Immunostaining delle retine a montaggio intero con il metodo clarity tissue clearing

Questo protocollo consente lo studio della morfologia fine dei neuroni retinici e può fornire informazioni sui cambiamenti morfologici cellulari e subcellulari che si verificano negli stati di malattia. Questo metodo migliora significativamente la trasparenza ottica della retina e consente l’imaging tridimensionale ad alta risoluzione, il cablaggio del circuito e le strutture subcellulari fini dei neuroni retinali nella preparazione della retina ormonale. Enucleare gli occhi del mouse con forcep curve e trasferirli in una piccola piastra di Petri con 0,1 M PBS.

Colpire un piccolo foro lungo la giunzione cornea sclera con l’ago sotto il microscopio a dissezione, quindi trasferire l’occhio in formaldeide al 4% di potenza per un’ora. Trasferire l’occhio su un piatto con PBS. Al microscopio a dissezione, utilizzare le forbici di dissezione per tagliare tutto intorno alla giunzione corneosclerale.

Rimuovere la cornea e l’obiettivo. Quindi tagliarlo alla base del nervo ottico e staccare con cura la sclera con le forcep per isolare la retina. Fare quattro piccoli tagli uniformemente intorno alla retina e utilizzare un pennello a punta fine immerso in PBS per posare il lato GCL piatto verso il basso nella forma simile a un trifoglio su un piccolo taglio quadrato dalla carta filtrante di nitrocellulosa.

Raccogliere l’angolo della carta nitrocellulosa con le forcep e posizionarla in una piastra del pozzo 48 con formaldeide al 4% di potenza per un’ora, quindi trasferire la carta filtrante e la retina in un pozzo con PBS e lavare tre volte per cinque minuti ciascuna. Scongelare la soluzione A4P0 sul ghiaccio. Quindi trasferire la retina nella soluzione A4P0 e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius con delicata agitazione.

Aggiungere olio vegetale nel pozzo per coprire completamente la soluzione A4P0. Incubare in un bagno d’acqua a 40 gradi Celsius per tre ore senza tremare. Quindi lavare tre volte in PBS per cinque minuti per lavaggio.

Incubare la retina nel 10%Solfato di dodecil di sodio a 40 gradi Celsius per due giorni con tremori delicati, quindi trasferire la carta da filtro e la retina in PBS con Triton X-100 e lavare cinque volte per 90 minuti per lavaggio. Dopo il lavaggio finale, conservare la retina a quattro gradi Celsius in PBS-T con azide di sodio allo 0,01% o passare direttamente alla colorazione immuno. Rimuovere la retina dalla carta da filtro staccarla delicatamente con un pennello a punta fine in PBS-T.

Incubato in anticorpi primari diluito in soluzione di blocco per due giorni a 40 gradi Celsius con tremori delicati. Dopo l’incubazione, lavare cinque volte per 90 minuti in PBS-T. Incubare la retina con anticorpi secondari appropriati diluiti in soluzione di blocco per due giorni a 40 gradi Celsius con delicati scuotimenti.

Proteggere i campioni dalla luce per tutto il resto della procedura. Lavare la retina cinque volte per 90 minuti in tampone fosfato da 0,02 M. Infine incubare la retina in soluzione di corrispondenza dell’indice di rifrazione a base di sorbitolo a 40 gradi Celsius durante la notte con tremori delicati.

Delineare uno scivolo di copertura in vetro con un pennarello permanente a punta fine per contrassegnare un bordo quadrato sul retro di uno scivolo del microscopio di vetro. Capovolgere lo scivolo e utilizzare una siringa per tracciare il confine con una sottile linea di grasso siliconico sulla parte anteriore dello scivolo. Lasciare un piccolo spazio in un angolo per evitare la soluzione di montaggio in eccesso.

Trasferire la retina al centro dell’area delimitata e posizionarla con un pennello a punta fine in modo che si trovi piatta con il lato fotorecettore contro lo scivolo di vetro. Pipetta circa 60 microlitri di sRIMS in modo che copra la retina appiattita e si estenda ad un angolo dell’involucro. Assicurarsi che la retina rimanga piatta e in posizione.

Applicare lo scivolo di copertura, partendo dall’angolo con lo sRIMS e abbassarlo lentamente fino a tocchire il grasso su tutti i lati. Posizionare una pila di tre scivolamenti di copertura su ciascun lato della retina montata come distanziale. Utilizzare il bordo lungo di un’altra diapositiva per premere verso il basso lo scivolo di copertura in modo che il supporto sia piatto e uniforme.

Conservare le diapositive a quattro gradi Celsius fino all’imaging. Iniziare posizionando la diapositiva sullo stadio del microscopio e individuando il campione. Per ottenere immagini impilate Z di campioni, prima concentrati sul segnale in ogni canale singolarmente e imposta il tempo di esposizione o la velocità di scansione rispettivamente per la fluorescenza o i microscopi confocali.

Impostare l’intervallo per la pila Z impostando manualmente il piano focale nella parte superiore e inferiore dell’intervallo desiderato oppure impostando il punto medio e quindi specificando un intervallo intorno al punto medio. Regolare le dimensioni del passo o il numero di sezioni come desiderato. Acquisire l’immagine e salvare il file originale.

Quindi esportato come file TIF o in un altro formato desiderato. Utilizzare l’analisi delle immagini, software preferito per regolare la luminosità e il contrasto in ogni canale fino a ottenere una chiarezza ottimale sia nelle singole immagini che nel rendering tridimensionale della pila Z. Se lavorato con il protocollo CLARITY modificato è stata osservata una completa trasparenza ottica su tutto lo spessore della retina rispetto alle retine di controllo non lavorate.

Qui sono mostrate le immagini impilate Z per i coni etichettati Arrestin in ONL, TH etichettati DAC in INL e RGC contrassegnati RBPMS in GCL. La posizione relativa dei neuroni durante l’intero spessore della retina è stata osservata nell’immagine di sovrapposizione. La colorazione TH e la CHIAREZZA lavorate intere retine mount sono state confrontate con le immagini ottenute dalla preparazione standard.

I dendriti e i processi simili ad assion dei DAC sono stati rivelati più chiaramente in una retina elaborata a chiarezza che in una retina standard. I processi simili a axon di DAC mostravano strutture complete simili ad anelli in una retina di chiarezza rispetto a una retina standard. Le strutture ad anello della retina CLARITY prese con microscopia a fluorescenza erano quasi identiche a quelle osservate con microscopia confocale.

I processi simili a axon correvano anche verso la retina esterna. La colorazione immuno contro GluA2 e PSD-95 ha mostrato una puncta distinta, rivelando rispettivamente singoli recettori GluA2 contenenti recettori AMPA e siti post sinaptici putativi. Un’immagine sovrapposta mostrava alcuni puncta sui processi DAC.

I punti di co-localizzazione putativa sono stati presentati nei piani XZ, YZ e XY e TH co-localizzati chiaramente sia con GluA2 che con PSD-95. È importante che la retina rimanga piatta durante il processo di polimerizzazione dell’idrogel in modo che la retina cancellata possa essere piatta per il processo di montaggio e imaging.