विभिन्न आइसोटोप लेबल बहन histones साथ nucleosomes का पुनर्गठन

Biochemistry

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Summary

इस प्रोटोकॉल विभिन्न आइसोटोप लेबल बहन histones युक्त nucleosomes के पुनर्गठन का वर्णन है। इसी समय, asymmetrically के बाद translationally संशोधित nucleosomes एक premodified हिस्टोन प्रतिलिपि उपयोग करने के बाद उत्पन्न किया जा सकता है। इन तैयारियों आसानी से दोनों बहन histones पर संशोधन crosstalk तंत्र का अध्ययन करने के लिए, एक साथ उच्च संकल्प एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके किया जा सकता है।

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Liokatis, S. Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones. J. Vis. Exp. (121), e55349, doi:10.3791/55349 (2017).

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Abstract

Asymmetrically संशोधित nucleosomes एक हिस्टोन की दो प्रतियां (बहन histones) बाद translational संशोधनों (PTMs) के अलग सेट के साथ सजाया होते हैं। वे नव स्थापना और कार्यात्मक प्रभाव की अज्ञात साधन के साथ प्रजातियों की पहचान कर रहे हैं। वर्तमान विश्लेषणात्मक तरीकों nucleosomal बहन histones पर PTMs की प्रति विशेष घटना का पता लगाने के लिए अपर्याप्त हैं। इस प्रोटोकॉल विभिन्न आइसोटोप लेबल बहन histones युक्त nucleosomes की इन विट्रो पुनर्गठन के लिए एक जैव रासायनिक विधि प्रस्तुत करता है। उत्पन्न परिसर में भी विषम संशोधित किया जा सकता, हिस्टोन subcomplexes की refolding के दौरान एक premodified हिस्टोन पूल सहित के बाद। इन विषम nucleosome तैयारियों आसानी से हो सकता है संशोधन पार बात परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग asymmetrically पूर्व शामिल PTM द्वारा लगाए गए तंत्र का अध्ययन करने हिस्टोन संशोधित एंजाइमों के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की। विशेष रूप से, में संशोधन प्रतिक्रियाओंवास्तविक समय एनएमआर सहसंबंध के प्रयोगों के विभिन्न प्रकार, संबंधित आइसोटोप प्रकार अनुरूप प्रदर्शन से दो बहन histones पर स्वतंत्र रूप से मैप किया जा सकता है। इस पद्धति crosstalk तंत्र है कि nucleosomal परिसरों पर गठन और विषम PTM पैटर्न के प्रचार-प्रसार के लिए योगदान अध्ययन करने के लिए साधन प्रदान करता है।

Introduction

यूकेरियोटिक डीएनए कसकर क्रोमेटिन में सेल नाभिक के भीतर पैक किया जाता है। क्रोमेटिन के मौलिक निर्माण खंड nucleosome कोर कण जिसमें एक octameric दो प्रतियां चार कोर histones के प्रत्येक (H3, H4, H2A, H2B) से बना परिसर के आसपास लिपटे डीएनए के ~ 147 बीपी है। हिस्टोन प्रोटीन बाद translational संशोधनों (PTMs) की अधिकता के बंदरगाह। ये सहसंयोजक प्रतिस्थापन, दोनों सीधे प्रणाली के भौतिक रसायन शास्त्र को प्रभावित करने से और परोक्ष रूप से क्रोमेटिन-remodeling गतिविधियों 1, 2, 3 की भर्ती द्वारा क्रोमेटिन संरचना में परिवर्तन के लिए प्रेरित। उन तरह से, हिस्टोन PTMs क्रोमेटिन पहुंच को नियंत्रित करने और, इसलिए, सभी डीएनए आधारित सेलुलर कार्यों 4 विनियमित।

PTMs मुख्य रूप से nucleosome-कोर शामिल histo के असंरचित एन टर्मिनल खंडों (पूंछ) पर हिस्टोन संशोधित एंजाइम सिस्टम द्वारा स्थापित कर रहे हैंएनईएस। हिस्टोन पूंछ के अपेक्षाकृत छोटे दृश्य पर कई संशोधन साइटों के कारण, PTMs उत्प्रेरण या बाद में संशोधन प्रतिक्रियाओं, एक प्रभाव संशोधन पार बात 5 के रूप में जाना अवरुद्ध करके एक दूसरे को प्रभावित करते हैं। nucleosome के समग्र सममित वास्तुकला की वजह से, संशोधन प्रतिक्रियाओं और crosstalk तंत्र प्रत्येक nucleosomal हिस्टोन (बहन histones) की दो प्रतियां पर इसी तरह घटित करने के लिए लगा रहे थे। इस अवधारणा को हाल ही में चुनौती दी गई थी और बाद में गलत साबित। विशेष रूप से, मुक्त हिस्टोन H3 पूंछ पेप्टाइड्स पर और nucleosomes पर इन विट्रो enzymatic assays प्रदर्शन किया है कि H3 kinases का एक सेट एक असममित ढंग 6 में पेश फोस्फोराइलेशन। इसके अतिरिक्त, आत्मीयता शुद्धि आधारित नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण कोशिकाओं 7 के कई प्रकार में asymmetrically H3-methylated nucleosomes के अस्तित्व का पता चला। इस प्रकार, asymmetrically संशोधित nucleosomes उपन्यास प्रजातियों का गठन, औरउपकरण तंत्र है कि उनके निर्माण को नियंत्रित करने और crosstalk प्रभाव है कि इस विषमता लागू हो सकता है विश्लेषण करने के लिए उजागर करने के लिए आवश्यक हैं।

आमतौर पर, पश्चिमी सोख्ता (पश्चिम बंगाल) और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषण हिस्टोन PTMs पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसकी आसान आवेदन के बावजूद पश्चिम बंगाल विशिष्टता / पार जेट समस्याओं से ग्रस्त है। उस के शीर्ष पर, यह एक साथ बहु-PTM विश्लेषण और संशोधन प्रतिक्रियाओं 8 के प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव प्रदर्शन करने में असमर्थ है। दूसरी ओर, एमएस विश्लेषण परिष्कृत उपकरण है कि उच्च स्तर के प्रशिक्षण की आवश्यकता को रोजगार, लेकिन उच्च विशिष्टता के साथ ही एक साथ मानचित्रण और कई PTMs 9 की मात्रा का ठहराव प्रदान करता है।   हालांकि, दोनों तरीकों विघटनकारी हैं और nucleosomal परिसरों विश्लेषण से पहले अलग कर रहे हैं, histones और / या हिस्टोन व्युत्पन्न पेप्टाइड्स का एक मिश्रण को जन्म दे रही है। इस हेरफेर स्वतंत्र भेद करने की क्षमता को हटासंशोधन प्रतिक्रियाओं है कि दो बहन histones में से प्रत्येक पर पाए जाते हैं और nucleosomal histones की प्रति विशेष संशोधन स्थिति रिपोर्ट करने के लिए।

परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी एक वैकल्पिक तरीका PTM प्रतिक्रियाओं नक्शा करने के लिए के रूप में विकसित हुआ। एनएमआर nondisruptive 11 है और इस तरह का पुनर्गठन मिश्रण में एक वास्तविक समय तरीके से PTM घटनाओं की निगरानी की अनुमति देता है, और भी बरकरार कोशिकाओं 10 में। 2 डी के आधार पर तेजी से डाटा अधिग्रहण के लिए दिनचर्या के साथ ही उच्च संकल्प मानचित्रण के लिए विकास असमलैंगिक परमाणु आइसोटोप लेबल (15 एन और / या 13 सी) के नमूनों के सहसंबंध तरीकों 12 PTMs के विभिन्न प्रकार के एक साथ मानचित्रण की अनुमति दी है, ऐसे के रूप में सेरीन / threonine / tyrosine फोस्फोराइलेशन, लाइसिन एसिटिलीकरण / मेथिलिकरण, और arginine मेथिलिकरण 13। जांच के तहत PTM पर निर्भर करता है, 15 या 13 सी एन-लेबलिंग जनसंपर्कotocols प्रोटीन कार्यात्मक समूह है कि एक संशोधन पत्रकार के रूप में कार्य करता है चिह्नित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। नतीजतन, PTM मानचित्रण इसी कार्यात्मक समूह 'संवेदन' रासायनिक पर्यावरण पर परिवर्तन की विशेषता रासायनिक पारी विस्थापन का पालन करके किया जा सकता है। ज्यादातर मामलों में, दोनों राष्ट्रीय राजमार्ग और सीएच रासायनिक समूहों के हित के PTM के विकास रिपोर्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल विभिन्न आइसोटोप लेबल बहन histones युक्त nucleosomes की पीढ़ी का वर्णन है। यह एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लचीलेपन का चयन किया पुनर्गठन हिस्टोन परिसरों की शुद्धि के लिए अलग अलग प्रोटीन आत्मीयता के टैग के उपयोग के साथ दोनों 1 एच 15 एन 1 और एच 13 सी के सहसंबंध स्पेक्ट्रा का उपयोग कर PTMs नक्शा करने के लिए को जोड़ती है। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल nucleosome पुनर्गठन के लिए एक विशेष हिस्टोन की दो अलग अलग ताल कार्यरत हैं। इन पूल के विभिन्न आइसोटोप लेबल (एक साथ हैं 13 सी के साथ अन्य), और वे एक polyhistidine और एक streptavidin आत्मीयता के टैग के लिए क्रमश: जुड़े हुए हैं। नी NTA और streptavidin आधारित क्रोमैटोग्राफी के साथ मिलकर एक आत्मीयता शुद्धि योजना शुरू वोइट एट अल द्वारा इस्तेमाल किया। 7 सममित समकक्षों (चित्रा 1 ए) से विषम प्रजातियों को शुद्ध करने के लिए कार्यरत है। असममित हिस्टोन octamers, बराबर nucleosomal परिसरों (चित्रा 1 बी) को पुनर्गठित करने के लिए बाद में इस्तेमाल मानक नमक डायलिसिस विधि 14 का उपयोग कर रहे हैं। इसके अतिरिक्त, एक ही प्रक्रिया के माध्यम से और हिस्टोन पूल में से एक होने से पूर्व संशोधित, एक PTM asymmetrically जिसके परिणामस्वरूप nucleosomes पर शामिल किया जा सकता है। हिस्टोन संशोधित एंजाइमों और संशोधन की घटनाओं के बाद एनएमआर मानचित्रण के साथ इन substrates की प्रतिक्रिया crosstalk तंत्र के लक्षण वर्णन दोनों में सीआईएस (premodified हिस्टोन प्रतिलिपि) और में ट्रांस सक्षम (unmodifiएड हिस्टोन प्रतिलिपि) (चित्रा 1 सी)।

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Protocol

1. nucleosomes के पुनर्गठन के साथ विभिन्न आइसोटोप लेबल (और asymmetrically संशोधित) बहन histones

नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल विभिन्न आइसोटोप लेबल हिस्टोन H3 साथ nucleosomes के पुनर्गठन का वर्णन है। यह अंत करने के लिए, हिस्टोन H3 के दो पूल में इस्तेमाल किया गया; एक 15 एन लेबल था और एन टर्मिनस पर एक 6xHis टैग रखी जाती है और दूसरी 13 सी चिह्नित किया गया और strep पेप्टाइड (WSHPQFEK) पर एन टर्मिनस जुड़े हुए निहित। दोनों टैग एक तंबाकू खोदना वायरस (TEV) प्रोटीज मान्यता साइट के साथ देशी H3 अनुक्रम से अलग हो गए थे। अतिरिक्त asymmetrically संशोधित nucleosomes तैयार करने के लिए, दो H3 पूल में से एक एक premodified रूप में शामिल किया गया है। एक हिस्टोन पूल के Premodification / प्रतिक्रिया सहकारकों के प्रत्येक प्रकार के लिए आवश्यक की उपस्थिति में संबंधित हिस्टोन संशोधित एंजाइम के साथ ब्याज की आइसोटोप लेबल हिस्टोन प्रतिक्रिया PTM दाताओं 1 से किया जा सकता है6। संबंधित PTM के कुशल प्लेसमेंट के एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी या मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। histones / डीएनए की मात्रा का यहां इस्तेमाल किसी न किसी सिफारिशें 10 माइक्रोन की एक अनुमानित एकाग्रता (260 एनएम डीएनए एकाग्रता के रूप में मापा जाता है) .इस अंतिम उपज अपेक्षाकृत कम अधिग्रहण के समय के साथ अच्छी गुणवत्ता एनएमआर स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त है के साथ एक nucleosome तैयारी प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं।

  1. विभिन्न आइसोटोप लेबल (और asymmetrically संशोधित) हिस्टोन H3 के साथ एक हिस्टोन octamer का पुनर्गठन
    नोट: संयोजक हिस्टोन प्रोटीन BL21 (DE3) plysS 14 कोशिकाओं में मिलीग्राम मात्रा में उत्पादन किया जा सकता है। आइसोटोप लेबल histones प्राप्त करने के लिए, एक ही अभिव्यक्ति / शुद्धि प्रोटोकॉल, बैक्टीरिया विकास के लिए युक्त 15 एनएच 4 सीएल और / या नाइट्रोजन और कार्बन स्रोत के रूप में 13 सी-ग्लूकोज एक न्यूनतम माध्यम का उपयोग कर के अपवाद के साथ पीछा किया जाता है 15 एन या 13 के लिए सी-लेबलिंग respectively। शुद्ध histones बड़े पैमाने पर 5 मिमी β-mercaptoethanol के खिलाफ dialyzed कर रहे हैं और उपयोग करने से पहले lyophilized संग्रहीत।
    1. , Lyophilized हिस्टोन aliquots भंग बफर खुलासा के 1 एमएल में युक्त प्रत्येक हिस्टोन के ~ 5 मिलीग्राम (7 एम guanidinium एचसीएल, 20 मिमी Tris पीएच 7.5, 10 मिमी डीटीटी)। हिस्टोन H3 के दोनों प्रकार शामिल हैं। pipetting द्वारा मिक्स और भंवर नहीं है। 30 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूबों रखें पूरा खुलासा अनुमति देने के लिए।
    2. बफर खुलासा और ExPASy पोर्टल के ProtParam उपकरण के साथ गणना की विलुप्त होने गुणांक का उपयोग कर के खिलाफ 280 एनएम पर absorbance को मापने के द्वारा प्रत्येक हिस्टोन की सटीक एकाग्रता का निर्धारण। 15
    3. equimolar अनुपात को कोर histones मिक्स ध्यान में रखते हुए 50% दो हिस्टोन H3 पूल में से प्रत्येक शामिल करने के लिए। कम केंद्रित हिस्टोन की सारी सामग्री का उपयोग करके शुरू करो और दूसरों के सभी तदनुसार जोड़ें।
    4. लगभग 1 मिलीग्राम अंतिम प्रोटीन एकाग्रता समायोजित / एमएल बफर खुलासा इस्तेमाल करते हैं।
    5. transfeआर एक 6 केडीए-कटऑफ डायलिसिस झिल्ली के लिए मिश्रण और ठंडा refolding बफर (10 मिमी Tris पीएच 7.5, 2 एम NaCl, 1 मिमी EDTA, 2 मिमी डीटीटी) 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 एल के खिलाफ dialyze। बफर में कम से कम एक बार बदलने के बाद डायलिसिस 3 घंटे की एक न्यूनतम के लिए रवाना किया है। एक अंतिम डायलिसिस हे / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन करना।
    6. dialyzed सामग्री इकट्ठा करने और किसी भी अवक्षेप 4 डिग्री सेल्सियस अधिकतम गति पर 5 मिनट के लिए एक microfuge में centrifugation द्वारा हटाने के लिए (सामान्य रूप से वर्षा की उम्मीद नहीं मनाया जाना चाहिए)। 280 एनएम पर absorbance को मापने के द्वारा octamer एकाग्रता का निर्धारण। गणना में, का उपयोग histones का जोड़ा विलुप्त होने के गुणांक, डबल प्रत्येक मूल्य को ध्यान में रखते हुए।
    7. ~ 2 एमएल के अंतिम मात्रा एक 10 केडीए-कटऑफ केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट का उपयोग करने के लिए ध्यान लगाओ। octamer एकाग्रता और अनुमान घटाने की पुनर्गणना। इस बिंदु पर, 50 के बीच एक octamer एकाग्रता - 100 सुक्ष्ममापी प्राप्त किया जाना चाहिए।
    8. एक को जेल निस्पंदन स्तंभ (सामग्री की तालिका में कहा गया है) से कनेक्टFPLC प्रणाली और 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर और 1 एमएल / मिनट की एक प्रवाह दर और 0.5 एमपीए के दबाव सीमा पर बफर refolding degassed 2 कॉलम संस्करणों (सीवी) के साथ संतुलित करना।
      ध्यान दें: जेल निस्पंदन रन ठंडे कमरे में या सर्दी कैबिनेट में प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
    9. 1 एमएल / मिनट की एक प्रवाह दर का उपयोग केंद्रित सामग्री इंजेक्षन और 1.0 इकट्ठा - 1.5 एमएल अंशों।
    10. chromatographic प्रोफ़ाइल का पालन करें और ~ 65 पर हिस्टोन octamer क्षालन निरीक्षण - 68 एमएल।
      नोट: क्षालन चोटी का एक छोटा सा कंधे और ~ 80 एमएल में एक चोटी मुक्त H3-एच 4 tetramers और H2A-H2B dimers के अस्तित्व को क्रमश: इंगित करता है।
    11. एक 18% एसडीएस पृष्ठ जेल में प्रत्येक एकत्र अंश के 20 μL चलाएँ।
      ध्यान दें: जेल पर उन्हें लोड उच्च नमक एकाग्रता को कम करने के लिए और इस तरह, विकृतियों से बचने से पहले पानी के साथ कम से कम 2 का एक पहलू से नमूने पतला। एक ही बफर refolding में नमूने के बाद एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण के लिए लागू होता है।
    12. पूल प्रासंगिक एफआरएदाग जेल पर 4 histones का समान वितरण से न्याय और (1.1.7 कदम) के रूप में पहले एकाग्रता का निर्धारण शुद्ध octamers युक्त ctions।
    13. फ़िल्टर माइक्रोन और 1 एमएल / मिनट की एक प्रवाह दर पर बफर refolding degassed एक FPLC प्रणाली के लिए एक 1 एमएल नी NTA स्तंभ (सामग्री की तालिका) कनेक्ट और 0.22 के 10 CV के साथ संतुलित करना।
      ध्यान दें: नी NTA क्रोमैटोग्राफी ठंडे कमरे में या सर्दी कैबिनेट में प्रदर्शन किया जाना चाहिए।
    14. नी NTA के माध्यम से शुद्ध octamer दर्रा 1 एमएल / मिनट की एक प्रवाह की दर का उपयोग कर।
    15. प्रवाह के माध्यम से एकत्र और एसडीएस पृष्ठ / पश्चिम बंगाल के विश्लेषण के लिए नमूने रखने (20 μL और 4 μL, क्रमशः)। बाद में, बफर या जब तक एक आधारभूत संकेत तक पहुँच जाता है refolding के 10 CV के साथ स्तंभ धो लें।
    16. 1 एमएल / मिनट की एक प्रवाह दर का उपयोग युक्त 250 मिमी imidazole बफर refolding के 10 CV के साथ Elute। एसडीएस पृष्ठ / पश्चिम बंगाल के विश्लेषण के लिए नमूने (20 μL और 4 μL, क्रमशः) रखें।
    17. एसी का 1 एमएल आत्मीयता के स्तंभ संतुलित करनाommercial streptavidin (सामग्री की तालिका) 10 सीवी refolding बफर एक बैच / गुरुत्वाकर्षण प्रवाह सेटअप का उपयोग युक्त 250 मिमी imidazole साथ।
      नोट: इस chromatographic कदम ठंडे कमरे में किया जाना चाहिए।
    18. वाणिज्यिक streptavidin आत्मीयता के स्तंभ के माध्यम से गुजरती नी NTA क्षालन।
    19. के माध्यम से प्रवाह लीजिए और एसडीएस पृष्ठ / पश्चिम बंगाल के विश्लेषण के लिए नमूने रखने (20 μL और 4 μL, क्रमशः)। बाद में, बफर refolding के 10 सीवी से धो लें।
    20. 2.5 मिमी desthiobiotin युक्त बफर refolding के 10 CV के साथ Elute। (क्रमश: 20 और 4 μL) एसडीएस पृष्ठ / पश्चिम बंगाल के विश्लेषण के लिए नमूने रखें।
    21. octamer एकाग्रता उपाय, 10 गुना कम TEV प्रोटीज जोड़ने के लिए और प्रतिक्रिया के लिए एक मानक प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आगे बढ़ना।
      नोट: TEV के लिए आवश्यक राशि पूरा पाचन (आत्मीयता के टैग को हटाने) प्राप्त करने के लिए मूल पर निर्भर करता है (निर्माण) और गतिविधि पर (ताजा बना, पुनः संयोजक TEV अधिक हैसक्रिय पर लंबी अवधि के लिए संग्रहीत एक की तुलना में - 80 डिग्री सेल्सियस)। शुरू में उनका कहना है 10 गुना कम TEV octamer (प्रोटीन सांद्रता के रूप में अनुमानित) की तुलना में प्रयास करें और तदनुसार समायोजित करें।
    22. मिश्रण से पहले के 20 μL चलाने के द्वारा, और एक 18% एसडीएस पृष्ठ जेल पर TEV इसके बाद कुशल पाचन के लिए जाँच करें। अगर पाचन पूरा नहीं हुआ है, और अधिक TEV प्रोटीज जोड़ सकते हैं और एक और 3-4 घंटे के लिए ऊष्मायन जारी है।
    23. TEV प्रोटीज को हटाने और बफर संरचना को समायोजित करने के लिए एक 50 केडीए-कटऑफ डायलिसिस झिल्ली का उपयोग कर बफर refolding के खिलाफ नमूना Dialyze।
    24. 1.0-2.0 एमएल की मात्रा के लिए एक 10 केडीए-कटऑफ केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट (कदम 1.1.7 से ही फिल्टर यूनिट का भी इस्तेमाल किया जा सकता है) का उपयोग कर शुद्ध विषम octamer ध्यान लगाओ। अंतिम एकाग्रता उपाय। या तो nucleosome पुनर्गठन के लिए जल्द ही के बाद का उपयोग करें या 50% करने के लिए समायोजित (वी / वी) ग्लिसरॉल लंबी अवधि के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए। इस बिंदु पर है और पिछले चरणों के दौरान कम से कम 70% नुकसान की उम्मीद है, वें50 माइक्रोन के - ई octamer एकाग्रता 20 की सीमा में होना चाहिए।
  2. nucleosome पुनर्गठन
    1. अगर octamer 50% ग्लिसरॉल में संग्रहीत किया गया था, nucleosome पुनर्गठन के साथ आगे बढ़ने से पहले बफर refolding के खिलाफ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर dialyze।
    2. डीएनए एक 5 एम NaCl शेयर समाधान का उपयोग करके 2 एम NaCl के लिए नमक एकाग्रता (एक nucleosome स्थिति अनुक्रम युक्त) को समायोजित करें।
      नोट: शुद्ध डीएनए एक प्लाज्मिड कि या इच्छित क्रम के कई प्रतियां शामिल की शुद्धि के बाद या तो पृथक पीसीआर प्रवर्धन द्वारा संश्लेषित केंद्रित संग्रहित किया जाना चाहिए करने के लिए ~ पानी में 50 माइक्रोन या एक मानक Tris-EDTA बफर।
    3. एक छोटे पैमाने पर परीक्षण से निर्धारित इष्टतम अनुपात का उपयोग octamer और डीएनए मिश्रण। अंतिम मात्रा 3.0 एमएल समायोजित करने के लिए ~ refolding बफर का प्रयोग करें। हमेशा octamer octamer और <2 एम नमक सांद्रता में डीएनए मिश्रण की किसी भी संभावना को रोकने के लिए पिछले जोड़ें।
      1. प्रारंभिक छोटे-सुप्रीम कोर्ट प्रदर्शन करनाडीएनए अनुपात है कि इष्टतम nucleosome पैदावार की ओर जाता है: शराब reconstitutions octamer निर्धारित करने के लिए। 50-100 μL के बीच एक मात्रा में अनुपातों octamer: 1.0, 1.0: 1.0, 1.1 और 1.0 डीएनए इस के लिए, 0.9 से तीन प्रतिक्रियाओं को इकट्ठा। आमतौर पर, 5 माइक्रोन के डीएनए की एकाग्रता का उपयोग करें।
      2. पुनर्गठन (कदम 1.2.4-1.2.8) नीचे वर्णित के रूप में साथ आगे बढ़ें और अंत में, 260 एनएम डीएनए एकाग्रता को मापने के द्वारा और एक 6% देशी पृष्ठ डीएनए जेल चलाने के द्वारा घुलनशील और अच्छी गुणवत्ता का पुनर्गठन nucleosome की राशि का अनुमान , ethidium ब्रोमाइड, क्रमशः (चित्रा 5 ए) के साथ दाग।
    4. एक 6 केडीए-कटऑफ डायलिसिस झिल्ली के लिए मिश्रण स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बफर refolding के 1 एल के खिलाफ dialyze।
    5. 2 से एक कदम वार ढंग से डायलिसिस बफर के नमक एकाग्रता में कमी, 0.85, 0.64 करने के लिए, और 0.2 एम NaCl क्रमशः। कम से कम 3 घंटे के लिए प्रत्येक बफर में नमूना रखें। कभी कभी वेग पिछले संक्रमण के बाद बनाई है। इस मामले में गडायलिसिस जारी रखें योजना के रूप में और अगले कदम के अंत में microfuge centrifugation द्वारा वेग को हटा दें।
    6. परख बफर (25 मिमी नः 2 4 पीओ / ना 2 HPO 4 पीएच 6.8, 25 मिमी NaCl, 2 मिमी डीटीटी) और 4 डिग्री सेल्सियस पर जारी रखने के लिए डायलिसिस हे / एन के 1 एल के साथ एक बीकर में स्थानांतरण डायलिसिस झिल्ली।
    7. नमूना ले लीजिए, किसी भी हटाने अधिकतम गति पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक microfuge में centrifugation द्वारा कदम 1.2.5 पर गठित वेग और ~ 300 μL के अंतिम मात्रा करने के लिए एक 30 केडीए-कटऑफ केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट का उपयोग करते हुए ध्यान केंद्रित।
    8. 260 एनएम डीएनए एकाग्रता उपाय, एक 18% एसडीएस पृष्ठ प्रोटीन जेल (नमूना के 4 μL) और एक 6% मूल निवासी पृष्ठ डीएनए कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जेल (नमूना के 0.2 μL) और दुकान नमूना चलाते हैं। अंतिम एकाग्रता 10-20 माइक्रोन की सीमा में होना चाहिए।

2. पर दो बहन histones संशोधन प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण एनएमआर

नोट: का आबंटनNucleosomal हिस्टोन पूंछ के 2 डी 1 एच 15 एन सह-संबंध स्पेक्ट्रा संदर्भों 16, 17, 18 पर पाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, सीएच का कार्य 2 डी पर lysines, serines और threonines के समूहों x 1 एच 13 सी के सहसंबंध स्पेक्ट्रा संदर्भ 16 में पाया जा सकता है।

  1. एनएमआर सेटअप और संदर्भ स्पेक्ट्रा की रिकॉर्डिंग
    नोट: एंजाइमी assays अन्य नमूना संस्करणों के साथ 300 लालकृष्ण विभिन्न एनएमआर नलियों में एक 3 मिमी एनएमआर ट्यूब में परख बफर में nucleosome नमूने के 140 μL का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया भी इस्तेमाल किया जा सकता है। ऊपर उल्लिखित तापमान अच्छी गुणवत्ता nucleosomal हिस्टोन पूंछ और अच्छा enzymatic गतिविधियों का 1 एच 15 एन सह-संबंध स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए उपयुक्त है। 2 डी-SOFAST-HMQC 1 एच 15 एन और 2 डी-HSQC 1 एच 13 सी स्पेक्ट्रा एक सेटअप टी के साथ क्रमशः दर्ज किए गएटोपी समान अधिग्रहण बार प्रदान करता है। ठेठ अधिग्रहण मानकों के साथ 1.024 (1 एच) 128 यात्रियों के साथ 1.024 x 128 (15 एन) जटिल अंक और 32 यात्रियों कर रहे हैं (1 एच) x 64 (13 सी) के सह-संबंध स्पेक्ट्रा के दो अलग अलग प्रकार के लिए जटिल अंक। दोनों 2 डी स्पेक्ट्रा के लिए, अधिग्रहण के समय ~ 30 मिनट था।
    1. 300 कश्मीर स्पेक्ट्रोमीटर में नमूना तापमान के रूप में सेट करें। 10% जोड़े डी 2 ओ (वी / वी) के लिए नमूना स्पेक्ट्रोमीटर आवृत्ति ताला के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
    2. स्पेक्ट्रोमीटर में नमूना प्लेस और बुनियादी आपरेशन (लॉकिंग, ट्यूनिंग, shimming) प्रदर्शन करते हैं। इसके अतिरिक्त, इष्टतम पल्स लंबाई और सामान्य अधिग्रहण मापदंडों का निर्धारण।
    3. रिकार्ड -1 डी और 2 डी 1 एच 15 एन 1 और एच 13 सी संदर्भ स्पेक्ट्रा।
    4. प्रक्रिया संदर्भ स्पेक्ट्रा और यह सुनिश्चित करें कि संकेतों संशोधन प्रतिक्रियाओं मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए अच्छी तरह से हल और अच्छे तीव्रता कर रहे हैं।
    5. नमूना ठीक है और मैं हस्तांतरणएक microfuge ट्यूब के लिए टी।
  2. Enzymatic प्रतिक्रिया, एनएमआर निगरानी और मात्रात्मक विश्लेषण का सेटअप
    1. कॉपी और interleaved 2 डी 1 एच 15 एन 1 और एच 13 सी स्पेक्ट्रा की एक श्रृंखला की व्यवस्था। कई घंटे की कुल अधिग्रहण के समय के लिए निशाना लगाओ और एक नया पहली प्रतिक्रिया से प्राप्त एंजाइमी दरों के आधार पर समय में तदनुसार समायोजित करें।
    2. संशोधन प्रतिक्रिया के संबंधित प्रकार के लिए नमूना में जोड़े आवश्यक सहकारकों (1 मिमी एटीपी / 2 मिमी फोस्फोराइलेशन के लिए 2 MgCl, एसिटिलीकरण के लिए 1 मिमी एसिटाइल सीओए, मेथिलिकरण के लिए 1 मिमी सैम, आदि।)।
    3. ब्याज की एंजाइम जोड़ें, pipetting द्वारा मिश्रण, एनएमआर ट्यूब में वापस और बाद में स्पेक्ट्रोमीटर (जल्दी से इन आपरेशनों प्रदर्शन) में नमूना हस्तांतरण।
      नोट: यदि कोई उम्मीद enzymatic गतिविधि के बारे में कोई डाटा नहीं है, सब्सट्रेट करने वाली एंजाइम 10 दाढ़ अनुपात को समायोजित: 1। एक पहला परीक्षण चलाने के प्रदर्शन और तदनुसार समायोजितवास्तविक रन।
    4. एक तेजी से स्वत: shimming प्रदर्शन और संदर्भ स्पेक्ट्रा से मापदंडों के बाकी का उपयोग करें।
    5. Interleaved 2 डी 1 एच 15 एन 1 और एच 13 सी स्पेक्ट्रा की श्रृंखला आरंभ करें।
    6. वास्तविक समय में प्रतिक्रिया की प्रगति का पालन करें और अधिग्रहण रोक जब प्रतिक्रिया पूरा या एक वांछित स्तर तक पहुँचता है।
    7. वास्तव में एक ही मानकों के साथ के रूप में पहले प्रक्रिया स्पेक्ट्रा।
    8. सह-संबंध स्पेक्ट्रा के दो प्रकार के लिए एक अलग अधिग्रहण आदेश का उपयोग करते हुए पूरे रन दोहराएँ। तो पहले प्रयोग में एक 1 एच 15 एन सह-संबंध श्रृंखला में पहला था, एक 1 एच 13 सी संबंध के साथ शुरू करते हैं। इस और दोनों स्पेक्ट्रा के लिए एक ही अधिग्रहण के समय होने से, यह साजिश है और एक ही समय के पैमाने पर दोनों विभिन्न आइसोटोप लेबल histones पर PTM प्रतिक्रियाओं की तुलना करने के लिए संभव है। इसके अतिरिक्त, यह औसत और साजिश त्रुटि सलाखों गणना करने के लिए संभव है।
      नोट: एक thorougएनएमआर संकेत विश्लेषण और एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के बाद मात्रा का ठहराव के लिए तरीके का ज विवरण यहां 19 पाया जा सकता है।
    9. प्रत्येक समय पाठ्यक्रम एनएमआर स्पेक्ट्रम से एनएमआर संकेत है कि प्रतिक्रिया की प्रगति रिपोर्ट का चयन करें और उनके रिश्तेदार संकेत एनएमआर स्पेक्ट्रा के लिए एक दृश्य और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग तीव्रता की गणना। संकेत है कि असंशोधित रूप में अच्छी तरह से संशोधित राज्य रिपोर्ट के लिए यह करो। संशोधन के स्तर को निकालें।
    10. प्रतिक्रिया समय के खिलाफ संशोधन के स्तर के मूल्यों की गणना प्लॉट।

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Representative Results

ठीक से refolded octameric प्रजातियों (चित्रा 2) एक जेल निस्पंदन कॉलम के माध्यम से पुनर्गठन मिश्रण का एक रन के बाद अलग कर रहे हैं। octamers के तीन अलग अलग प्रकार युक्त octameric पुनर्गठन पूल मिलकर आत्मीयता शुद्धि योजना के अधीन है। नमूने के लिए सभी कदम से एकत्र की है और पश्चिम बंगाल एसडीएस पृष्ठ से और बाद में विश्लेषण कर रहे हैं। प्रोटोकॉल है कि विषम प्रजातियों में से अलगाव में परिणाम के सही क्रियान्वयन के सत्यापन विभिन्न नमूनों में दो संबध टैग (His- और Strep-) की उपस्थिति (चित्रा 3) का पालन करके हासिल की है। इसके बाद, आत्मीयता टैग TEV प्रोटीज पाचन (चित्रा 4) के बाद हटा रहे हैं। आत्मीयता के टैग का निपटारा असममित octamers विषम nucleosomes पुनर्गठित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। प्रारंभ में, एक छोटे से परीक्षण पैमाने पर पुनर्गठन के डीएनए का इष्टतम दाढ़ अनुपात निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है: octamer है कि एक उच्च में यह परिणामएक monodisperse परिसर के गठन की उपज। बाद में, अनुकूलित मिश्रण अनुपात एक बड़े पैमाने में nucleosomes पुनर्गठन के लिए कार्यरत है। Nucleosome reconstitutions उचित विधानसभा और क्रमश: विभिन्न आइसोटोप लेबल बहन H3 histones की उपस्थिति (चित्रा 5) के लिए प्रोटीन / डीएनए जैल और एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं। एक आवेदन उदाहरण चित्रा 6 में दिखाया गया है। विशेष रूप से, विभिन्न आइसोटोप लेबल और asymmetrically H3S10 nucleosomes पर फॉस्फोरिलेटेड Gcn5 acetyltransferase के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त कर रहे हैं, और दोनों H3 प्रतियां पर H3K14 के एसिटिलीकरण एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा वास्तविक समय में पीछा किया जाता है। विश्लेषण से पता चलता है कि H3S10 फोस्फोराइलेशन ट्रांस में की तुलना में Gcn5 द्वारा H3K14 एसिटिलीकरण को उत्तेजित करता है सीआईएस में।

आकृति 1
चित्रा 1: विभिन्न आइसोटोप-एल की तैयारी के लिए फ़्लोचार्टabeled (और asymmetrically संशोधित) nucleosomes। (ए) के पुनर्गठन और मिलकर आत्मीयता के विभिन्न आइसोटोप लेबल (और asymmetrically संशोधित) हिस्टोन octamers की शुद्धि। (बी) के शुद्ध विषम octamers और एक डीएनए nucleosome स्थिति अनुक्रम के संयोजन से nucleosome पुनर्गठन। (सी) एनएमआर की निगरानी में सीआईएस और में ट्रांस हिस्टोन संशोधित एंजाइमों के साथ asymmetrically संशोधित और विभिन्न आइसोटोप लेबल nucleosomes मिश्रण के बाद संशोधन crosstalk। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: Histone Octamers का पुनर्गठन। refolded हिस्टोन मिश्रण की एक जेल निस्पंदन क्षालन प्रोफ़ाइल। ~ 70 एमएल में प्रमुख शिखर हिस्टोन octamers से मेल खाती है। एक 14 - 20% ढाल एसडीएस पृष्ठ octamer पीक करने के लिए इसी eluted अंशों की जेल (Coomassie ब्लू धुंधला) सही हिस्टोन stoichiometry पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: असममित Histone Octamers की शुद्धि। 14-20% ढाल एसडीएस पृष्ठ जेल (Coomassie धुंधला) और पश्चिम बंगाल मिलकर आत्मीयता शुद्धि योजना के विभिन्न चरणों से नमूनों की His- और Strep- आत्मीयता के टैग के खिलाफ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4: की आत्मीयता टैग हटाया। 18% एसडीएस पृष्ठ जेल से पहले और TEV प्रोटीज के साथ मिश्रण के बाद शुद्ध विषम हिस्टोन octamers की (Coomassie धुंधला)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: विभिन्न आइसोटोप लेबल nucleosomes की बायोकेमिकल और एनएमआर विशेषता। (ए) 6% मूल निवासी पृष्ठ डीएनए जेल (ethidium ब्रोमाइड धुंधला) एक छोटे से परीक्षण पैमाने पर nucleosome पुनर्गठन डीएनए के विभिन्न दाढ़ अनुपात का उपयोग कर की: octamer (बाएं)। एक बड़े पैमाने पर पुनर्गठन nucleosome अनुकूलित डीएनए का उपयोग करने का 6% मूल निवासी पृष्ठ डीएनए जेल (ethidium ब्रोमाइड धुंधला): octamer दाढ़ अनुपात (सही)। (बी) 18% एसडीएस पृष्ठ प्रोटीन जेल पुनर्गठन nucleosomes की (Coomassie धुंधला) चार कोर histones का सही stoichiometry पता चलता है। (सी) 1 एच 15 एन SOFAST-HMQC विभिन्न आइसोटोप लेबल nucleosomes के 15 एन लेबल H3 नकल के स्पेक्ट्रम (केवल H3 पूंछ के अवशेष दिखाई दे रहे हैं - प्रोटीन कोर धीमी गति से tumbling दर की वजह से अदृश्य है)। (D) 1 एच 13 सी HSQC विभिन्न आइसोटोप लेबल nucleosomes की 13 सी लेबल H3 नकल के स्पेक्ट्रम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: में सीआईएस और ट्रांस में एनएमआर निगरानी संशोधन पार बात Gcn5 एसटीट्रांसफेरासी की H3K14 एसिटिलीकरण गतिविधि पर H3S10 के असममित Phosphorylation द्वारा लगाए गए। (ए) की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व विभिन्न आइसोटोप लेबल और asymmetrically फॉस्फोरिलेटेड पर H3S10 nucleosomes, Gcn5 acetyltransferase और H3K14 एसिटिलीकरण मानचित्रण के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की सीआईएस में और ट्रांस में। (बी) 1 एच 15 एन SOFAST-HMQC और 1 एच 13 सी HSQC पहले और Gcn5 के साथ प्रतिक्रिया के बाद विषम nucleosomes की स्पेक्ट्रा (चयनित क्षेत्रों)। (सी) समय हल एनएमआर asymmetrically H3S10 फॉस्फोरिलेटेड nucleosomes पर Gcn5 द्वारा H3K14 एसिटिलीकरण की निगरानी। दो स्वतंत्र प्रयोगों से औसत और विभिन्नता (त्रुटि सलाखों) दिखाए जाते हैं। अनुमति के साथ Reproduced 16। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस चित्र।

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Discussion

Nucleosome पुनर्गठन के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल एक 165 बीपी लंबे डीएनए 601 Widom nucleosome स्थिति अनुक्रम 20 से युक्त टेम्पलेट का इस्तेमाल करता है, लेकिन इसी तरह के प्रदर्शन डीएनए टेम्पलेट्स के विभिन्न लंबाई का उपयोग कर की उम्मीद है। प्रोटोकॉल बनाया गया है और हिस्टोन H3 की विषम प्रकार का उपयोग कार्यरत था। इसी सिद्धांत के साथ, विधि अन्य कोर histones के लिए भी लागू किया जा सकता है और इसके अलावा विभिन्न आइसोटोप लेबल के साथ दो अलग कोर histones ले जाने के परिसरों को पुनर्गठित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल भी थोड़ा शुरू में हिस्टोन उप परिसरों को पुनर्गठित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है और सीधे octamers हिस्टोन नहीं। इस संशोधन के बाद, विषम H3-एच 4 tetramers ही मिलकर शुद्धिकरण योजना को रोजगार से पुनर्गठन किया जा सकता है। बाद में अलग से पुनर्गठित H2A-H2B dimers और डीएनए के साथ मिश्रित कर रहे हैं nucleosomes 16 इकट्ठा करने के लिए। अंतिम पैदावार और संशोधित protoc के समग्र प्रदर्शनराजभाषा मूल एक के समान हैं।

प्रोटोकॉल दृढ़ता से दो संबध स्तंभों की क्षमता कुशलता से प्रासंगिक प्रजातियों के लिए बाध्य करने के लिए और इस तरह अंत अत्यधिक शुद्ध विषम परिसरों पर उपज पर निर्भर है। यह प्रत्यक्ष और ठोस सबूत है कि अंतिम शुद्ध जटिल वास्तव में और केवल विषम है प्रदान करने के लिए बोझिल है। हालांकि, प्रासंगिक एंटीबॉडी के साथ सभी शुद्धि चरणों से नमूने का विश्लेषण पश्चिम बंगाल मिलकर शुद्धिकरण योजना की सफलता (चित्रा 3) के लिए विश्वसनीय संकेत प्रदान करता है। उसी का परिणाम है, और इसलिए अतिरिक्त आश्वासन, एनएमआर तरीकों 16 से आत्मीयता के टैग की उपस्थिति के लिए एक ही नमूने का विश्लेषण करके प्राप्त किया गया। फिर भी, अगर पश्चिम बंगाल विश्लेषण सममित लोगों के साथ विषम प्रजातियों के प्रदूषण को इंगित करता है, एक छोटा सा बदलाव पहले शुद्धि कदम (नी NTA) है कि परिणाम में सुधार कर सकते हैं पर अपनाया जा सकता है। विशेष रूप से, एक isocratic क्षालन के बजाय, एक imidazole gradien टी क्षालन (10-250 मिमी) नियोजित किया जा सकता है और उसके बाद, केवल पहली क्षालन भिन्न है कि अत्यधिक विषम प्रजातियों में समृद्ध कर रहे हैं जमा कर रहे हैं और आत्मीयता कॉलम के माध्यम से चला रहे हैं। यह स्ट्रेप समानता टैग की उपस्थिति के लिए क्षालन अंशों की पश्चिम बंगाल विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है।

ब्याज की PTM के संबंध में आइसोटोप-लेबल के चयन के बजाय लचीला क्योंकि अधिकांश मामलों के लिए, एनएमआर दोनों 1 एच 15 एन 1 और एच 13 Ccorrelation स्पेक्ट्रा का उपयोग कर एक ही PTM मानचित्रण करने में सक्षम है। हालांकि, कुछ अमीनो एसिड के लिए, lysines की तरह, पक्ष श्रृंखला 1 एच 13 सी अनुनादों के लिए रासायनिक पारी फैलाव बल्कि सीमित है। साथ ही, जब एक लाइसिन संशोधित एंजाइम का लक्ष्य साइटों अज्ञात हैं, लाइसिन PTMs की साइट विशेष पढ़ने के लिए बाहर नहीं सीधा है। इन मामलों में, वैकल्पिक तरीकों साइट चयनात्मक 13 सी-लेबलिंग रोजगार, अर्द्ध सिंथेटिक हिस्टोन उत्पादन के साथ संयुक्त"> 21 या कि चयनात्मक उत्तेजना के माध्यम से संशोधन राज्यों की विशिष्ट पहचान के लिए सक्षम बनाता नव स्थापित एनएमआर पल्स दृश्यों के उपयोग के 22 दिनचर्या। एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रदान नहीं बल्कि कम संवेदनशीलता। इस संबंध में, nucleosomes (माइक्रोन रेंज) के अपेक्षाकृत उच्च मात्रा में प्रदर्शन करने की जरूरत है एंजाइमी प्रतिक्रियाओं। यह एक उच्च throughput सेटअप करने के लिए विधि के विकास को रोकता है।

समवर्ती, एक नए रासायनिक विधि, रासायनिक शुद्ध, asymmetrically संशोधित nucleosomes के संश्लेषण के लिए शुरू किया गया है उच्च पैदावार के साथ, परिभाषित PTMs 23 ले। यह दृष्टिकोण fluorography के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया है, PTM crosstalk तंत्र का अध्ययन करने के लिए। PTMs का पता लगाने में fluorographic तरीकों में से कम-संकल्प की क्षमता के कारण, निष्कर्ष सममित और असममित PTMs के विभिन्न संयोजनों को ले जाने, बल्कि nucleosomes का एक सेट पर समग्र enzymatic गतिविधियों की तुलना द्वारा परोक्ष रूप से प्राप्त किए गएप्रत्येक बहन हिस्टोन की इसी साइटों पर PTM प्रतिक्रियाओं का प्रत्यक्ष अवलोकन द्वारा की तुलना में। हालांकि, isotopically लेबल histones के समावेश और PTM readout के लिए एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के उपयोग के ऊपर उल्लिखित विधि asymmetrically संशोधित nucleosomes के उच्च संकल्प PTM विश्लेषण के लिए एक अतिरिक्त उपकरण का गठन कर सकता।

भविष्य में asymmetrically संशोधित nucleosomes के नए प्रकार की पहचान के संबंध में, वर्तमान पद्धति सीआईएस में और nucleosomal substrates पर ट्रांस PTM crosstalk प्रतिक्रियाओं में विश्लेषण करने के लिए एक उच्च संकल्प उपकरण का गठन करने के लिए करना है। विशेष रूप से, उच्च महत्व के crosstalk तंत्र है कि द्विसंयोजक nucleosomes 24 कि asymmetrically होते हैं, दोनों transcriptionally सक्रिय और दमनकारी PTMs को जन्म दे की डिकोडिंग है।

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Acknowledgements

लेखक धन्यवाद डॉ फिलिप Selenko (एफएमपी-बर्लिन) गीला अंतरिक्ष प्रयोगशाला और बुनियादी सुविधाओं को उपलब्ध कराने के एक शोध अनुदान के माध्यम से काम के वित्तपोषण के लिए प्रयोगों और ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) प्रदर्शन करने के लिए (लाइट 2402 / 2-1)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidinium HCl Applichem A14199 Use high quality Gu-HCl
Tris  Roth 4855.2
DTT Applichem A1101
NaCl VWR chemicals 27810.364
EDTA Roth 8043.2
Na2H2PO4 Applichem A1046
NaH2PO4 Applichem A3902
Imidazole Applichem A1073
d-Desthiobiotin Sigma D1411
Ni-NTA Superflow Qiagen 1034557
Strep-Tactin Superflow IBA 2-1207-001
His-probe antibody Santa Cruz sc-8036
Strep-tactin conjugated HRP IBA 2-1502-001
Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28-9893-35
6 - 8 kDa dialysis membrane Spectrumlabs spectra/por 1, 132650
50 kDa dialysis membrane Spectrumlabs spectra/por 7, 132129
10 kDa centrigugal filter unit Merck Millipore UFC901024
30 kDa centrigugal filter unit Merck Millipore UFC903024
Solution-state NMR spectrometer  at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe
Buffer name Component
Unfolding Buffer 7 M Guanidinium HCl
20 mM Tris, pH 7.5
10 mM DTT
Refolding Buffer 10 mM Tris, pH 7.5
2 M NaCl
1 mM EDTA
2 mM DTT
Assay Buffer 25 mM Na2H2PO4, pH 6.8
25 mM NaCl
2 mM DTT

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References

  1. Hansen, J. C. Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).
  2. Clapier, C. R., Cairns, B. R. The Biology of Chromatin Remodeling Complexes. Annu. Rev. Biochem. 78, 273-304 (2009).
  3. Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, (12), 1218-1227 (2012).
  4. Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications. Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).
  5. Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The Language of Histone Crosstalk. Cell. 142, (5), 682-685 (2010).
  6. Liokatis, S., et al. Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, (8), 819-823 (2012).
  7. Voigt, P., et al. Asymmetrically Modified Nucleosomes. Cell. 151, (1), 181-193 (2012).
  8. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, (1), 91-93 (2011).
  9. Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications. Chem. Rev. 115, (6), 2376-2418 (2015).
  10. Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 132, (42), 14704-14705 (2010).
  11. Binolfi, A., et al. Intracellular repair of oxidation-damaged α-synuclein fails to target C-terminal modification sites. Nat. Commun. 7, 10251 (2016).
  12. Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds. J. Biomol. NMR. 33, (4), 199-211 (2005).
  13. Theillet, F. X., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54, (3), 217-236 (2012).
  14. Dyer, P. N., et al. Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA. Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).
  15. Artimo, P., et al. ExPASy :SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, (W1), 597-603 (2012).
  16. Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 55, (29), 8262-8265 (2016).
  17. Stützer, A., et al. Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails. Mol. Cell. 61, (2), 247-259 (2016).
  18. Zhou, B. R., et al. Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome. J. Mol. Biol. 421, (1), 30-37 (2012).
  19. Theillet, F. X., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8, (7), 1416-1432 (2013).
  20. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276, (1), 19-42 (1998).
  21. Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 47, (52), 10030-10074 (2008).
  22. Theillet, F. X., et al. Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 134, (18), 7616-7619 (2012).
  23. Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes. Angew. Chem. Int. Ed. 55, (8), 2903-2906 (2016).
  24. Bernstein, B. E., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125, (2), 315-326 (2006).

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