresentative in figura 2, i cervelli preparati usando questo protocollo producono risultati soddisfacenti. In questo esempio, ci siamo concentrati sui neuroni dopaminergici del cluster PAM di cervello adulto. Un cervello Drosophila in media ha totale di circa 280 neuroni DA per protocerebro, che sono distribuiti in gruppi distinti in diverse regioni del cervello con i modelli di proiezione distintivi e di uscita funzionale 11, 12. Caratterizzazione Precedente di neuroni dopaminergici in adulti di Drosophila cervello, including volare modelli di geni-malattia umana, come in mutanti Parkin, hanno in gran parte incentrata sulla PAL, i cluster PPL, e PPM che hanno relativamente grandi dimensioni delle celle e l'espressione di spicco del TH, il creatore standard utilizzato per l'etichettatura DA neuroni 13-18.

    Tuttavia, la maggior parte dei neuroni dopaminergici nel cervello mosca si trovano nei cluster PAM, con circa 100 neuroni DA per cluster. Rispetto alle cellule in altri cluster DA, neuroni dopaminergici del cluster PAM mostrano normalmente un livello inferiore di espressione tirosina idrossilasi e piccole dimensioni delle celle. Nei campioni preparati dal nostro protocollo dissezione e colorazione, i neuroni dopaminergici del cluster PAM possono essere chiaramente visualizzati e ripreso in alta qualità utilizzando un microscopio a fluorescenza composto, senza confocale. Data la sua gran numero, la quantificazione dei neuroni dopaminergici del cluster PAM di diversi background genetico potrebbe produrre risultati più affidabili e riproducibili. Si suggerisce che i neuroni DA nei clus PAMter rappresentano un altro sistema utile per lo studio della biologia DA e modellare disturbi DA-correlati, come il morbo di Parkinson.

    Nella nostra esperienza, la funzione apotome dal microscopio abbiamo usato può ridurre significativamente il segnale di fondo, soprattutto in esame campioni con spessore significativo, come l'intero cervello adulto mosca. Anche se microscopio confocale in grado di produrre immagini con più dettagli, più alto ingrandimento e di migliore qualità, è spesso in termini di tempo e denaro. Questo è particolarmente vero per l'imaging di un gran numero di campioni di spessore come il cervello adulto che richiedono serie di sezione Z-stack per la ricostruzione 3D chiare e analisi deconvoluzione. In questa prospettiva, la funzione apotome rappresenta un facile e conveniente alternativa per produrre immagini di qualità sufficiente (ad esempio, le immagini in figure 2 e 3).

    In studi cerebrali, è spesso necessario celle di immagine su entrambi sides dello stesso cervello. Ad esempio, neuroni DA sono presenti in cluster da entrambi i lati anteriore e posteriore del cervello. Tuttavia, a causa del suo spessore, dopo un cervello è montato sul vetrino, il lato lontano dalla sorgente luminosa (cioè, il lato rivolto verso la slitta di montaggio) solitamente producono segnali più deboli e immagini meno chiare quando ripreso con composti regolare e confocale microscopi. Montando i campioni tra i due vetrini di copertura, permette comoda capovolgimento dei campioni sul vetrino e successiva immagini di entrambi i lati della stessa cervello con simili intensità di segnale. Figura 2 è un esempio di immagini neuroni dopaminergici da entrambi i lati volare cervello utilizzando questo metodo, che ha mostrato intensità di segnalazione relativamente comparabili e la qualità delle immagini.

    Diversi approcci facili da seguire per dissezione adulti volare cervelli sono stati ben descritti 9, 10. Il nostro approccio fornisce un metodo alternativo che può pellicciather semplificare i processi di dissezione e colorazione di adulti volano cervello. Con studi più larga scala condotti per mappare l'intero circuiti neuronali del cervello, così come i suoi costituenti molecolari e cellulari, è prevedibile che dissezione e di imaging approcci automatizzati possono essere sviluppate per adulti di Drosophila cervello per realizzare high-throughput genetiche e farmacologiche schermi in vivo in questo modello genetico classico.

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    Acknowledgments

    Riconosciamo Mr. Enes Mehmet, la signora Kiara Andrade, la signora Pilar Rodriguez, Chris Kwok, e la signora Danna Ghafir per il loro immenso sostegno al progetto.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 Bloomington Drosophila Stock Center 51652 Balancer was switched to TM6B
    PBac{WH}parkf01950 Exelixis at Harvard Medical School f01950 Balancer was switched to TM6C
    NaCl Fisher Scientific S640-500
    Sodium Bicarbonate (NaHCO3 Fisher Scientific 02-003-990
    Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-500
    Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) Fisher Scientific 02-004-198
    Magnesium Chloride (MgCl2) Fisher Scientific 02-003-265
    D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876-500G Replaces glucose
    Calcium chloride dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G
    EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22 µm Pore Size Fisher Scientific GVWP14250
    Formalin Solution, 10% (Histological) Fisher Scientific SF98-20
    Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent Fisher Scientific 02-003-823
    Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
    Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points Fisher Scientific 17-456-055 Protocol does not require very fine points. 
    Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody Pel-Freez Biologicals P40101
    Rat-Elav-7E8A10 anti-elav The Developmental Studies Hybridoma Bank Clone 7E8A10
    Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate ThermoFisher Scientific A-21247
    Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific A-11037
    DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher Scientific 62248
    Propyl gallate powder Sigma-Aldrich P3130-100G
    Glycerol ACS reagent, ≥99.5% Sigma-Aldrich G7893-500ML
    Zeiss Axioimager Z1 Zeiss Quote
    Zeiss Apotome.2 Zeiss Quote
    Zen lite software Quote

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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