된 유의 동위 원소 표지 자매 히스톤과 뉴 클레오의 재구성

Biochemistry

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Summary

이 프로토콜은 차등 동위 원소 표지 자매 히스톤를 포함하는 뉴 클레오의 재구성에 대해 설명합니다. 동시에, 비대칭 번역 후 개질은 뉴 클레오 히스톤 premodified 복사를 사용한 후 발생 될 수있다. 이러한 제제는 즉시 고해상도 NMR 분광법을 이용하여 두 자매 히스톤 동시에, 수정 누화 메커니즘을 연구하는데 사용될 수있다.

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Liokatis, S. Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones. J. Vis. Exp. (121), e55349, doi:10.3791/55349 (2017).

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Abstract

비대칭으로 변형 된 뉴 클레오는 번역 후 수정 (PTMS)의 고유 한 세트로 장식 히스톤의 두 복사본 (자매 히스톤)를 포함한다. 그들은 새로 설립하고 기능적인 의미의 알 수없는 수단 종을 식별된다. 현재 분석 방법은 뉴 클레오 솜 자매 히스톤에 PTMS의 복사 특정 발생을 감지 할 불충분하다. 이 프로토콜은 차등 동위 원소 표지 자매 히스톤를 포함하는 뉴 클레오의 체외 재구성을위한 생화학 적 방법을 제시한다. 생성 된 복합체는 히스톤 서브 콤플렉스의 리 폴딩 동안 premodified 히스톤 풀을 포함 한 후,도 비대칭으로 변형 될 수있다. 이러한 비대칭 뉴 클레오 제제는 용이하게 될 핵 자기 공명 (NMR) 분광법을 사용하여 비대칭 미리 혼입 PTM에 의해 부과 된 변형 누화 메커니즘을 연구하는 히스톤 개질제 효소와 반응 할 수있다. 특히, 개질 반응실시간 각각 동위 유형에 맞는 NMR 상관 실험의 종류를 수행하여 두 자매 히스톤에 독립적으로 매핑 될 수있다. 이 방법은 뉴 클레오 솜 착체 비대칭 PTM 패턴의 형성과 증식에 기여 누화 메커니즘을 연구 할 수있는 수단을 제공한다.

Introduction

진핵 생물 DNA 단단히 염색질로 세포 핵 내에서 패키지됩니다. 염색질의 기본 빌딩 블록은 두 복사본 네 핵심 히스톤의 각 (H3, H4, H2A, H2B)들로 이루어지는 복합 octameric 감싸 DNA의 ~ 147 염기쌍을 포함하는 뉴 클레오 코어 입자이다. 히스톤 단백질 번역 후 수정 (PTMS)의 과다 항구. 이러한 공유 치환은, 직접적으로 시스템의 물리 화학적 성질에 의해 영향을 간접적 염색질 개조 활동 1, 2, 3을 채용하여 염색질 구조에서의 변화를 유도한다. 그 수단으로 히스톤 PTMS 그러므로, 모든 DNA 기반 세포 기능 4를 조절, 염색질 액세스를 제어합니다.

PTMS 주로 뉴 클레오 - 통합 코어 히스의 구조화 N- 말단 부분 (꼬리)에 히스톤 - 수정 효소 시스템으로 설치됩니다NES. 인해 히스톤 꼬리 비교적 짧은 순서에 많은 변형 사이트, PTMS는 유도 또는 후속 개질 반응, 개질 누화 (5)으로 알려진 효과를 차단하여 서로 영향을 미친다. 때문에 뉴 클레오의 전체적인 대칭 구조의, 수정 반응 및 크로스 토크 메커니즘은 각각의 뉴 클레오 솜 히스톤 (자매 히스톤)의 두 복사본에 유사하게 발생하는 것으로 생각되었다. 이 개념은 최근 도전이어서 반증되었다. 특히, 무료 히스톤 H3 꼬리 펩티드에와 뉴 클레오에 체외 효소 분석은 H3 키나제의 집합이 비대칭으로 6 인산화를 도입 있음을 보여 주었다. 또한, 친 화성 정제 기반 LC-MS / MS 분석은 진핵 세포 (7)의 여러 종류의 비대칭 H3-메틸화 뉴 클레오의 존재를 밝혔다. 따라서, 변형 된 뉴 클레오 비대칭은 신규 한 종을 구성하며도구들은 형성을 제어하고,이 비대칭 발휘할 수있는 크로스 토크 효과를 분석하기 위해 메커니즘을 밝히기 위해서 필요하다.

일반적으로, 웨스턴 블로 팅 (WB) 및 질량 분광법 (MS) 분석 히스톤 PTMS를 검출하는데 사용되어왔다. 쉬운 응용 프로그램에도 불구하고, WB는 특이 / 교차 반응의 문제를 겪고있다. 그 위에, 그것은 동시에 다중 PTM 분석 및 개질 반응 (8)의 직접적인 정량을 수행 할 수 없게된다. 한편, MS 분석은 높은 레벨 트레이닝을 필요로 복잡한 장비를 사용하지만, 다수 PTMS 9의 특이성뿐만 아니라, 동시에 매핑 및 정량화를 제공한다.   그러나, 두 방법은 중단되고 뉴 클레오 솜 복합체는 히스톤 및 / 또는 히스톤 유래 펩타이드의 혼합물을 야기하는, 분석 전에 분해된다. 이 조작은 독립적으로 구별 할 수있는 능력을 제거두 자매 히스톤 각각 발생 뉴 클레오 솜 히스톤의 복사 특정 변형 상태를보고 수정 반응.

PTM 반응을 매핑하는 다른 방법으로 진화 핵 자기 공명 (NMR) 분광법. NMR은 11 무중단되고 따라서 재구성 된 혼합물에 실시간 방식 PTM 이벤트의 모니터링을 허용하고 심지어 손상 세포 십인치 2D에 기초하여 고속 데이터 수집 루틴뿐만 아니라 고해상도 매핑 개발은 동위 원소 - 표지 (15 N 및 / 또는 13 C) 샘플 이종 핵 상관 방법 (12)은 이러한 PTMS 다른 유형의 동시 매핑을 허용 세린 / 트레오닌 / 티로신 인산화, 리신 아세틸 / 메틸화 및 메틸화 아르기닌 13. 조사 아래 PTM에 따라 15 N- 또는 13 C-라벨 홍보otocols는 변형 리포터로서 역할 단백질 관능기를 표시하기 위해 사용될 수있다. 따라서, PTM 매핑은 화학 환경에서 변화를 '검출'해당 관능기의 특성 화학 이동 변위에 따라 수행 될 수있다. 대부분의 경우, NH 및 CH 화학 그룹 모두는 관심의 PTM의 진화를보고하기 위해 사용될 수있다.

현재의 프로토콜은 차등 동위 원소 표지 자매 히스톤를 포함하는 뉴 클레오의 생성을 설명합니다. 이것은 NMR 스펙트럼의 유연성 선택된 재구성 히스톤 복합체 정화용 다른 단백질 친 화성 태그를 이용하여 모두 1 H- 15 N 1 H- 13 C 상관 스펙트럼을 사용 PTMS 매핑하는 조합. 특히, 프로토콜은 뉴 클레오 재구성에 대한 특정 히스톤의 두 개의 다른 풀을 이용한다. 이 풀은 차등 동위 원소 표지 (하나입니다 13 C와 다른)이 있으며, 이들은 각각 폴리 히스티딘 및 스트렙 친 화성 태그에 융합된다. 니켈 NTA와 스트렙 타비 딘 기반의 크로마토 그래피 탠덤 선호도 정화 방식은 처음 보이트 등으로 사용된다. 7 대칭 대응 (도 1a)에서 비대칭 종을 정화하는데 사용된다. 비대칭 히스톤 octamers는 표준 소금 투석 방법 (14)를 사용하여, 상응하는 뉴 클레오 솜 단지 (그림 1B)를 재구성하기 위해 연속적으로 사용된다. 또한, 변성 전 동일한 절차를 통해 히스톤 풀을 구비함으로써, PTM이 생성 뉴 클레오에 비대칭 적으로 혼입 될 수있다. 히스톤 - 수정 효소 및 수정 이벤트의 후속 NMR-매핑이 기판의 반응은 (모두 시스 (premodified 히스톤 복사)과의 트랜스 unmodifi를 크로스 토크 메커니즘의 특성을 가능하게에드 히스톤 복사) (그림 1C).

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Protocol

뉴 클레오의 1에서 재구성 된 유의은 동위 원소 표지 (비대칭 수정)와 자매 히스톤

참고 : 현재의 프로토콜은 차등 동위 원소 표지 히스톤 H3와 뉴 클레오의 재구성에 대해 설명합니다. 이를 위해, 히스톤 H3의 두 개의 풀을 사용 하였다; 하나는 15 N은 표지이고 N 말단에서 6xHis 태그를 포함하고, 제 13 C가 표지이고 N 말단에 융합 연쇄상 펩티드 (WSHPQFEK)를 함유 하였다. 두 태그는 담배 식각 바이러스 (TEV) 단백질 분해 효소 인식 부위와 네이티브 H3 서열로부터 분리 하였다. 추가의 비대칭 변형 된 뉴 클레오 솜을 제조하기 위해, 두 개의 풀 H3 중 하나는 premodified 형태에 포함된다. 히스톤은 풀 Premodification / 반응 보조 인자의 각 유형에 대한 필요의 존재 하에서 각각의 히스톤 개질제 효소 PTM 도너 1 관심의 동위 원소 표지 된 히스톤의 반응에 의해 수행 될 수있다6. 각 PTM의 효율적인 배치는 NMR 분광법이나 질량 분석법에 의해 평가 될 수있다. 여기에 사용 된 히스톤 / DNA의 양 (260 nm에서 DNA 농도로 측정) 10 μM의 대략적인 농도 .This 최종 수율이 상대적으로 짧은 획득 시간과 좋은 품질의 NMR 스펙트럼을 기록하기에 충분와 뉴 클레오 준비를 얻기 거친 권장 사항입니다.

  1. 차동 동위 원소 표지 (수정 및 비대칭) 히스톤 H3와 히스톤 옥타의 재구성
    : 재조합 히스톤 단백질을 BL21 (DE3) pLysS를 세포 14 mg의 양으로 제조 될 수있다. 동위 원소 표지 된 히스톤을 얻기 위해, 동일한 발현 / 정제 프로토콜은 15 N- 또는 (13), 세균의 증식을 위해 15 NH 4 CL 및 / 또는 질소와 탄소 공급원으로서 13 C 포도당을 함유하는 최소 배지를 사용 제외 이어진다 C-라벨 respectively. 정제 된 히스톤 광범위 5 MM의 β-머 캅토 에탄올 투석하고, 사용하기 전에 동결 건조 저장됩니다.
    1. 전개 완충액 1 ㎖에서 각각의 히스톤 ~ 5 ㎎을 함유하는 동결 건조 히스톤 분취 디졸브 (7 M 염산 구 아니 디늄, 20 mM 트리스 (pH 7.5), 10 mM의 DTT). 히스톤 H3의 두 가지 유형을 포함합니다. 피펫으로 혼합 소용돌이하지 않습니다. 완전한 전개 할 수 있도록 30 분 동안 얼음에 튜브를 유지합니다.
    2. 버퍼를 전개하고 ExPASy 포털의 ProtParam 도구 계산 흡광 계수를 이용 대해 280 nm에서 흡광도를 측정하여 각 히스톤의 실제 농도를 결정한다. (15)
    3. 50 % 두 히스톤 H3 풀의 각을 포함 염두에두고, 몰 비율에 핵심 히스톤을 섞는다. 덜 농축 히스톤의 전체 내용을 사용하여 시작하고 이에 따라 다른 사람을 모두 추가 할 수 있습니다.
    4. 약 1 mg의 최종 단백질 농도를 조정 / mL의 버퍼를 전개하여.
    5. TransfeR 6 kDa의-차단 투석막의 혼합물 및 냉장 폴딩 버퍼 4 ℃에서 (10 mM 트리스 산도 7.5, 2 M의 NaCl, 1 mM의 EDTA, 2 mM의 DTT)의 1 ~ 2 L에 대해 투석. 투석 3 시간의 최소 진행 한 후 적어도 한 번 버퍼를 변경합니다. 최종 투석 O / N에서 4 °의 C를 수행합니다.
    6. 투석 자료를 수집하고 최대 속도 4 ° C에서 5 분 동안 미세 원심에서 원심 분리하여 어떤 침전물을 제거 (일반적으로 석출이 관찰 될 수 없습니다). 280 nm에서 흡광도를 측정하여 옥타 농도를 결정합니다. 계산에 두 번 각각의 값에 염두에두고, 히스톤의 추가 흡광 계수를 사용합니다.
    7. 10 kDa의 컷오프 원심 필터 장치를 이용하여 1 ~ 2 mL의 최종 부피로 농축시켰다. 옥타 농도 추정 손실을 계산. 이 시점에서 50 사이 옥타 농도 - 100 μM을 수득한다.
    8. (재료의 표에 명시된) 겔 여과 컬럼을 연결합니다FPLC 시스템 및 0.22 μm의 필터 처리는 1 mL / 분의 유속 및 0.5 MPa의 압력 한계 버퍼 폴딩 탈기 2 컬럼 부피 (CV)와 평형.
      : 겔 여과 실행이 추운 방에서 또는 감기 캐비닛에서 수행해야합니다.
    9. 1 mL / 분의 유속을 사용하여 농축 된 물질을 주입 한 수집 1.0 - 1.5 ㎖의 분획을.
    10. 크로마토 그래피 프로필을 따라 ~ 65 히스톤 옥타 머의 용출을 준수 - 68 mL로.
      : 용출 피크의 작은 어깨 ~ 80 mL로에서 피크는 각각 자유-H3 H4 테트라 머 및 H2A-H2B 이량 체의 존재를 나타낸다.
    11. 18 % SDS-PAGE 겔에 수집 된 각 부분의 20 μL를 실행합니다.
      : 높은 염 농도를 감소시키고, 따라서, 왜곡을 피하기 위해 겔을 적재하기 전에, 물과 적어도 2 배만큼 샘플을 희석한다. 같은 버퍼를 리 폴딩의 샘플 이후의 SDS-PAGE 분석에 적용됩니다.
    12. 수영장 관련 FRA스테인드 젤의 4 히스톤의 평등 한 분배에 의해 판단한다 (단계 1.1.7) 이전과 농도를 결정 순수한 octamers를 포함 ctions.
    13. FPLC 시스템에 1 mL의 니켈 NTA 컬럼 (자재 테이블) 연결 0.22 10 CV로 평형 μm의 여과하고, 1 ㎖ / 분의 유속으로 완충액 폴딩 탈기.
      : 니켈 NTA 크로마토 그래피가 추운 방에서 또는 감기 캐비닛에서 수행해야합니다.
    14. 1 mL / 분의 유속을 사용하여 니켈 NTA 그래피 옥타 합격.
    15. 흐름을 통해 수집하고 SDS-PAGE / WB 분석 (20 μL 4 μL, 각각을) 샘플을 유지합니다. 이어서, 버퍼 또는 기준 신호가 도달 할 때까지 10 CV 폴딩과 열을 씻는다.
    16. 1 mL / 분의 유속을 사용하여 250 mM의 이미 다졸을 함유하는 완충액 폴딩 10 CV로 용출. (20 μL 4 μL, 각각)을 SDS-PAGE / WB 분석을위한 샘플을 보관하십시오.
    17. 교류의 1 mL의 친 화성 컬럼을 평형배치 / 중력 흐름 설정을 사용하여 250 mM의 이미 다졸을 포함하는 10 CV 폴딩 버퍼 ommercial 스트렙 타비 딘 (재료 표).
      참고 :이 크로마토 그래피 단계는 추운 방에서 수행되어야한다.
    18. 상업 스트렙 타비 딘 친 화성 컬럼을 통해 니켈 NTA 용출을 전달합니다.
    19. 을 통해 흐름을 수집하고 SDS-PAGE / WB 분석 (20 μL 4 μL, 각각을) 샘플을 유지합니다. 그 후, 버퍼를 리 폴딩의 10 CV 씻어.
    20. 2.5 밀리미터 desthiobiotin을 함유하는 리 폴딩 완충액 10 CV로 용출. (각각 20 및 4 μL) SDS-PAGE / WB 분석을위한 샘플을 보관하십시오.
    21. , 옥타 농도를 측정 10 배 이하 TEV 단백질 분해 효소를 추가하고 반응이 표준 플라스틱 원심 분리기 튜브에 4 ° C에서 하룻밤을 진행 할 수 있습니다.
      : TEV의 필요량이 완료 소화 (친 화성 태그 제거)을 얻었다는 (구성) 상기 활동에 따라 원점 (갓 재조합 TEV는 더활성 상태에서 장기간 보관 한 비교 - 80 ° C). (단백질 농도로 추정)에 옥타에 비해 초기에 추가 10 배 이하 TEV를 시도하고 그에 따라 조정.
    22. 이전 혼합물의 20 μL를 실행하고 18 % SDS-PAGE 겔에 TEV 첨가 한 후 효율적인 소화를 확인합니다. 소화가 완료되지 않으면, 더 TEV 단백질 분해 효소를 추가하여 다른 3-4 시간 동안 인큐베이션을 계속한다.
    23. TEV 단백질 분해 효소를 제거하고, 버퍼 조성물을 조정하는 50 kDa의-컷오프 투석막을 이용하여 리 폴딩 완충액에 대하여 투석 샘플.
    24. 1.0-2.0 mL의 부피로 (도 사용될 수 단계 1.1.7에서 동일한 필터 부) 10 kDa의 컷오프 원심 필터 장치를 이용하여 정제하여 비대칭 옥타을 농축시킨다. 최종 농도를 측정한다. 어느 오랜 기간 동안 -20 ° C에서 저장 (v / v)의 글리세롤을 뉴 클레오 재구성을 위해 곧 사용하거나 50 %로 조정합니다. 이전 단계에서 70 % 이상 손실을 기대하고이 시점에서, 제50 μM - 전자 옥타 농도는 20의 범위에 있어야한다.
  2. 뉴 클레오 재구성
    1. 옥타 50 % 글리세롤에 저장 한 경우, 뉴 클레오 재구성을 진행하기 전에 버퍼를 리 폴딩에 대해 4 ° C에서 하룻밤 투석.
    2. 5 M의 NaCl 스톡 용액을 사용하여 2 M의 NaCl에 소금 농도 (A 뉴 클레오 - 위치 서열을 포함) DNA를 조정합니다.
      참고 : 여러 원하는 순서의 사본 또는를 포함하는 플라스미드의 정화 후 격리 중 정제 된 DNA PCR 증폭에 의해 합성 집중 보관해야하는 ~ 50 물 μM 또는 표준 트리스 - EDTA 버퍼입니다.
    3. 소규모 실험에서 결정된 최적의 비율을 이용 량체와 DNA를 혼합한다. ~ 3.0 mL로 최종 볼륨을 조정 접힘 버퍼를 사용합니다. 항상 옥타 및 <2 M 소금 농도에서 DNA를 혼합 가능성을 방지하기 위해 마지막 옥타을 추가합니다.
      1. 초기 작은-SC를 수행최적의 뉴 클레오 수율에 이르게 DNA 비율 : 에일 reconstitutions는 옥타을 확인합니다. 50-100 μL 사이의 부피 비율 량체 : 1.0, 1.0 : 1.0, 1.1 : 1.0이 DNA를 들어, 0.9의 세 가지 반응을 조립한다. 일반적으로, 5 μM의 DNA의 농도를 사용한다.
      2. (단계 1.2.4-1.2.8) 후술하는 바와 같이 재구성을 진행하고 마지막으로, 260 nm에서의 DNA 농도를 측정하고, 6 % 네이티브-PAGE의 DNA 젤을 실행하여 용해하고 양질 재구성 뉴 클레오 좀의 양을 추정 , 에티 디움 브로마이드, 각각 (도 5a)으로 염색.
    4. 6-kDa의 컷오프 투석막에 혼합하여 전송하고 4 ℃에서 밤새 폴딩 완충액의 1 L에 대하여 투석.
    5. 0.85, 0.64, 2에서 단계적 방식으로 투석 완충액의 염 농도를 감소시키고, 각각 0.2 M의 NaCl. 적어도 3 시간 동안 각 버퍼에 샘플을 보관하십시오. 때때로 최종 전환 후 침전물이 형성된다. 이 경우 C에서계획대로 투석 ontinue 다음 단계의 끝에서의 microfuge 원심 분리하여 침전물을 제거한다.
    6. 분석 완충액 (25 mM의의 NaH 2 PO 4 / 나 2 HPO 4의 pH 6.8, 25 mM의 NaCl을, 2 mM의 DTT) 및 4 ℃에서 투석 O / N를 계속 1 L와 비커에 전송 투석막을.
    7. 샘플을 수집, 어떤이 최대 속도 4 ° C에서 5 분을위한 미세 원심에서 원심 분리하여 단계 1.2.5에 형성된 침전물 제거 ~ 300 μL의 최종 볼륨에 30 kDa의-차단 원심 필터 장치를 사용하여 집중한다.
    8. 18 % SDS-PAGE 단백질 겔 (샘플 4 μL) 몇 주 동안 4 ° C에서 6 % 네이티브-PAGE의 DNA 겔 (샘플의 0.2 μL) 및 저장 예제를 실행, 260 nm에서 DNA 농도를 측정한다. 최종 농도는 10 내지 20 μM의 범위에 있어야한다.

'두 자매 히스톤에 수정 반응 2. NMR 분석

참고 :의 할당뉴 클레오 히스톤 꼬리 2D 1 H- 15 N 상관 스펙트럼 참조 16, 17, 18에서 찾을 수있다. 또한, CH의 과제는 2D에 라이신, 세린 및 트레오닌의 그룹을 X 1 H-13 C 상관 스펙트럼은 참조 (16)에서 찾을 수 있습니다.

  1. NMR 설정 및 기준 스펙트럼 기록
    : 효소 분석은 다른 샘플 볼륨 300 K. 다른 NMR 튜브에 3 mm의 NMR 튜브에 분석 완충액에서 뉴 클레오 샘플을 140 μL를 사용하여 실시 하였다 또한 사용될 수있다. 상기 온도는 좋은 품질에게 뉴 클레오 솜 히스톤 꼬리와 좋은 효소 활성의 1 H-15 N 상관 스펙트럼을 얻는 것이 적절하다. 2D-SOFAST-HMQC 1 H-15 N과 2D-HSQC 1 H-13 C의 스펙트럼은 설치 t으로 각각 기록했다모자 비슷한 획득 시간을 부여한다. 일반적인 인수 매개 변수는 1.024 (1 H) 128 과도 1.024 128 (15 N) 복잡한 점 (32) 과도 X (1 H) × 64 (13 C)의 상관 관계 스펙트럼의 두 가지 유형의 복잡한 점. 두 차원 스펙트럼의 경우, 상기 취득 시간 ~ 30 분이었다.
    1. 분광계의 샘플 온도가 300 K를 설정합니다. 10 % 추가 D 2 O (v / v)의 샘플이 분광계 주파수 잠금 장치에 사용되는에.
    2. 분광계의 샘플을 놓고 기본 작업 (잠금, 튜닝, shimming)을 수행합니다. 또한, 최적의 펄스 길이와 일반 획득 파라미터를 결정한다.
    3. 기록 1D 및 2D 1 H-15 N 1 H-13 C 참조 스펙트럼.
    4. 프로세스 참조 스펙트럼 및 신호 변형 반응을 매핑하기 위해 사용되는 것을 보장 잘 해결 양호한 강도를 갖는다.
    5. 샘플을 복구하고 난을 전송의 microfuge 튜브 t.
  2. 효소 반응, NMR 모니터링 및 정량 분석의 설치
    1. 복사 및 인터리브 2D 1 H-15 N 1 H-13 C 스펙트럼의 시리즈를 준비. 몇 시간 동안의 총 획득 시간을 목표로하고, 제 반응으로부터 얻은 효소 비율에 기초하여 새로운 실행에서 적절하게 조정한다.
    2. 수정 반응의 각 유형에 대한 샘플에 필요한 보조 인자를 추가 (1 mM의 ATP / 2 mM의 인산화의 MgCl 2, 아세틸 1 mM의 아세틸 -CoA, 메틸화 1 mM의 SAM, 등.).
    3. , 피펫으로 혼합, 관심있는 효소를 추가 분광계 (빨리 이러한 작업을 수행)에 다시 NMR 튜브에이어서 샘플을 전송합니다.
      : 예상 효소 활성에 대한 데이터가 없으면, 기판 간 효소 (10)의 몰비를 조절 1. 첫 번째 시운전을 수행하고 위해 따라 조정실제 실행.
    4. 빠른 자동 shimming을 수행하고, 기준 스펙트럼에서 나머지 매개 변수를 사용한다.
    5. 인터리브 2D 1 H-15 N 1 H-13 C 스펙트럼의 시리즈를 시작합니다.
    6. 실시간 반응의 진행에 따라 반응이 완료 또는 원하는 수준에 도달 할 때 획득을 멈춘다.
    7. 정확히 같은 매개 변수를 사용하여 이전과 프로세스 스펙트럼.
    8. 상관 스펙트럼의 두 유형의 다른 취득 순서를 사용하여 전체의 실행을 반복한다. 첫 번째 실험에서 1 H- 15 N 상관이 시리즈에서 첫번째 인 경우, 1 H-C (13)의 관계와 지금 시작한다. 이 모두 동일한 스펙트럼에 대한 획득 시간을 갖는함으로써 플롯 동시에 척도 모두 차동 동위 원소 표지 된 히스톤의 PTM 반응과 비교하는 것이 가능하다. 또한,이 평균 플롯 오차 막대를 산출 할 수있다.
      참고 : thorougNMR 신호 분석 및 효소 반응의 후속 정량 방법론의 시간 정보는 여기에서 19 찾을 수있다.
    9. 반응의 진행을보고 할 때마다 코스 NMR 스펙트럼에서 NMR 신호를 선택하고 NMR 스펙트럼에 대한 시각화 및 분석 소프트웨어를 사용하여 상대적 신호 강도를 계산한다. 수정되지 않은뿐만 아니라 수정 된 상태를보고 신호에 대해이 작업을 수행합니다. 수정 레벨의 압축을 풉니 다.
    10. 반응 시간에 대하여 수정 레벨의 계산 된 값을 플롯.

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Representative Results

제대로 폴딩 octameric 종은 겔 여과 칼럼을 통해 재구성 혼합물의 실행 (그림 2) 후 격리됩니다. octamers의 세 가지 유형을 포함하는 octameric 재구성 풀은 탠덤 선호도 정화 방식을 받는다. 샘플은 모든 단계에서 수집 WB SDS-PAGE에 의해 후속 분석된다. 비대칭 종의 분리가 발생하는 프로토콜의 올바른 실행의 확인은 다른 샘플의 두개의 친 화성 태그 (히스와 Strep-)의 존재 (도 3)에 따라 달성된다. 그 후, 친 화성 태그는 TEV 프로테아제 소화 (그림 4) 후 제거됩니다. 친 화성 태그의 배치 비대칭 octamers 비대칭 뉴 클레오을 재구성하는 데 사용됩니다. 초기에, 소정의 테스트 스케일 재구성은 DNA의 최적 몰비를 결정하기 위해 사용된다 :이 높은 결과 옥타단 분산 복합체의 형성을 얻었다. 이어서, 최적의 혼합 비율은 대규모에서 뉴 클레오 솜을 재구성하는데 사용된다. 뉴 클레오 reconstitutions 적절한 조립 및 각각 차등 동위 원소 표지 자매 H3의 히스톤의 존재 (그림 5)에 대한 단백질 / DNA 젤 및 NMR 분광법으로 분석된다. 적용 예는도 6에 도시되어있다. 특히, 차분 동위 원소 표지 된 뉴 클레오 및 H3S10에 비대칭 적 인산화는 Gcn5 아세틸와 반응하고, 두 H3 복사본에 H3K14 아세틸는 NMR 분광법에 의해 실시간으로 이어진다. 분석은 H3S10 인산화는 트랜스에 비해 시스에 Gcn5에 의해 H3K14 아세틸을 자극 것을 알 수있다.

그림 1
도 1 : 된 유의 동위 원소 L의 제조 순서도abeled 뉴 클레오 (비대칭 수정). 차동 동위 원소 표지 (비대칭 수정) 히스톤 octamers의 (A)에서 재구성 및 탠덤 선호도 정화. (B) 정제 비대칭 octamers 및 DNA의 뉴 클레오 솜 위치 결정 시퀀스를 조합하여 뉴 클레오 재구성. 의 (C) NMR 모니터링 시스 및 트랜스의 히스톤 개질제 효소 비대칭 변형 및 차등 동위 원소 표지 된 뉴 클레오 혼합 한 후, 변형 누화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 히스톤 Octamers의에서 재구성. 접힘 히스톤 혼합물의 겔 여과 용출 프로파일. ~ 70 mL의에서 주요 피크는 히스톤 octamers에 해당합니다. 14 - 옥타 피크에 해당하는 용출 분획의 20 % 구배 SDS-PAGE 겔 (쿠마 블루 염색는) 올바른 히스톤 화학 양론을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 비대칭 히스톤 Octamers의 정화. 탠덤 선호도 정화 방식의 여러 단계에서 샘플의 히스와 Strep- 친 화성 태그에 대한 14~20% 그라데이션 SDS-PAGE 겔 (쿠마 염색) 및 WB. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

"그림 그림 4 : 선호도 태그의 제거. 18 % SDS-PAGE 겔 전과 TEV 프로테아제와 혼합 한 후, 정제 된 비대칭 히스톤 octamers의 (쿠마시 염색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : 된 유의 동위 원소 표지 된 뉴 클레오의 생화학 및 NMR 특성. DNA의 다른 몰비를 사용하여 소정의 테스트 규모의 뉴 클레오 재구성의 (A) 6 % 네이티브-PAGE의 DNA 젤 (에티 디움 브로마이드 염색) : (왼쪽) 옥타. 최적화 된 DNA를 사용하여 대규모 뉴 클레오 재구성의 6 % 네이티브-PAGE 겔에 DNA (에티 디움 브로마이드 염색) 옥타 몰비 (오른쪽). 재구성 된 뉴 클레오의 (B) 18 % SDS-PAGE 단백질 겔 (쿠마 염색)는 4 대 핵심 히스톤의 정확한 화학 양론을 보여줍니다. (C) 차동 동위 원소 표지 된 뉴 클레오의 15 N 표지 H3 사본의 1 H-15 N SOFAST-HMQC 스펙트럼 (만 H3는 꼬리 잔류 물은 볼 수 있습니다 - 단백질 코어 인해 느린 텀블링 속도에 보이지 않는). (D) 차동 동위 원소 표지 된 뉴 클레오의 13 C 표지 H3 사본의 1 H-13 C HSQC 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6에서의 시스 트랜스에서 NMR 모니터링 Gcn5 아세틸 트랜스퍼 라제의 H3K14 아세틸 활동에 H3S10의 비대칭 인산화에 의해 부과 g> 수정 크로스 토크. (A)의 도식 표현 차동 동위 원소 표지 및 비대칭 적 인산화 H3S10에 뉴 클레오 시스와 트랜스에, Gcn5 아세틸 트랜스퍼 라제 및 H3K14 아세틸 매핑과 반응. (B) 1 H-15 N SOFAST-HMQC 및 전 Gcn5와 반응 후 비대칭 뉴 클레오의 1 H-13 C HSQC 스펙트럼 (선택 영역). (C) 비대칭 H3S10 인산화 뉴 클레오에 Gcn5에 의해 H3K14 아세틸의 시간 해결 NMR 모니터링. 두 개의 독립적 인 실험에서 평균과 편차 (오차 막대)가 표시됩니다. 허가 (16) 재현. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림.

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Discussion

뉴 클레오 재구성 들어, 현재 프로토콜은 601 Widom 뉴 클레오 위치 결정 시퀀스 (20)를 포함하는 165 bp의 DNA 오랜 서식을 이용하지만, 유사한 성능 DNA 템플릿의 다양한 길이를 사용하는 것으로 예상된다. 프로토콜은 히스톤 H3의 비대칭 형태를 이용하여 설계하고 사용 하였다. 동일한 원리, 방법은 다른 코어 히스톤에도 적용 할 수 있고 추가로 다른 동위 원소 라벨 두 가지 핵심 히스톤 운반 복합체를 재구성하는데 사용될 수있다. 프로토콜은 초기에 약간 히스톤 서브 복합체를 재구성하는 변경된 직접 octamers를 히스톤되지 않을 수있다. 본 변형 예에 따라, 비대칭-H3 H4 테트라 동일한 직렬 정화 방식을 사용하여 재구성 될 수있다. 후자의 뉴 클레오 솜 (16)을 조립하는 별도 재구성 H2A-H2B 다이머와 DNA를 혼합한다. 최종 수율 및 수정 protoc의 전체 성능올 원래 비슷합니다.

이 프로토콜은 효율적으로 끝 고순도의 비대칭 단지에서 산출하는 것이 관련 종을 결합하여 할 수있는 두 친 화성 컬럼의 능력에 크게 의존한다. 최종 정제 된 복잡한 참으로 만 비대칭 것을 직접 구체적인 증거를 제공하는 번거 롭다. 그러나, 관련 항체와 모든 정제 단계에서 샘플 WB 분석은 직렬 정화 계획의 성공 (그림 3)에 대한 신뢰할 수있는 표시를 제공합니다. 동일한 결과, 따라서 추가의 확신은 NMR 수단 (16)에 의해 친 화성 태그의 존재에 대해 동일한 샘플을 분석하여 얻었다. WB 분석 대칭 것 비대칭 종의 오염을 나타내는 경우, 여전히 작은 변화는 결과를 향상시킬 수있는 첫 번째 정제 단계 (니켈 NTA)에서 채택 될 수있다. 특히, 대신 등용 매 용리, 이미 다졸 gradien t 용출 (10-250 mM)을 채용 할 수 있고 그 후, 단지 고도로 비대칭 종에서 농축 된 제 1 용출 분획을 풀링하고, 친 화성 컬럼을 통해 실행. 이는 연쇄상 친화력 태그의 존재에 대한 용출 분획 WB 분석에 의해 평가 될 수있다.

관심 PTM 관련 동위 원소 라벨의 선택은 대부분의 경우, NMR은 모두 1 H- 15 N 1 H- 13 Ccorrelation 스펙트럼을 사용하여 동일한 PTM 매핑 할 수 있기 때문에 다소 유연하다. 그러나, 특정 아미노산, 라이신 같은 측쇄 H- 13 C 공진에 대한 화학 이동 분산액은 다소 제한된다. 리신 - 개질 효소 표적 부위를 알 수있는 경우 또한, 리신 PTMS의 부위 특이 판독은 간단하지 않다. 이러한 경우, 다른 방법은 반합성 히스톤 생산 결합 부위 선택적 13 C - 라벨링을 사용"> (21) 또는 선택적으로 여진을 통해 변형 상태의 특정 검출 가능 신설 NMR 펄스 시퀀스의 사용은 22 루틴. NMR 스펙트럼은 다소 낮은 감도를 부여한다. 이와 관련하여, 뉴 클레오 (μM 범위)의 상대적으로 높은 양의은을 수행하는 데 필요한 효소 반응. 이것은 높은 처리량 설정에있어서의 발전을 방지한다.

동시에, 새로운 화학적 방법이 정의 PTMS 23 들고, 고 수율로, 화학적으로 순수한 비대칭 변형 된 뉴 클레오 솜의 합성에 도입되었다. 이 방법은 크로스 토크 PTM 메카니즘을 연구하기 위해, fluorography와 함께 사용되어왔다. 인해 PTMS 검출에 형광 촬영 방법의 저해상도 능력에 결론 아니라 대칭 및 비대칭 PTMS의 상이한 조합을 운반 뉴 클레오 세트 전반적인 효소 활성을 비교함으로써 간접적으로 도출 된각 자매 히스톤의 해당 사이트에서 PTM의 반응을 직접 관찰함으로써보다. 그러나, 동위 원소 표지 히스톤 혼입 PTM 및 판독을위한 NMR 분광기의 사용은 상술 된 방법을 비대칭으로 변형 뉴 클레오 고해상도 PTM 분석을위한 부가적인 수단을 구성 할 수있다.

미래의 비대칭 변형 된 뉴 클레오 새로운 유형의 식별과 관련하여, 현재의 방법은 뉴 클레오 시스 및 트랜스 PTM 기판상의 누화 반응에서 분석 고해상도 도구를 구성하는 것이다. 특히, 중요도가 높은 비대칭 모두 전사적 활성과 억압 PTMS 포함될 가의 뉴 클레오 솜 (24)을 야기 누화 메커니즘의 복호이다.

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Acknowledgements

연구 보조금을 통해 사업 자금에 대한 실험과 독일 연구 협회 (DFG)를 수행하기 위해 습식 실험실 공간 및 인프라를 제공하는 저자 덕분에 박사 필립 Selenko (FMP-베를린) (LI 2402 / 2-1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidinium HCl Applichem A14199 Use high quality Gu-HCl
Tris  Roth 4855.2
DTT Applichem A1101
NaCl VWR chemicals 27810.364
EDTA Roth 8043.2
Na2H2PO4 Applichem A1046
NaH2PO4 Applichem A3902
Imidazole Applichem A1073
d-Desthiobiotin Sigma D1411
Ni-NTA Superflow Qiagen 1034557
Strep-Tactin Superflow IBA 2-1207-001
His-probe antibody Santa Cruz sc-8036
Strep-tactin conjugated HRP IBA 2-1502-001
Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28-9893-35
6 - 8 kDa dialysis membrane Spectrumlabs spectra/por 1, 132650
50 kDa dialysis membrane Spectrumlabs spectra/por 7, 132129
10 kDa centrigugal filter unit Merck Millipore UFC901024
30 kDa centrigugal filter unit Merck Millipore UFC903024
Solution-state NMR spectrometer  at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe
Buffer name Component
Unfolding Buffer 7 M Guanidinium HCl
20 mM Tris, pH 7.5
10 mM DTT
Refolding Buffer 10 mM Tris, pH 7.5
2 M NaCl
1 mM EDTA
2 mM DTT
Assay Buffer 25 mM Na2H2PO4, pH 6.8
25 mM NaCl
2 mM DTT

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References

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