Calorimetría diferencial de barrido - un método para evaluar la estabilidad térmica y la conformación del antígeno proteico

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la estabilidad térmica y la conformación estructural de las proteínas en un entorno industrial mediante calorimetría diferencial de barrido. La calorimetría diferencial de barrido mide la capacidad calorífica molar de las muestras en función de la temperatura y se ha utilizado con éxito para evaluar la estabilidad térmica y la conformación estructural de las proteínas. Este procedimiento relativamente sencillo no depende de la helicidad estructural o de los fluoróforos intrínsecos, como es el caso de otros métodos biofísicos.

Otra ventaja de esta técnica es que mide directamente la temperatura de transición térmica y la energía necesaria para interrumpir la interacción, estabilizando la estructura terciaria de las proteínas. Cuando se utiliza junto con la fascinación del desdoblamiento, la temperatura de transición térmica puede servir como un parámetro útil para controlar la consistencia de los procesos de fabricación de productos biológicos. La demostración visual de este método puede servir como un medio interactivo para ayudar eficazmente a los nuevos usuarios con los pasos críticos.

Para comenzar, encienda el calorímetro diferencial de barrido. A continuación, suministre nitrógeno al sistema. Esto aumentará la presión en las células para suprimir la ebullición de las muestras y evitará la formación de burbujas a temperaturas elevadas.

Dependiendo del material constitutivo de la celda, ajuste la presión del suministro de gas nitrógeno de acuerdo con la presión recomendada por el fabricante para evitar dañar la celda. Asegúrese de que todos los depósitos de agente de limpieza estén llenos hasta el volumen requerido. Los agentes de limpieza necesarios incluyen detergente para lavar la celda y agua para limpiar la celda después de cada tirada de muestra.

Ajuste la temperatura del compartimento de retención de muestras a un valor adecuado, preferiblemente cinco grados centígrados, para mantener la integridad de la muestra antes del experimento. Es importante equilibrar la muestra con el tampón para garantizar que la única diferencia entre las soluciones sea la proteína. Por lo tanto, la diferencia observada en la capacidad calorífica se puede atribuir correctamente a la proteína.

Determine la concentración de la muestra de proteína utilizando un método adecuado de determinación de la concentración de proteína, como el método de Lowry. Para el instrumento utilizado en este protocolo, el rango de trabajo preferible es de 0,5 a un miligramo de proteína por mililitro. Diálisar la muestra contra el tampón que se utilizará como referencia para el experimento.

Desgasifique la muestra y el tampón de referencia en el vacío para eliminar las microburbujas que pueden causar inexactitudes en el volumen. Al trabajar en un gabinete de biocontención de flujo laminar, utilice una micropipeta y puntas estériles para cargar las muestras en su respectivo tampón en pares en placas de 96 pocillos. Llene los dos primeros pares de pocillos con tampón para realizar escaneos de tampón y verificar la idoneidad del instrumento antes de la medición de la muestra.

Llene los últimos dos pares de pozos con agua para que el escaneo de agua limpie las celdas. A continuación, cubra la placa de 96 pocillos con una película de sellado. Asegúrese de que los pocillos estén debidamente sellados antes de sacar la placa de la cabina de bioseguridad para evitar la contaminación de la muestra.

Finalmente, coloque la placa en el compartimento de retención de muestras en la orientación adecuada. Con el software de adquisición, introduzca la información de la muestra en el orden en que se cargó la placa. Introduzca las concentraciones de proteínas, si están disponibles.

De lo contrario, introduzca la concentración en el software de análisis antes del análisis de datos. Seleccione la opción que asegure la limpieza de la celda con detergente antes de cada escaneo de muestra. La limpieza debe ir seguida de varios pasos de enjuague con agua para garantizar que no queden residuos de detergente en las celdas.

Ajuste la temperatura inicial del experimento a 20 grados centígrados, que puede variar según la muestra. Para proteínas conocidas, se puede utilizar una temperatura de inicio predeterminada, mientras que se puede aplicar una temperatura de inicio más baja para muestras desconocidas. A continuación, establezca la temperatura final del experimento.

La temperatura final también puede variar en función del conocimiento previo de la muestra. A continuación, establezca la velocidad de escaneo del experimento. Es aconsejable escanear muestras desconocidas a diferentes velocidades de escaneo para evaluar la cinética del despliegue.

Configure el software de adquisición para volver a escanear las muestras y examinar la reversibilidad de la transición térmica. El despliegue de una proteína se considera reversible si la entalpía obtenida para la segunda exploración es al menos el 80% del valor de entalpía de la primera exploración. Ajuste el termostato posterior al experimento a 10 grados centígrados para preservar la integridad de la celda del calorímetro.

Compruebe que los parámetros de configuración del experimento son correctos antes de ejecutarlo. Si todo está en su lugar, comienza el experimento. Después del experimento, realice el análisis de datos como se describe en el protocolo de texto.

Para el análisis, la sustracción de la línea base se realiza manualmente. La consistencia en este paso es crucial para obtener resultados comparables. Aquí se muestran datos brutos representativos de una ejecución experimental, incluidos los escaneos de tampón y agua.

Las muestras que se analizan son toxinas en su estado nativo y desintoxicado. Los escaneos de muestra se procesan por separado para derivar los valores de temperatura de fusión y entalpía para cada muestra. Para el estado nativo, la temperatura de fusión es de 55,55 grados centígrados y la entalpía de la toxina es de 3,157 veces 10 a la quinta calorías por mol.

Por el contrario, la temperatura de fusión de la toxina en su estado desintoxicado es de 81,21 grados centígrados y la entalpía es de 3,656 veces 10 a la quinta calorías por mol. La superposición de los datos procesados de la toxina en sus estados nativo y desintoxicado demuestra que la muestra desintoxicada es térmicamente más estable que su estado nativo de acuerdo con los valores de temperatura de fusión. También indica que el proceso de desintoxicación introduce cambios estructurales en la estructura terciaria de la toxina.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar proporcionar un suministro adecuado de detergente y agua para evitar la contaminación cruzada de la celda y la jeringa, ya que su claridad es crucial para obtener resultados precisos. Después de ver este video, tendrá una buena comprensión de la calorimetría diferencial de barrido como método para evaluar la estabilidad térmica y la conformación de las proteínas. También podrá realizar deducciones significativas de las ejecuciones térmicas resultantes.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el dicroísmo circular para responder preguntas adicionales sobre los cambios en las estructuras secundarias durante el despliegue. Los datos recopilados para una variedad de lotes del mismo producto se han utilizado para crear líneas de base empíricas para examinar el impacto de los cambios en el proceso, la formulación y las condiciones de almacenamiento en la conformación de la estructura de los antígenos proteicos para la producción de vacunas.