Name: 差示扫描量热 - 用于评估蛋白质抗原的热稳定性和构象的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 了解差示扫描量热法评估蛋白质抗原热稳定性与构象的技术。该方法可直接测定热转变温度和解折叠能量，适用于疫苗配方开发与生物制品批次一致性监测。

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作者非常感谢 Joseph Mancini（曾任职于 GE Healthcare）、Pawel Czudec 和 Thomas Cage（Malvern Instruments limited）在差示扫描量热仪的安装与培训中所给予的支持，同时感谢 Sasmit Deshmukh 和 Webster Magcalas 的有益讨论。

1. 仪器启动
<ol>
	<li>打开差示扫描量热仪，并向样品池中加压，以抑制样品沸腾并防止在高温下产生气泡。通常通过向系统中通入氮气来实现。</li>
	<li>根据构成细胞的材料例如钽、金、铂 等等。），根据制造商推荐的压力调节氮气供应压力，以避免损坏细胞。例如，对于开发本实验方案所用的仪器，应将氮气供应压力设置为45 psi，压力超过80 psi可能会损坏细胞。</li>
	<li>确保所有清洗剂储液罐均加注至所需体积。每次样本运行后，需使用洗涤剂和水分别对细胞进行清洗和冲洗。</li>
	<li>将样品储存室的温度设置为适宜的值，建议为 5 °C，以在实验前维持样品的完整性。</li>
</ol>
2. 样品制备
<ol>
	<li>将样品在将用作实验参比的缓冲液中进行透析。或者，也可使用蛋白质纯化的最后一步收集的洗脱缓冲液（即柱洗脱液）。</li>
	<li>采用最合适的蛋白质浓度测定方法（如凯氏定氮法33或Lowry法34）测定蛋白质样品的浓度。为了客观比较结果，在同一项研究中应始终使用同一种测定方法。所需浓度范围可能因仪器型号而异。对于本方案所用的仪器，推荐的工作浓度范围为 0.5 – 1 mg/mL。</li>
	<li>将样品和参比缓冲液在真空条件下脱气，以去除可能引起体积不准确的微小气泡。对于较新型号的量热仪，此步骤可省略。</li>
	<li>在生物安全柜内使用微量移液器和无菌吸头，将样品及其对应的缓冲液成对加入与仪器兼容的96孔板中。前两对孔中加入缓冲液，最后两对孔中加入水，分别用于缓冲液-缓冲液扫描和水扫描。缓冲液-缓冲液扫描用于在样品测量前验证仪器的适用性（即评估仪器误差），并建立基线；水扫描则用于清洗检测池。</li>
	<li>用密封膜封住96孔板，并确保在将孔板移出生物安全柜前各孔已妥善密封，以避免样品污染。</li>
	<li>将孔板按正确方向放入仪器的样品存放舱中。</li>
</ol>
3. 实验参数设置
注意：根据仪器的不同，样品可通过注射器手动进样，或通过自动进样器自动进样。本实验中（即 在工业环境中，使用自动进样器以节省时间。
<ol>
	<li>使用采集软件，按照第 2.4 节所述的样品板加载顺序输入样品信息。&#160; 若已知浓度，请输入浓度值；否则，应在数据分析前将浓度值输入分析软件（见第 4.2 节）。</li>
	<li>选择在每次样品扫描前用去垢剂清洗池体的选项，并随后进行多次水冲洗，以确保池体内无去垢剂残留。</li>
	<li>将实验起始温度设为 20 °C，但可根据样品的已知特性进行调整。对于已知蛋白质，可采用预设的起始温度；而对于未知样品，则可采用较低的起始温度。</li>
	<li>设定实验的终止温度，e.g. 100 °C。最终温度可根据样品的已知特性进行调整。</li>
	<li>设定实验的扫描速率，e.g. 60 °C/h，此为典型扫描速率。然而，扫描速率也可根据样品的已知特性进行调整，e.g. 90 °C/h 或 120 °C/h。建议对未知样品在不同扫描速率下进行扫描，以评估其解折叠动力学。</li>
	<li>&#160;重新扫描样品以考察热解折叠过程的可逆性。若第二次扫描所得的焓值至少达到第一次扫描焓值的 80%，则认为该蛋白质的解折叠过程是可逆的。</li>
	<li>将实验后恒温器设为 10 °C，以保护量热计池体的完整性。</li>
	<li>在执行实验前，确认实验设置参数正确无误。若一切就绪，即可启动实验。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>从实验中获取原始数据，并逐个选取样本进行分析。减去参考扫描数据， 即 缓冲液，来自样品扫描。 
	注意：新型号的DSC仪器可自动执行参比扣除。</li>
	<li>如果根据第3.1节省略了样本浓度值，请在此输入样本浓度值。</li>
	<li>对获得的热谱图进行基线拟合并扣除基线，以校正蛋白质折叠态与去折叠态之间热容的差异，这种差异源于蛋白质去折叠时疏水基团暴露于水中所致。根据样品DSC谱图的形状，可采用线性或三次曲线拟合。为保持研究过程中的一致性，必须使用相同类型的拟合方法。 例如 实时稳定性研究。此步骤是处理曲线以进行峰面积积分并获得相变焓所必需的。</li>
	<li>使用非线性最小二乘法拟合进行峰面积积分。根据产品知识，应用两态或非两态模型。对于单一协同性热转变过程，可采用两态模型；对于未知蛋白质，在获得进一步产品信息之前，应采用非两态模型。如适用，利用仪器软件的迭代曲线拟合功能调整曲线拟合，直至残差达到最小且拟合曲线与实验数据良好吻合 卡方 数值保持不变。</li>
	<li>获得的结果将显示转变温度中点（Tm）、量热焓（ΔH）和范特霍夫焓（ΔH）的数值。VH样品的体积。</li>
</ol>

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</ol>

所有作者均为赛诺菲巴斯德公司的员工。本研究由赛诺菲巴斯德公司资助，本视频文章的出版费用亦由赛诺菲巴斯德公司支付。&#160; 作者与任何在经济利益上与本文所述主题或材料存在冲突的组织或实体均无相关隶属关系或财务牵连。这些利益关系包括受雇、咨询、持股或期权、以及版税等。
本手稿的撰写过程中未使用任何写作辅助服务。

该方法已成功应用于多种表征测试方案中，包括稳定性研究和产品可比性研究21。在实时稳定性研究中，DSC用于监测生物制品的Tm，并随时间推移估算其Fa，以确定产品的有效期。在产品可比性方面，DSC用于评估工艺和生产设施变更，以及关键生产工艺步骤对各生产批次产品结构构象的影响。这通常涉及将生产批次的ΔH与被指定为理想产品的参比物质进行直接比较。此外，DSC已被证明是产品配方研究中有用的分析工具37。通过测定蛋白质在不同缓冲液和不同浓度下的Tm，可确定能为该蛋白质提供最高稳定性的配方。
为确保该方法的可靠性和结果的客观性，在同一项研究中，每次实验的检测参数应保持一致。例如，疫苗配方研究）。然而，该程序可根据不同蛋白质的物理特性进行调整。一种可行的修改方法是改变实验的扫描速率 38, 39容易在加热时形成聚集体的蛋白质在较快的扫描速率下进行检测例如， 120 °C/h）以避免聚集体对热转变曲线的干扰以及堵塞量热仪的毛细管。值得注意的是，扫描速率可能影响DSC实验的结果。 38某些蛋白质在升温速率增加时，观察到热转变峰变宽；然而，Tm 保持相对稳定 38此外，样品制备过程中的透析和脱气步骤对于获得准确结果也极为关键。 31透析可确保样品与缓冲液之间的唯一差异在于蛋白质；因此，样品吸收的所有额外热量均可归因于蛋白质的热容。脱气可确保体积分析的精确性，因为热力学参数的外推假设变性过程是在恒定体积和压力下进行的。 31假设中的恒压部分通过按照操作步骤1.1节对系统进行氮气加压来实现。
与圆二色光谱法（CD）和荧光光谱法等其他测定蛋白质构象稳定性的方法相比，差示扫描量热法（DSC）在商业应用中具有多项优势，包括节省成本和时间。首先，差示扫描量热仪的绝热设计使其在测量热稳定性时具有比CD和荧光光谱仪器更高的温度精确度6。其次，与CD不同，DSC数据的准确性不依赖于蛋白质的螺旋性39, 40；然而，CD可提供有关二级结构解折叠的额外信息，可与DSC结果相互补充41。此外，DSC系统的加压设计使得在不使样品沸腾的情况下即可在宽温度范围内进行测试；因此，多种不同的蛋白质均可通过DSC进行分析。
尽管差示扫描量热法（DSC）是一种测定生物制品热稳定性的相对较快且直接的方法，但它也存在一些局限性。首先，基线扣除步骤在原始数据分析中引入了一定程度的人为不一致性，因此不同操作者之间可能会观察到结果的差异。其次，差示扫描量热仪对样品浓度有最低要求，而在大规模生产条件下可能难以达到该浓度。第三，不可逆热变性的焓变（ΔH）并非绝对值，这意味着在类似情况下推导出的吉布斯自由能变（ΔG，蛋白质稳定性的指标）可能具有误导性。此外，该方法最适合用于纯化的样品。若存在杂质，若其与被研究的蛋白质发生相互作用，可能导致Tm发生偏移；若无相互作用，则可能在热谱图上出现新的热转变峰。无论哪种情况，这些额外的特征都可能被错误地归因于样品本身，从而影响结果的解读。尽管存在这些局限性，只要正确实施，DSC仍是一种可靠的方法，可提供有关蛋白质解折叠过程的详细热力学信息42。
综上所述，DSC 作为疫苗产品及其中间体构象分析的检测工具具有显著优势。对于同一种产品的多个批次所获得的 Tm 和 ΔH 两个参数，可建立经验性基线，用于评估工艺变更、配方以及储存条件对蛋白质和病毒抗原三级结构及稳定性的影响21, 43。

差示扫描量热法（DSC）是一种实验方法，可直接测量在受控温度变化过程中，样品相对于参比物吸收热能的差异1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12。该方法在差示扫描量热仪中进行，通过同时向样品池和参比池中引入热能，并在时间进程中以相同方式升高两个池的温度2, 13, 14。由于样品与参比物的组成不同，升高两池温度所需的能量也不同2, 12, 13。因此，用于补偿两池之间温差所需的额外能量被测量，并直接关联到样品的特定热力学性质1, 3。
20世纪60年代，Perkin Elmer公司的M.J. O'Neil和E. Watson开发了首台差示扫描量热仪，用于测量固体材料的热流2, 3, 4。与此同时，格鲁吉亚共和国（前苏联）物理研究所的P.L. Privalov和D.R. Monaseldze E.L.研制出一种独特的差示绝热量热仪，可用于生物化学研究5, 6。随后，格鲁吉亚共和国物理研究所Andronikashvili团队利用DSC报道了纤维状和球状蛋白质、DNA及RNA等生物大分子的热容7, 8, 9。Sturtevant10, 11, 12、Brandts13以及Privalov14, 15, 16等人领导的多个研究团队致力于DSC理论及其实际应用的发展，以研究蛋白质去折叠过程的热力学细节。DSC在研究噬菌体、叶绿体、磷脂液晶及肉类蛋白质等大型超分子结构方面的价值也已有报道17, 18, 19, 20。
DSC 现已普遍应用于药物研发中，用于评估生物大分子（尤其是蛋白质）的热稳定性 1, 21, 22这主要是由于实验所用仪器在灵敏度和自动化方面的进步所致 23, 24在此，利用DSC实验的最终结果，即摩尔热容随温度的变化，来估算&#160; 以下热力学参数（热容变化（&#8710;Cp），焓（&#8710;H），熵（&#8710;S）和吉布斯自由能（&#8710;G）使用以下公式计算：
<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq1.jpg" /> &#160; (1)
<img alt="公式 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq2.jpg" />&#160;&#160; (2)
<img alt="公式 3" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq3.jpg" />&#160;&#160; (3)
<img alt="公式 4" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq4.jpg" /> &#160; (4)
<img alt="公式 5" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq5.jpg" />&#160;&#160; (5)
其中，Cp 为测得的热容；q 为流入测试材料的热流；T0 分别为转变的初始温度和最终温度 22, 25值得注意的是，上述方程适用于可发生两态转变且具有可逆热变性的单结构域蛋白质。 22. 更复杂蛋白质的分析（例如，非两态蛋白质和寡聚体）已被Friere报道 等 26；Johnson 等 27；以及 Kasimova 等. 28.
为了确定蛋白质在热变性过程中是否经历两态转变或形成中间态，需将实验测得的焓变值（ΔH；也称为量热焓 ΔHCal）与以下给出的范特霍夫方程计算得到的焓变值（也称为范特霍夫焓；ΔHVH）进行比较：
<img alt="公式 6" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq6.jpg" /> &#160; (6)
其中 Tm 是转变的中点温度，R 为理想气体常数（1.987 cal mol-1 K-1Y 是处于去折叠状态的蛋白质群体所占的比例 16, 29。如果 &#916;HVH 等于 &#916;H钙；或 &#916;HVH/&#916;H钙 等于1时，蛋白质会发生 &#34;全或无&#34; 转换即 两态转变 16, 25, 29。然而，如果 &#916;HVH 小于 &#916;H钙；或 &#916;HVH/&#916;H钙 小于1时，蛋白质发生非两态转变 16, 25, 29. 比例 &#916;HVH/&#916;H钙 也对应于作为热力学协同单元或结构域熔解的蛋白质结构的比例 26.
上述提到的热力学参数，如 ΔG 和 ΔH，可提供有关蛋白质（包括生物制剂）热稳定性的有用信息30。然而，本文将重点讨论 Tm 和 ΔH，因为它们是本实验方案所报告的数值。Tm 是相变过程的中点温度，此时蛋白质的折叠态与去折叠态处于平衡状态（即，ΔG = 0）25, 31。蛋白质的 Tm 越高，其热稳定性也越高31。ΔH 对应于差示扫描量热法（DSC）实验结束时生成的热容-温度曲线图（也称为热谱图）中峰形下方的面积16, 25。它表示使蛋白质变性所需的能量，可用于通过以下公式估算蛋白质制剂中的活性组分比例（Fa）（即，样品中具有活性构象的蛋白质所占的比例）：
<img alt="公式 7" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq7.jpg" /> &#160; (7)
其中，ΔH 是实验测得的蛋白质样品的焓变值，Q 是已充分表征的参照蛋白或标准化蛋白的焓变值22。Fa 的估算对于实时监测产品的稳定性以及按照 ICH 指南要求在胁迫条件下开展稳定性研究具有重要意义32。比较 ΔH 还可提供有关蛋白质三级结构构象紧密程度的信息31。
本方案详细介绍了在工业环境中评估蛋白质热稳定性的操作流程，已广泛应用于疫苗的配方研发。该方法采用自动化的差示扫描量热仪开发，对于低至300 µg/mL的蛋白质浓度亦可获得可重复的实验结果。

<table><tbody><tr><td>差示扫描量热仪</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>28428948 (Via GE Healthcare)</td><td>配备自动进样器，可自动将样品加入样品池，减少人工操作和误差。</td></tr><tr><td>Contrad 100</td><td>Decon Laboratories Inc</td><td>1504</td><td>使用前用水稀释至20%</td></tr><tr><td>500 &amp;micro;L 聚丙烯圆底96孔板</td><td>Canadian Life Science</td><td>ML072100</td><td>其他供应商的等效板（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，VW）也可使用</td></tr><tr><td>MicroCal ThermoVac&amp;nbsp;</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>N/Ap</td><td>随 Cap VP DSC 一同提供</td></tr><tr><td>生物安全柜&amp;nbsp;</td><td>Labconco</td><td>Logic+ - A2</td><td>用于样品制备的生物防护层流柜</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 透析盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>66810 或 66380</td><td>用于样品和缓冲液的平衡</td></tr></tbody></table>

差示扫描量热法——一种评估蛋白质抗原热稳定性和构象的方法

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

差示扫描量热法（DSC）是一种分析技术，用于测量样品摩尔热容随温度的变化。对于蛋白质样品，DSC 曲线可提供有关其热稳定性的信息，并在一定程度上作为可用于评估蛋白质结构构象的结构“指纹”。该方法使用差示扫描量热仪进行，可测定热转变温度（熔解温度；Tm）以及破坏维持蛋白质三级结构相互作用所需的能量（焓变；∆H）。通过比较不同制剂配方或不同生产批次之间的数据，可发现所获得参数值的差异，从而反映其热稳定性与结构构象的差异。本文提供了 DSC 在工业环境中用于稳定性研究以及监控关键生产工艺步骤的实例数据，以证明该方案的有效性。与其他评估蛋白质构象热稳定性的方法相比，DSC 具有成本效益高、样品前处理步骤少、并能提供蛋白质解折叠过程完整的热力学谱图等优势。

大多数DSC实验的原始数据以热流速率对温度的曲线图形式呈现，因为量热仪实际测量的是样品溶液与缓冲液之间热流入速率的差异 35因此，如果两个细胞（即 样品池和参比池在实验过程中含有相同溶液时，扫描所得的原始数据应为一条无明显峰形的平直线。任何观察到的峰均可归因于仪器误差。例如 受损或受污染的细胞），因此在样品分析前运行缓冲液扫描是一种适当的系统适用性测试。 图1 展示了典型缓冲液扫描的结果，表明在样品分析之前，量热仪处于良好的工作状态。
图2展示了对两种蛋白质样品的不同批次进行DSC实验所获得的原始数据。如前所述，观察到的峰反映了样品与其相应缓冲液之间热通量的差异。样品浓度的差异可能导致量热计记录的热容发生变化；然而，这些变化会在样品分析过程中根据操作步骤的第4.2节进行归一化处理。较高浓度还可能揭示在较低浓度下不参与相变的额外热力学结构域。此外，每一个相变代表一个热力学结构域，该结构域可能包含蛋白质的一个或多个结构域36。在此情况下，蛋白质1具有三个协同熔解的结构域。
图3 展示了对蛋白质1和2的原始数据进行分析后得到的结果 图2, 即，经基线扣除和迭代曲线拟合后，所得热谱图已针对扫描速率（由分析软件中预设算法自动完成）和浓度进行了归一化处理，从而以可比较的热容-温度曲线图呈现实验结果。分析软件利用热容-温度曲线图中的数据，例如 Tm 和 &#916;Cp，根据蛋白质去折叠的协同性，利用上述方程的不同形式推导其他热力学参数。
在检测未知样品时，设置合适的温度范围至关重要。否则，可能会得到不完整的热变性曲线，如图4所示。尽管可以从此类曲线中推导出Tm值，但无法准确测定ΔH。因此，必须使用更宽的温度范围重新测试样品，以完整捕获热转变过程。某些蛋白质在完全变性后还容易形成聚集体，导致变性后热容升高：这通常表现为不完整的热变性曲线，如图2B所示。然而，通过提高最终温度重新测试，有助于确认热变性曲线该区域是否发生了构象转变，还是仅仅由蛋白质聚集体的吸热效应所致。
热稳定性是工业中蛋白质及基于蛋白质的产品最重要的物理性质之一37。在制药领域，热稳定性用于评估生物制剂在不同条件下的稳定性，包括配方缓冲液以及湿度和温度等环境因素。它还用于监测关键的生产步骤（例如，纯化和去毒），以确保不同生产批次间蛋白质构象的一致性。图5和图6分别展示了利用差示扫描量热法（DSC）研究化学去毒和储存条件对两种不同蛋白质的稳定性和结构构象的影响。Tm和∆H的显著差异分别表明了构象变化和蛋白质降解。此外，图6中第三个转变峰的消失进一步说明了某一结构域的降解，该现象在使用多角度光散射结合尺寸排阻色谱（SEC-MALS）分析样品时，通过分子量的降低得到了证实（数据未显示）。
<img alt="图 1" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig1.jpg" /> 
图 1：缓冲液扫描图谱。 每次扫描的梯度相似，且无可见峰，表明仪器处于良好工作状态，并能产生可重复的结果。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图2" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig2.jpg" /> 
图2：DSC实验采集的原始数据。这些曲线图很好地展示了实验运行后获得的未经分析（原始）数据（即在基线扣除和曲线拟合之前的数据）。每条曲线代表一个生产批次。蛋白质2在加热时更容易发生聚集，导致热谱图的相变后区域在100 °C以上出现热容增加的现象。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig3.jpg" /> 
图3：分析后的DSC数据。这些图谱很好地展示了经过基线校正和曲线拟合后的DSC数据（即基线扣除并完成曲线拟合后）。蓝色线条代表基线扣除后的热谱图，红色线条代表与热谱图拟合最优的曲线。(A) 蛋白1样品#12的Tm 和ΔH分别为80.16 °C和1.69 × 106 cal/mol。(B) 蛋白1样品#13的Tm 和ΔH分别为80.15 °C和1.71 × 106 cal/mol。(C) 蛋白2样品#21的Tm 和ΔH分别为75.01 °C和4.08 × 106 cal/mol。(D) 蛋白2样品#22的Tm 和ΔH分别为75.67 °C和4.22 × 106 cal/mol。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="图4" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig4.jpg" /> 
图4：不完整的热变性曲线图。 对 Protein 1 在温度范围不足的条件下采集的原始数据。该实验的终止温度设定为 90 °C，未能涵盖蛋白质的完整相变过程，相比之下，图2A 的实验终止温度设定为 120 °C。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig5.jpg" /> 
图5：化学解毒对蛋白1三级结构影响的分析数据。（A） 蛋白1在其天然构象下是一种毒素，并具有其Tm 在 56.84 &#176;C 和 &#916;H 在 2.57 × 105 cal/mol （B） 蛋白1的去毒形式（即 类毒素）具有 Tm 和 &#916;H 值 81.01 &#176;C 和 1.89 x 106 cal/mol。因此可以得出结论，脱毒步骤引入了某种形式的构象变化，使蛋白质1的结构更加稳定（更高的Tm) 转化为其解毒形式。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图6" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig6.jpg" /> 
图6：分析数据展示储存条件对蛋白质3构象的影响。 这些图表说明了储存温度（2 - 8 &#176;C) 对蛋白质3在30周内的稳定性和三级结构的影响m 和 &#916;蛋白质3在8处的H值th （A） 和 38th 周 （B） 储存条件如下所示 表1 如下。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>样品</td>
			<td>Tm 1 (°C)</td>
			<td>∆H 1 (cal/mol)</td>
			<td>Tm 2 (°C)</td>
			<td>∆H 2 (cal/mol)</td>
			<td>Tm 3 (°C)</td>
			<td>∆H 3 (cal/mol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein 3 在 2-8 °C 下储存 8 周</td>
			<td>61.91</td>
			<td>1.71 x 105</td>
			<td>75.54</td>
			<td>2.17 x 105</td>
			<td>90.29</td>
			<td>4.17 x 105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein 3 在 2-8 °C 下储存 38 周</td>
			<td>61.87</td>
			<td>1.66 x 105</td>
			<td>75.18</td>
			<td>1.46 x 105</td>
			<td>90.22</td>
			<td>5.76 x 105</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：Tm 和 &#916;蛋白3在8处的H值th 和 38th 2 - 4 ℃ 储存一周 8 &#176;C. 尽管Tm 两个时间点的数值相似，其差异在于 &#916;H值表明，在指定的储存条件下，蛋白质3的三级结构在30周内发生了降解。

差示扫描量热法可测量蛋白质变性所需的热转变温度及总热能。所得结果用于评估疫苗制剂中蛋白质抗原的热稳定性。

差示扫描量热法（DSC）是一种分析技术，用于测量样品摩尔热容随温度的变化。在……

本实验的总体目标是在工业环境中利用差示扫描量热法评估蛋白质的热稳定性和结构构象。差示扫描量热法通过测定样品在不同温度下的摩尔热容，已被成功用于评估蛋白质的热稳定性和结构构象。该方法相对简单，不依赖于蛋白质的二级结构螺旋性或内在荧光基团，而其他许多生物物理方法则存在此类依赖性。该技术的另一个优势在于，它能够直接测量热转变温度以及破坏维持蛋白质三级结构相互作用所需的能量。当与解折叠焓变结合使用时，热转变温度可作为监测生物制品生产工艺批次间一致性的有用参数。该方法的可视化演示可作为一种互动媒介，有效帮助新用户掌握关键步骤。首先，打开差示扫描量热仪。然后向系统中通入氮气。这将增加样品池内的压力，以抑制样品沸腾，并防止在高温下产生气泡。根据流通池的构成材料，按照制造商推荐的压力调节氮气供应压力，以避免损坏流通池。确保所有清洗剂储液罐均加注至所需体积。所需的清洗剂包括用于清洗流通池的洗涤剂，以及每次样品运行后用于冲洗流通池的水。将样品保存室的温度设置为适宜的值，建议为5摄氏度，以在实验前维持样品的完整性。必须使样品与缓冲液达到平衡，以确保溶液之间的唯一差异在于蛋白质。因此，所观察到的热容差异可准确归因于蛋白质。使用适当的蛋白质浓度测定方法（如Lowry法）确定蛋白质样品的浓度。对于本实验方案所用的仪器，建议的工作浓度范围为每毫升0.5至1毫克蛋白质。将样品对实验中用作参比的缓冲液进行透析。将样品和参比缓冲液在真空条件下脱气，以去除可能引起体积不准确的微小气泡。在层流生物安全柜中操作，使用微量移液器和无菌吸头，将样品与其相应的缓冲液成对加入96孔板中。前两对孔中加入缓冲液，用于进行缓冲液-缓冲液扫描，以在样品测量前验证仪器的适用性。在最后两对孔中加入水，用于水扫描以清洗细胞。然后用密封膜覆盖96孔板。在将孔板移出生物安全柜之前，确保各孔已正确密封，以避免样品污染。最后，将培养皿以正确的方向放入样品仓中。使用采集软件，按照培养皿加载的顺序输入样品信息。如有，输入蛋白质浓度。否则，在进行数据分析之前，将浓度输入分析软件。选择在每次样品扫描前用去垢剂清洗样品池的选项。清洗后应进行多次水冲洗步骤，以确保样品池中无去垢剂残留。将实验的起始温度设定为20摄氏度，该温度可根据样品性质进行调整。对于已知蛋白质，可使用预设的起始温度；而对于未知样品，则可采用较低的起始温度。然后设定实验的终止温度。最终温度也可能根据对样品的已有了解而有所不同。接下来，设置实验的扫描速率。建议在不同扫描速率下对未知样品进行扫描，以评估其解折叠的动力学特性。设置采集软件以重新扫描样品，以检测热转变的可逆性。如果第二次扫描得到的焓值至少为第一次扫描焓值的80%，则认为蛋白质的解折叠过程是可逆的。将实验后恒温器设定为10摄氏度，以保持量热计池的完整性。在执行实验前，确认实验设置参数正确无误。若所有条件均已具备，则开始实验。实验结束后，按照文本方案中所述进行数据分析。分析时，需手动进行基线扣除。此步骤的一致性对于获得可比较的结果至关重要。此处显示的是包含缓冲液和水扫描的实验运行代表性原始数据。待分析的样品为毒素的天然状态和脱毒状态。各样品的扫描数据被分别处理，以获得每种样品的熔解温度和焓值。对于天然状态，其熔解温度为 55.55 摄氏度，毒素的焓值为 3.157 × 10⁵ 卡路里/摩尔。相反，该毒素在脱毒状态下的熔解温度为81.21摄氏度，焓值为3.656 × 10⁵卡路里/摩尔。对毒素在天然状态和脱毒状态下处理后的数据进行叠加显示，根据熔解温度数值，脱毒样品比其天然状态具有更高的热稳定性。这同时也表明，脱毒过程导致了毒素三级结构的构象变化。在进行该实验操作时，必须注意提供充足的洗涤剂和水，以防止细胞与注射器之间的交叉污染，因为它们的洁净度对获得准确结果至关重要。观看本视频后，您将充分理解差示扫描量热法作为一种评估蛋白质热稳定性和构象的方法。您还将能够从所得的热变性曲线中做出有意义的推断。完成此操作后，可进一步采用其他方法（如圆二色性）来探究蛋白质去折叠过程中二级结构变化的相关问题。通过收集同一产品多个批次的数据，已建立经验基线，用于分析工艺变更、配方及储存条件对疫苗生产中蛋白质抗原结构构象的影响。

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Biochemistry

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