Isolering av cirkulerande tumörceller i en ortotopisk musmodell av kolorektal cancer

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver upprättandet av ortotopiska kolorektala tumörer via injektion av tumörceller eller organoider in i cecum av möss och efterföljande isolering av cirkulerande tumörceller (CTC) från denna modell.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Kochall, S., Thepkaysone, M. L., García, S. A., Betzler, A. M., Weitz, J., Reissfelder, C., Schölch, S. Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer. J. Vis. Exp. (125), e55357, doi:10.3791/55357 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Trots fördelarna med enkel användbarhet och kostnadseffektivitet har subkutana musmodeller allvarliga begränsningar och simulerar inte noggrant tumörbiologi och tumörcellspredning. Ortotopmusmodeller har införts för att övervinna dessa begränsningar; Sådana modeller är emellertid tekniskt krävande, speciellt i ihåliga organ som stor tjocktarm. För att producera likformiga tumörer som på ett tillförlitligt sätt växer och metastaserar är standardiserade tekniker för framställning och injektion av tumörceller kritiska.

Vi har utvecklat en ortotopisk musmodell av kolorektal cancer (CRC) som utvecklar högt likformiga tumörer och kan användas för tumörbiologiska studier såväl som terapeutiska försök. Tumörceller från antingen primära tumörer, 2 -dimensionella (2D) cellinjer eller 3-dimensionella (3D) organoider injiceras i cecum och beroende på metastatiska potentialen hos de injicerade tumörcellerna bildas mycket metastatiska tumörer. Dessutom,CTCs finns regelbundet. Vi beskriver här tekniken för tumörcellsberedning från både 2D-cellinjer och 3D-organoider, såväl som primärtumörvävnad, kirurgiska och injektionsteknikerna samt isolering av CTC från de tumörbärande mössen och nuvarande tips för felsökning.

Introduction

Colorectal cancer (CRC) är en av de vanligaste orsakerna till cancerdöd i västra länder. 1 Även om den primära tumören ofta kan resekteras, försvårar förekomsten av avlägsna metastaser dramatiskt prognosen och leder ofta till döden. 2 , 3 Metastasens biologiska korrelat är cirkulerande tumörceller (CTC), som avlägsnas från tumören, överlever i cirkulation, fäster vid epitel i målorganet, invaderar orgeln och slutligen växer ut till nya skador. 4 Även om CTCs är kända för att vara av prognostisk relevans, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 är deras biologi förstås först delvis som ett resultat av deras extrema sällsynthet i CRC. 10

Musmodeller är en kraftfull tOol att studera olika aspekter av cancerbiologi. Klassiska subkutana tumörmodeller framställs genom subkutan injektion av tumörceller i mottagande möss, vilka kan vara antingen immunokompetenta (om syngene-ka murina tumörceller används) eller immunbristande. Subkutana tumörmodeller är billiga och producerar data snabbt; Deras slutpunkts-tumörtillväxt kan enkelt och icke-invasivt mätas. Emellertid misslyckas 88% av nya föreningar som har visat antitumöraktivitet i sådana modeller i kliniska prövningar. 11 Detta beror dels på interspecies skillnader mellan människor och möss. En stor del av detta misslyckande beror emellertid på det låga predictive värdet av subkutana musmodeller.

Ortotopmusmodeller, där tumörcellerna injiceras i ursprungsorganet och därmed växer i sin ursprungliga mikromiljö, används därför alltmer i cancerforskning. 11 , 12 , 13 , 14 Ortotopiska modeller simulerar inte bara lokala tumörtillväxtbetingelser. Som ett resultat av den anatomiskt korrekta platsen för tumörtillväxt, tillåter ortototopmusmodeller också realistisk simulering av metastas och används därför för att studera CTC biologi 8 , 15 , 16 eller deras svar på olika behandlingar i CRC. 13 , 17

En stor nackdel med ortotopmusmodeller är deras tekniska komplexitet. Beroende på organet där cellerna ska injiceras är inlärningskurvan tills experimenten kan inducera reproducerbara tumörer ganska lång. Detta gäller särskilt för kolorektala cancermodeller, eftersom tumörcellerna måste injiceras i tarmväggen, vilket ofta resulterar i perforering, tumörcellsläckage eller endoluminal tumörcellsförlust. Detta aRticle är avsedd att beskriva metoden för cellpreparat från primära vävnadsprover, 2D-cellinjer och 3D-organoidkultur och deras injektion i muskottens cecum. Tekniken som beskrivs här leder till mycket likformiga tumörer och beroende på tumörbiologin hos cellinjen som används för injektion, reproducerbar bildning av avlägsna metastaser och CTC i mottagarmusen. 15

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De djurförsök som presenteras här utvärderades oberoende av och godkändes av en institutionell och en statlig djurvårds- och användningskommitté och genomfördes enligt riktlinjerna för FELASA ( Federation of Laboratory Animal Science Associations ). Alla möjliga åtgärder vidtogs för att minimera lidande inklusive anestesi och analgesi eller vid behov prematur eutanasi.

1. Framställning av celler och organoider

OBS! Använd en volym på 20 μL med 100 000 celler för varje injektion. Använd basmembranmatris (BMM) för att förhindra läckage och säkerställa standardiserad injektion. För att säkerställa reproducerbara resultat, utföra cellinriktningsautentiseringsanalyser ( t.ex. via STR profilering) med jämna mellanrum.

  1. Framställning av primära cellsuspensioner från färsk vävnad
    OBS! Använd alltid under sterila förhållanden. Omedelbar överföring av färsktResekterad vävnad från operationsstugan till laboratoriet på is krävs för att säkerställa en hög livskraft hos cellerna.
    Patientens välbefinnande och optimal behandling måste alltid vara den första prioriteringen. Därför måste vävnadsprover för forskning erhållas på ett sätt som inte stör den efterföljande patologiska upparbetandet och staging av den resekterade tumören. I de flesta fall är det därför rimligt att få proverna för forskning som erhållits av en utbildad patolog för att säkerställa att den patologiska diagnosen inte störs.
    1. Omedelbart efter sterilt avlägsnande från det återvunna provet (helst ~ 1 cm 3 ) placeras vävnadsprovet i ett 50 ml rör fyllt med 20-30 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Förvara röret på is och omedelbart överföra till laboratoriet.
    2. Lägg vävnaden i en Petriskål och tvätta den två gånger med mycket PBS för att ta bort det återstående blodet.
    3. Skär vävnaden i små bitar (~ 2-4 mm) med en scaLpel ( t.ex. med ett # 20 eller # 36 blad).
    4. Använd dissociatorn enligt tillverkarens instruktioner för att ytterligare dissociera tumörvävnaden till en encellsuspension. Alternativt, använd andra protokoll med enzymatisk tumörmältning.
    5. Räkna cellerna i den resulterande encellsuspensionen ( t.ex. i en coulterräknare eller en hemocytometer).
    6. Centrifugera (5 min vid 1500 xg) och tvätta cellsuspensionen två gånger med PBS.
    7. Resuspendera cellerna i BMM vid en koncentration av 5 x 10 6 celler / ml och hålla dem på is.
  2. Framställning av cellinjer för injektion
    1. Växa alla kolorektala cancercellinjer under standardodlingsbetingelser (37 ° C, 5% CO 2) och förbereda dem på operationsdagen.
    2. Skörda cellerna enligt standardcellkulturprotokoll, räkna cellerna ( t.ex. i en coulterräknare eller en hemocytometer) och beräkna reqUtspädd mängd för alla injektioner beroende på antalet djur som ska injiceras.
    3. Förbered 3-5x av den faktiskt nödvändiga volymen för att ta hänsyn till pipetteringsförluster och den döda volymen av injektionssprutan.
    4. Centrifugera (5 min vid 1500 g) och tvätta cellsuspensionen två gånger med PBS.
    5. Resuspendera cellerna i BMM vid en koncentration av 5 x 10 6 celler / ml och hålla dem på is.
  3. Organoidpreparat
    NOTERA: Alla 3D organoid kulturer odlas under vanliga odlingsbetingelser (37 ° C, 5% CO 2). Detaljerade protokoll för organoid kultur har publicerats tidigare. 18 , 19 , 20 Liknande konventionella cellinjer rekommenderar vi en volym på 20 μL BMM med 100 000 celler per injektion. Organoiderna är beredda vid operationsdagen enligt följande:
    1. Förbered följande medium (i följande referensTill DMEM / F12 +++): Advanced Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% Glutamin (200 mM) + 1% Penicillin / Streptomycin.
    2. Förfyll 15 ml rör med 1 ml DMEM / F12 +++.
    3. Aspirera försiktigt organoiderna från odlingsplattans yta och överför innehållet av 3 till 5 brunnar i ett 15 ml rör.
    4. Bryt försiktigt organoiderna upp i mindre bitar genom att pipettera dem upp och ner med en förlängd glaspipett.
    5. Tillsätt 5 ml DMEM / F12 +++ till röret, följt av centrifugering vid 1000 xg under 5 min.
    6. Efter centrifugering avlägsnas supernatanten, resuspenderas pelleten i 600 ul enzymatisk dissociationsbuffert och överför suspensionen till en brunn i en 6-brunnsplatta.
    7. Inkubera vid 37 ° C i 1-5 minuter och pipettera sedan suspensionen försiktigt upp och ner för att lösa upp organoiderna.
      OBS: Verifiera digestionen via mikroskop; Det är fullständigt när alla cellklyftor har dissocieratsD till enskilda celler.
    8. Efter framgångsrik digestion, tillsätt 1,4 ml DMEM / F12 +++ för att stoppa matsmältningen. Överför sedan alla brunnar av uppdelade organoider till ett 50 ml rör.
    9. Räkna cellerna och beräkna önskad mängd för alla injektioner.
    10. Förbered 3 - 5x av den faktiskt nödvändiga volymen för att ta hänsyn till pipetteringsförluster och dödvolymen av injektionssprutan
    11. Centrifugera (5 min vid 1500 xg) och tvätta cellsuspensionen två gånger med PBS.
    12. Återsuspenderades cellerna i BMM till en koncentration av 5 x 10 6 celler / ml och hålla dem på is.

2. Ortotopisk musmodell

  1. Framställning av mottagande djur för operation
    OBS: Använd 6-8 veckor gamla NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gamma, NSG) möss som mottagare. 21 NSG är bland de mest immunkompromierade mössen, som saknar mogna B-, T- och NK-celler tillsammans med flera andra immunförsvarfekter. 21 De växer på ett tillförlitligt sätt även tumörer, även om låga cellantal injiceras och är mycket benägna att avlägsna metastaser. NSG-möss är utmärkta uppfödare och kan förvaras i konventionella specifika patogenfria (SPF) -enheter.
    1. Före första snittet injicera 0,05 mg / kg buprenorfin subkutant.
    2. Använd sevofluran vid 3-3,5 volymprocent för allmän anestesi. En förlust av tånklämningsreflexen indikerar tillräcklig anestesi.
    3. Täck ögonen hos de bedövade mössen med oftalmisk salva för att undvika uttorkning av hornhinnan.
    4. Håll musen bakåt i ett litet bord.
    5. Raka buken med en elektrisk rakapparat (depilatory cream kan användas alternativt) och desinficera med minst 3 gånger klorhexidin / jod och 70% alkohol alternativt.
    6. Täck det kirurgiska fältet med sterila draperier.
      OBS! Användningen av perioperativa antibiotika är frivillig och omfattas av institutionella riktlinjer.
  2. Midline laparotomi och exponering av cecum
    1. Använd saxar (skalpeller kan användas alternativt) för att göra en liten mittlinje snitt (3 - 5 mm) av huden på underlivet. Plocka upp bukväggen muskulaturen med pincett och noggrant incise det med sax, så att bukhålan öppnas.
    2. Identifiera och försiktigt utsida cecum med atraumatiska tångar. Placera den blindändiga påsen av cecum på buken som pekar kranialt.
    3. När du är exteriör, håll cecum fuktig med hjälp av varma saltvattenpipor hela tiden.
  3. Ortotopisk injektion, stängning av buken och postoperativ återhämtning
    1. För intravenös injektion, använd en standard 1 ml spruta med en 30 G kanyl. Montera sprutan på en mikroinjektionspump, som i sin tur monteras på en mikromekanipulator.
    2. Ta försiktigt spetsen av cecum med atraumatiska tångar och smidigt försiktigt det genom att sträcka det nedåtD med en andra uppsättning tångar fuktad med varm saltlösning.
    3. Placera kanylen direkt ovanför cecum.
    4. Utför följande steg under visuell kontroll med ett binokulärt kirurgiskt mikroskop.
    5. Ta försiktigt cecum med två atraumatiska tångar i båda ändarna av den yttre delen av cecum, sträck den något och dra sedan långsamt det över kanylen som är placerad parallellt och direkt ovanför. Det är avgörande att inte perforera hela tarmväggen (sålunda injicera cellerna i lumen) samt att perforera serosan bortom den initiala penetrationspunkten, eftersom detta skulle leda till läckage och peritoneal spridning.
      1. Flytta tarmen mot kanylen, inte kanylen mot tarmen. Håll och sträck tarmen mellan två tångar. Kirurgens händer måste vila på en yta för att minska tremor.
    6. Injicera cellerna mellan serosa (ses som mycket tunt, genomskinligt foder ovanför thE intramurala blodkärl) och musklerna. Kanylen måste därför placeras visuellt över blodkärlen och under det tunna genomskinliga membranet.
    7. Använd en fotbrytare för att starta injektionen för att minska tremor medan kanylen är inuti tarmväggen.
    8. När kanylen är på plats, starta injektionen. Använd en varaktighet av 20 s, vilket resulterar i 1 μl / s inställning på pumpens styrenhet.
      OBS: Injektionen i eller nära ett skadat blodkärl leder till direkt intravaskulär spridning och avlägsen metastas och bör därför undvikas.
    9. Efter avslutad injektion, försiktigt avlägsna kanylen genom att dra den bakåt.
    10. Placera en torr vatpinne under cecum, och skölj sedan ordentligt sköljet med destillerat vatten för att lysa läckta celler och därmed förhindra artificiell peritoneal spridning.
  4. Stängning av buken och postoperativ återhämtning
    1. Efter rInsing, försiktigt tillbaka cecum till bukhålan.
    2. Stäng bukväggen med 6-0 snabbt absorberbara löpande suturer.
    3. Stäng huden med kirurgiska sårklämmor.
    4. Placera musen på en värmekarta inställd till 38 ° C tills den helt återhämtar sig från anestesen.
    5. Observera noggrant det postoperativa tillståndet hos mössen under de följande 48 timmarna. Vid nöd, behandla med 0,05 mg / kg buprenorfin varje 12 h.
    6. Övervaka mössen minst en gång dagligen för tecken på nöd på grund av tumörtillväxt.

3. Isolering av cirkulerande tumörceller från helblodprover

OBS: Hämta blod genom transkutan hjärtpunktur på bedövade möss, följt av eutanasi. Helst drajs 1000 μL blod i en spruta som är förfylld med 100 μl av ett antikoaguleringsmedel (etylendiamintetraättiksyra (EDTA) eller heparin). Använd en anti-human-EpCAM (epithelialcelladhesionMolekyl) antikropp för att identifiera CTC: erna. Detta fungerar mycket bra om mänskliga epitelcellinjer används i musmodellen. För andra apparater kan olika antikroppar krävas.

  1. CTC-anrikning:
    1. Förfyll 15 ml rör med 5 ml densitetsgradientmedium och försiktigt överföra blodet i 15 ml röret.
    2. Centrifugera (30 min vid 300 xg utan broms) och försiktigt avlägsna den övre supernatanten.
    3. Häll resten i ett nytt 15 ml rör och centrifugera (15 min, 300 xg med broms).
    4. Återställ interfasen innehållande mononukleära celler (kassera resten) och tvätta cellerna två gånger med PBS.
    5. Resuspendera pelleten i 200 | il PBS / 1% EDTA och tillsätt 4 | il EpCAM-antikropp. Inkubera 20 minuter på is i mörkret.
  2. Screening och plockning
    1. Förbered följande buffert (i det följande kallad plockningsbuffert): PBS + 10% fetalt kalvserum (FCS) + 1% Penicillin / STreptomycin (1%) + 0,8% EDTA.
    2. Använd en PAP-penna för att rita en ~ 1 cm cirkel i en 6 cm steril petriskål (förhindrar att vätskan sprids i disken) och pipett 700 μL plockningsbuffert i denna cirkel.
    3. Tillsätt 50 μl cellsuspension till 700 μL plockningsbufferten i cirkeln. Kontrollera densiteten hos cellerna med mikroskopet. Dela provet i olika rätter om det är för tätt.
    4. Vänta på att cellerna ska ligga ner (~ 5 min).
    5. Skärmen av cell-suspensionen för färgade (= EpCAM-positiva) celler.
    6. När en cell har hittats, plocka cellen med mikromanipulatorn och sätt den i 50 μl buffert beroende på den avsedda nedströmsanalysen ( t.ex. RNA-extraktionsbuffert eller odlingsmedium).
    7. Beroende på avsedda nedströmsanalyser, isolera EpCAM-negativa celler och / eller medium som negativa kontroller.
    8. Fortsätt med nedströmsanalyser ( t.ex. cellkultur, PCR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den framgångsrika och reproducerbara generationen av kolorektala tumörer i denna modell beror kritiskt på exakt injektion av cellerna utan spill eller läckage. Om detta uppnås är denna modell extremt pålitlig och resulterar mycket sällan i artificiell peritoneal spridning. Tumörernas tillväxtkinetik såväl som deras spridningsmönster beror på biologin hos de använda organoiderna och cellerna. 15 Medan HCT116-celler på ett tillförlitligt sätt metastaserar till levern i denna modell, bildar SW620-cell ortotopiska tumörer men metastaseras inte. 15

Användningen av HCT116-celler i denna modell ger tillförlitligt resultat hos moribunda möss inom 35 dagar efter injektion av tumörcell. Primär tumörer mäter ca 10 mm i storlek ( Figur 1A och Figur 2A ), levermetastaser ( Figur 1B Ong> och figur 2B ), lungmetastaser ( Figur 1C och Figur 2C ) och cirkulerande tumörceller ( Figur 3 ) finns nästan alltid närvarande. Vid möss som bär HCT116-tumörer är CTCs 35 dagar efter injektion av tumörceller närvarande i högfrekvens och kvantitet och kan enkelt isoleras för nedströmsanalyser ( Figur 3 ).

Figur 1
Figur 1: Makroskopiska bilder efter avläsning 35 dagar efter ortototopinsprutningen av HCT116-humana CRC-celler i NSG-möss. ( A ) Primär tumör (streckad linje) i cecum. ( B ) Lever med multipla metastaser. ( C ) Lungmetastaser (pilar).1large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2: Histologiska bilder av organen som visas i Figur 1 . ( A ) Primär tumör (H & E). ( B ) Levermetastas (H & E). ( C ) Lungmetastas (anti-EpCAM immunohistokemi). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3: Cirkulerande tumörceller (HCT116-celler i NSG-möss, 35 dagar efter tumörcellinjektion). Ljusfält ( A B )) bilder av CTC i perifer blodmononukleär cell (PBMC) fraktion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Trots sin prekliniskt beprövade aktivitet i subkutana musmodeller misslyckas den stora majoriteten av nya föreningar i kliniska prövningar och når aldrig till kliniken. 11 Denna uppenbara insufficiens av subkutana musmodeller för att exakt simulera biologiska och tillväxtmönster hos tumörer har lett till utvecklingen av ortopotopmusmodeller baserat på injektion av tumörceller direkt in i det ursprungliga organet.

Ortotopiska musmodeller kan simulera biologin och spridningen av fasta tumörer mycket mer exakt än subkutana modeller. 15 Viktiga nackdelar är emellertid dålig reproducerbarhet, speciellt i tekniskt krävande organ, såsom ihåliga organ samt den tekniskt krävande övervakningen av tumörtillväxten. I vår modell har vi därför fokuserat på tumörstorlek vid en fördefinierad tidpunkt snarare än upprepade bildbehandlingar, vilket begränsar antalet tekniskaLy utarbeta och för djurs stressiga undersökningar. Den här beskrivna modellen kan användas för olika tillämpningar såsom karakterisering av tumörcellinjer, 15 undersökning av tumörbiologi och spridning såväl som terapeutiska försök. 17 Tydliga slutpunkter är storleken på den primära tumören och antalet avlägsna metastaser, men mer utarbetade slutpunkter, såsom CTC-nummer 17 eller avbildningsmodaliteter, kan också användas.

Det mest kritiska steget i vårt protokoll är subserosal tumörcellinjektion. Det kräver övning och måste alltid utföras under direkt visuell kontroll. Om depositionen ligger någon annanstans men under serosa men över slemhinnan kommer det varken att vara någon tumörtillväxt alls eller oförutsägbar tillväxt och spridning, vilket gör resultaten ojämförliga. Andra möjliga orsaker till bristen på tumörutveckling inkluderar icke-levande celler ( t.ex. </ Em>, på grund av den långa tidsperioden mellan skörden och injektionen av cellerna) eller inte helt syngene möss. Detta är möjligt om C57Bl / 6-möss används; Eftersom det finns flera substrainer av C57Bl / 6 ( t.ex. C57Bl / 6J och C57Bl / 6N) som visar distinkta genetiska och fenotypiska skillnader 22 som också reflekteras i tumörtagningshastigheter. 23

Den här beskrivna högkontrollerade injektionstekniken leder till höggradigt reproducerbar tumörtillväxt och spridning och särskiljer denna modell från tidigare beskrivna ortotopiska modeller. 24 Vidare minskar sköljningen av cecum med destillerat vatten efter injektion av tumörceller dramatiskt graden av artificiell peritoneal spridning; Därför, om peritoneal karcinomatos uppträder i vår modell, är det troligtvis ett resultat av cellens biologi snarare än en iatrogen tumörcellläckage.

Begränsningar av denna mOdel är de mottagande mössen som måste vara immunbristiga om humana cellinjer ska användas. Detta begränsar allvarligt modellens tillämpning i immunologiska studier. Denna begränsning kan emellertid övervinnas genom användning av syngene murincellinjer eller organoider (opublicerade data). En annan begränsning är användningen av cellinjer själva. Tumörcellinjer är ofta mycket anaplastiska, vilket lämnar frågor om deras representativitet hos den ursprungliga tumörens biologi. Denna begränsning är inte närvarande i genetiskt modifierade musmodeller (GEMM), som utvecklar en ny tumör genom introduktion av vävnadsspecifika onkogena mutationer. 12 Sådana GEMM är vanligtvis baserade på villkorliga germlinjemutationer (t ex en floxad Apc-gen) och Cre-medierad aktivering av mutationerna, antingen genom lokal infektion med adeno-cre 25 , 27 , 28 eller en vävnadsspecifik promotor-körninguttryck. 29 , 30 , 31 Men sådana modeller kräver ofta omfattande korsningar och har en högvariabel biologi. Om primära cellinjer används i den här presenterade modellen kan begränsningen av låg representativitet övervinnas utan förlust av de andra fördelarna med vår modell, såsom reproducerbarhet och relativ kostnadseffektivitet.

En annan begränsning av den här föreslagna tekniken är beroende av EpCAM som en ytmarkör. Det är välkänt att EpCAM kan förloras under EMT och att det finns en bråkdel av CTC som är EpCAM-negativa. 10 , 15 Beroende på syftet med experimentet och cellinjerna som används för injektion kan därför andra identifieringsmedel ( t.ex. GFP-märkning av cellerna före injektion) användas.

Sammanfattningsvis presenteras den här presenterade modellen cBildar ett flexibelt verktyg för att studera tumörutveckling och spridning i samband med tumörens ursprungliga mikromiljö i kolon. Om metastatiska cellinjer används, simulerar den på ett trovärdigt sätt tumörcellspredning på alla relevanta ställen för CRC inklusive CTC i blodflödet. Det är därför ett användbart verktyg för att studera fenotypiska förändringar under tumörtillväxt och spridning och möjliggör upprepad isolering och karakterisering av CTC i CRC. 15

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av den tyska forskningsstiftelsen (WE 3548 / 4-1) och Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture Media and Components
Advanced DMEM F12 Invitrogen 12634010 DMEM/ F12 +++ medium
HEPES (1 M) Life Technologies GmbH 15630056 DMEM/ F12 +++ medium
Glutamax-I Supplement (200 mM) Life Technologies GmbH 35050038 DMEM/ F12 +++ medium
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 DMEM/ F12 +++ medium
DMEM Life Technologies GmbH 61965026 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 basic medium of 2D cell lines (DMEM/10% FCS)
TrypLE Express enzymatic dissociation buffer Life Technologies GmbH 12604021
Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) CORNING B.V. Life Sciences 356231
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169
Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) Life Technologies GmbH 25200072
6-/48-well plates with lid CORNING 3516/3548
cell culture flask 75 cm², 250 mL VWR International GmbH 734-2066
cell culture flask 150 cm², 600 mL Corning B.V. Life Sciences 355001
Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL Sarstedt AG & Co. 72.706.400/ 72.695.400
15 mL, 50 mL centrifuge tubes Greiner-Bio-One GmbH 188271/227270
TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) Bio-Rad Laboratories GmbH 1450016
Pasteur pipettes (glass, 150 mm) Fisher Scientific GmbH 11546963/ FB50251 thinly pulled by using a bunsen burner
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235 for primary tumor tissue preparation
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 for primary tumor tissue preparation
gentleMACS C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 for primary tumor tissue preparation
Human Tumor Dissociation Kit Miltenyi Biotec 130-095-929 for primary tumor tissue preparation
Falcon 70 µm Cell Strainer Corning B.V. Life Sciences 352350 for primary tumor tissue preparation
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Equipment
Sevoflurane AbbVie Germany GmbH & Co. KG -
Medical oxygen Air Liquide Medical GmbH -
Buprenorphine Temgesic -
Bepanthen - opthalmic ointment Bayer Vital GmbH 10047757
Normal saline 0.9% (E154) Serumwerk Bernburg AG 10013
Aqua ad injectabilia Braun 235144
1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO Braun/neoLab 194291661
30G injection needle BECTON DICKINSON 304000
cellulose swabs Lohmann & Rauscher Deutschland 13356
Micro-Adson Forceps FST - Fine Science Tools 11018-12
Iris Scissor - ToughCut FST - Fine Science Tools 14058-11
Olsen-Hegar Needle Holder FST - Fine Science Tools 12002-12
AutoClip Kit FST - Fine Science Tools 12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) Johnson & Johnson Medical GmbH Z1012H
Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer Parkland Scientific V3000PS/PK
UltraMicro Pump with Micro4 Controller World Precision Instruments UMP3-4 equipment for highly controlled orthotopic injection
Footswitch for SYS-Micro4 Controller World Precision Instruments 15867 equipment for highly controlled orthotopic injection
Three-axis Manual Micromanipulator World Precision Instruments M325 equipment for highly controlled orthotopic injection
Magnetic Stand for Micromanipulator World Precision Instruments M10 equipment for highly controlled orthotopic injection
Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand World Precision Instruments 5479 equipment for highly controlled orthotopic injection
Hot Plate 062 Labotect 13854
Isis - Hair shaver AESCULAP - Braun -
Binocular Surgical Microscope Parkland Scientific VS-2Z
Name Company Catalog Number Comments
CTC isolation
EDTA Roth 8040.1
Density gradient medium – Ficoll StemCell - Lymphoprep 7801
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 BioLegend 324210
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 BioLegend 118210
Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent Greiner bio-one 628102
Fluorescence Cell Culture Microscope Leica
Transferman 4r Micromanipulator Eppendorf
CellTram Air Eppendorf aspiration pump connected to the micromanipulator
Dmz Universal Microelectrode Puller Dagan Corporation required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration
Prism Glass Capillaries Dagan Corporation
PAP pen Abcam ab2601
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Life Technologies GmbH 14190169 picking buffer
Fetal Calf Serum (FCS) BIOCHROM AG S 0115 picking buffer
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) Life Technologies GmbH 15140122 picking buffer
EDTA Roth 8040.1 picking buffer
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemistry
Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 BioLegend 324201 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)
HRP rabbit anti-mouse IgG Abcam ab97046 EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66, (1), 7-30 (2016).
  2. Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365, (9454), 153-165 (2005).
  3. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1, (5), (2014).
  4. Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397, (4), 535-542 (2012).
  5. Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20, (30), 10296-10304 (2014).
  6. Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112, (8), 1306-1313 (2015).
  7. Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19, (7), 2195-2202 (2012).
  8. Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again? Ann Surg. 263, (2), 345-352 (2016).
  9. Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138, (5), 1714-1726 (2010).
  10. Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74, (6), 1694-1704 (2014).
  11. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5, (9), 741-754 (2006).
  12. Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33, (8), 449-455 (2012).
  13. Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6, (7), 4663-4676 (2015).
  14. Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4, (11), e1042201 (2015).
  15. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7, (19), 27232-27242 (2016).
  16. Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6, (7), 497-499 (2016).
  17. van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74, (20), 5690-5699 (2014).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, (5), 1762-1772 (2011).
  19. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, (1-2), 324-338 (2015).
  20. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159, (1), 176-187 (2014).
  21. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100, (9), 3175-3182 (2002).
  22. Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14, (7), R82 (2013).
  23. Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484 (2007).
  25. Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347, (2), 204-211 (2014).
  26. Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19, (10), 2688-2698 (2013).
  27. Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7, (351), ra107 (2014).
  28. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107, (4), 1565-1570 (2010).
  29. Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61, (4), 1069-1079 (2016).
  30. Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8, (8), 1095-1104 (2010).
  31. Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113, (42), 11859-11864 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics