Ved hjælp af ekstraordinære optisk Transmission at kvantificere hjerte biomarkører i humant Serum

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dette arbejde beskriver en nanoimprinting litografi metode til at fremstille høj kvalitet sensing arrays, der virker på princippet om ekstraordinær optisk transmission. Biosensor er lave omkostninger, robust, nem at bruge, og kan afsløre hjertets troponin I serum ved klinisk relevante koncentrationer (99th percentil cutoff ∼10-400 pg/mL, afhængigt af analysen).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Patra, A., Ding, T., Hong, M., Richards, A. M., Wong, T. I., Zhou, X., Drum, C. L. Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum. J. Vis. Exp. (130), e55597, doi:10.3791/55597 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

For en biosensing platform at have klinisk relevans i punkt af pleje (POC) indstillinger, er assay følsomhed og reproducerbarhed evne til pålideligt overvåge analysander på baggrund af humant serum afgørende.

Nanoimprinting litografi (nul) blev brugt til at fabrikere, til en lav pris, sansning områder så stor som 1,5 mm x 1,5 mm. Sensing overfladen var lavet af high-fidelity arrays af nanoholes, hver med et areal på omkring 140 nm2. Den store reproducerbarhed af NIL gjort det muligt at ansætte en one-chip, one-måling strategi på 12 individuelt fremstillede overflader, med minimal chip til chip variation. Disse nanoimprinted lokaliseret overflade plasmon resonans (LSPR) chips blev grundigt testet på deres evne til pålideligt måle en bioanalyte ved koncentrationer varierende fra 2,5 til 75 ng/mL midt på baggrund af en kompleks biofluid-i dette tilfælde, human serum. High fidelity af NIL muliggør den generation af store sensing områder, der til gengæld eliminerer behovet for et mikroskop, som denne biosensor kan nemt interface med et almindeligt tilgængelige laboratorium lyskilde. Disse biosensorer kan afsløre hjertets troponin i serum med en høj følsomhed i et limit detektionsgrænsen (LOD) 0,55 ng/ml, som er klinisk relevant. De viser også lav chip til chip varians (på grund af den høje kvalitet af fabrikationsproces). Resultaterne er commensurable med udbredte enzymmaerket assay (ELISA)-baseret assays, men teknikken bevarer fordelene ved en LSPR-baseret sensing platform (dvs. imødekommenhed miniaturisering og multiplexing, hvilket gør det mere realistisk for POC programmer).

Introduction

Kemiske sensorer baseret på nanohole arrays har været genstand for talrige undersøgelser, siden den første rapport om ekstraordinære optisk transmission (EOT) blev udgivet af Ebbesen et al. i 19981. Når lys indvirker på periodiske arrays af nanohole strukturer af sub bølgelængde dimensioner, forekommer forbedret transmission ved bestemte bølgelængder. Dette opstår, når indfaldende lys par med Bloch-bølge overflade polariton (BW-SPP) og/eller lokaliseret overflade plasmons (LSP)2.

Den underliggende fysiske princip udnyttes når biosensing med sådanne periodiske arrays er enkel. Adsorption af molekyler på eller i nærheden af grænsefladen af metal ændrer dielektricitetskonstant medium i kontakt med metallet, igen ved at flytte placeringen af transmission bands i spektret. Spektret, selv kan justeres ved nano-teknik form, størrelse og adskillelse afstand3,4,5. Af design har sensorer baseret på EOT karakteristiske bands i deres spektre, der fremmer bestemte tildelinger6,7,8 under undersøgelsen af molekylære bindende begivenheder. Dette er en afgørende fordel i forhold til kommercielt tilgængelige overflade plasmon resonans (SPR) platforme.

Sensorer med EOT typisk indebærer en lyskilde optisk justeret således, at en kollimeres stråle er hændelse på sensing overfladen. Teknikker til at generere store nanohole overflader, såsom Co-polymer skabeloner og interferens og nanosphere litografi, har dårlig reproducerbarhed9. På grund af disse begrænsninger i præcist opdigte store flader, der viser fænomenet EOT, var et optisk mikroskop forpligtet til korrekt position lyskilden og detektor. For at forenkle teknik, høj kvalitet nanoimprinting litografi (nul)10 var ansat. Indeværende sat i stand til produktion af store sensor overfladearealer11 (mm-skala), fjerne behovet for et mikroskop for at lede efter sensing overfladen på en chip. I stedet, kunne denne sensor let interface med en standard fiberoptiske kabler.

Da transmission toppene for denne nanohole array er indeholdt i den synlige til nær-infrarøde område (NIR), er det perfekt egnet til sensing bindende begivenheder for biomolekyler i et vandigt miljø. Den forventede optisk opførsel af matrixen nanohole blev simuleret. Resultatet blev så bekræftet gennem undersøgelser med væsker af standard refraktive indeks (RI). Dette array blev derefter brugt til at måle koncentrationen af cardiac troponin jeg (cTnI) i den komplekse baggrund af humant serum. cTnI er den kliniske guldstandarden til diagnosticering af akut myokardieinfarkt.

Brug af denne sensor, er det muligt at påvise og bestemme cTnI i humant serum på en grænse detektionsgrænsen (LOD) 0,55 ng/ml, som er klinisk relevant. Detektion er meget hurtigere end mest almindeligt anvendte teknologi i dette domæne, enzymmaerket assay (ELISA). Derudover sensing overfladen kan nemt kan regenereres og derfor genbruges. Dette arbejde viser dermed løftet om nanohole arrays som en levedygtig punkt af pleje (POC) teknologi til biosensing inden for komplekse biofluids.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fabrikation af Sensor og erhvervelse af Data

  1. Forberedelse af nikkel skimmel
    1. Coat en 220 nm tykke lag af negative elektronstråle modstå på en 600 µm tykt 4-i silicon wafer. Skrive designet nanohole array på denne plade, ved hjælp af en elektron beam litografi system.
      1. For at fremskynde den e-beam skrive, skrive mønstre med en lav dotmap (N) af 20k til hver 300 µm Feltstørrelse (A) (dvs. der er 0,4 mia prikker kortlagt på hver 300 µm2 område, og hver prik vil enten blive udsat af e-beam eller ikke afhængig af mønster designet). Angiv e-beam modstå eksponering dosis for at modstå til 110 Μchiler cm−2 og skrive på en strøm (I) på 800 pA.
        Bemærk: E-beam skriftligt eksponering dosis (D) er kontrolleret af eksponeringstid for hver prik (Tdot), beregnet ved Equation 1 . For eksponering dosis på 110 Μchiler cm−2er e-beam bolig tid på hvert udsatte dot 0,5 µs12. Da array optager et areal på 1,8 mm2, er der i alt 36 pletter af 300 µm2 felt områder syet sammen til form et stort, guld nanohole array.
    2. Udvikle modstå ved at nedsænke 4 tommer silicium wafer i developer løsning for 10 s og lade wafer tørre i luften.
    3. Indbetale et frø lag af en metaller, såsom nikkel, kobber eller aluminium, på silicium wafer.
    4. Elektroplade wafer i en plating system i en nikkel sulfamate bad. Udføre galvanisering i to trin. I det første trin, varig 95 min, bruge en strømtæthed på 0,7 A dm−2; det fylder helt nanopatterns med nikkel. I andet trin af varig 125 min, bruge 12 dm ved−2 for at nå 300 µm som endelige nikkel skimmel tykkelse (20 nm). Sikre at pH-værdien er på 3,5-3,8 og at temperaturen er på 52-54 ° C.
    5. Adskille nikkel mug fra silicon underlaget ved at anvende blid mekanisk kraft. Sættetid nikkel mug i ca. 100 mL af positive photoresist fjernelse reagens natten til at vaske væk rester fra e-beam modstå.
    6. Feed nikkel mug i ovn og tør det ved 100 ° C i 3 h. rense det i en plasma ætsning system med O2 gas på 10 sccm og 100 W i 3 min.
  2. Fabrikation af den guld nanostrukturer
    1. Coat 150 µL af heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl trichlorosilane (FDTS) på nikkel mug i et samlesæt éncellelag (SAM) belægning maskine ved 80 ° C.
      Bemærk: Dette vil danne en anti-klæbende lag, hvorved adskillelse af mug fra photoresist ("demolding") efter afslutningen af nanoimprinting trin. Den fordampning tid bør være 180 s og reaktionstiden bør være 900 s.
    2. Kolofon nanopatterns på en 4 - i glas plade, der er blevet belagt med en 300 nm tykke lag af foto-helbredes NIL modsætter sig at bruge en nano-imprinter ved et tryk på 10 bar og en temperatur på 40 ° C i 10 min.
    3. Overføre mold, photoresist og glas wafer at en UV-lys hærdende system og photocure med 75 mW cm-2 UV eksponering for 30 s.
      Bemærk: Hvis alle trin er blevet fulgt korrekt, nikkel skimmel burde nemt være demolded fra photoresist.
    4. I en reaktiv ion ætsning (RIE) system, udføre en tom etch af photoresist på glas substrat, med en O2 gasflow af 10 sccm, på 50 W for 2 s at eksponere glas på områderne indrykket.
    5. Indbetale et 5 nm tykke lag af chrom (Cr) for metal vedhæftning og en 100-nm lag guld (Au) for den plasmonic sensor på glas wafer i en elektronstråle deposition maskine. Bruge en aflejring på 1 Å s1 for Cr og 2 Å s1 for Au.
    6. Udføre lift-off af photoresist af O2 plasma ætsning i 3 min. efterfulgt af et 15-s sonification skridt i acetone.
    7. Terning prøven i 5 mm × 5 mm chips. Matrixen nanohole vil besætte den centrale 2 mm × 2 mm af chippen.
  3. Erhvervelse af data
    1. Indstille apparatet til at gøre de optiske målinger, således at en lysstråle af hvidt lys spændende gennem slutningen af senderen optisk fiber er kollimeret og er hændelse på sensoren overfladen (nanohole array) på 90°.
      Bemærk: Lys overføres gennem hele nanohole array.
    2. Samle det transmitterede signal med modtager optisk fiber og registrere det med en UV-synlige spektrometer opererer inden for rækkevidde af 300 til 1.000 nm.
    3. Indstil erhvervelse tid for hver ramme til 20 ms. gennemsnitlig 100 billeder til at opnå den endelige spektrum for at sænke støj i målingerne.
    4. Bruge plotting software til at analysere de data baseret på de tidligere identificerede transmission toppe (ved hjælp af et Lorentz-baserede metode).

2. sensor Bulk følsomhed Test

  1. Deponere den standard RI væske ind i flydende cellen, med RI varierende fra 1,31 til 1,39.
  2. Fordyb sensor-chip i den standard RI væske og justere det med stråle af hvidt lys. Få transmission frekvenser.
  3. Ren sensor-chip efter hver måling med en overfladeaktive rengøring reagens og tør det med nitrogen gas.

3. sensoren overfladen ændring

  1. Forud for eventuelle kemiske ændringer, ren sensor chips ved sekventiel nedsænkning i isopropanol, acetone og deioniseret vand. Tørt ved stuetemperatur i en strøm af tør nitrogen gas.
  2. Inkuber sensor chips i en ethanoliske løsning af 0,4 mM 10-carboxy-1-decanethiol og 1,6 mM 1-octanethiol i 12 timer ved stuetemperatur.
    Bemærk:, Dette vil udgøre en Amin-reaktiv samlesæt éncellelag (SAM).
  3. Bruge ethanol skylles grundigt og tørre ved stuetemperatur.
  4. Gøre en blanding af 75 mM sulfo-N-hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) og 15 mM 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Fordyb chips i denne blanding i 15 min.
    Bemærk: Dette vil aktivere den carboxylic gruppe af SAM.
  5. Spot 50 µL af 200 µg/mL anti-troponin antistof løsning i en pH 4.5 acetat buffer på sensoren overfladen og Inkuber i 30 min.
  6. Deaktivere de ureageret estere af nedsænkning sensor-chip i 1 M ethanolamin-HCl løsning for 15 min.
  7. Skyl chip med deioniseret vand og tørres i en strøm af tør nitrogen gas ved stuetemperatur.

4. cTnI analyse

  1. Blokere enhver ikke-specifik binding ved spotting 100 µL af 1% bovint serumalbumin (BSA) løsning på overfladen.
Inkuber i 15 min.
  • Skyl sensor chips tre gange i fosfatbufferet saltopløsning til (PBS). Sæt chippen i cellen måling at optage transmission frekvenser.
    Bemærk: Dette er referencespektret.
  • Spot 50 µL af cTnI standard overfladen, chip og Inkuber i et fugtigt miljø i 30 min.
  • Skyl sensor chips tre gange i PBS løsning og indsætte det i cellen måling at optage transmission frekvenser.
    Bemærk: Dette er det efter bindende spektrum.
  • Dykke chips i 50 mM glycin-HCl (pH 2) for 1 min og derefter skylles i PBS løsning tre gange for at regenerere chip overflade. Måle transmission frekvenser i PBS til at kontrollere succes af trinnet regenerering.
  • 5. overflade Plasmon resonans (SPR) måling

    1. Køre multipleksede SPR sensor chip på SPR systemet med PBS-T buffer.
      Bemærk: Sammensætningen af PBS-T buffer er 20 mM Na-fosfat, 150 mM NaCl og 0,05% Tween 20. PH er 7,4.
    2. Brug cTnI standard og antistof, som beskrevet i trin 4.
    3. Aktivere 3 ud af de 6 kanaler med en blanding af EDC (0,2 M) og sulfo-NHS (0,05 M) i 5 min. udføre en 5 min injektion af 50 µg/mL antistof 560 og en 5-min injektion af 1 M ethanolamin-HCl løsning.
    4. Rotere sensor-chip ved 90° og injicere cTnI standarder i forskellige koncentrationer (75, 30, 7,5 og 2,5 ng/mL).
    5. Observere konjugation til antistof på steder af interaktion på chip i realtid via SPR udlæsning.
    6. Regenerere chippen ved at indsprøjte 50 mM glycin-HCl (pH 2) for 1 min.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Den optiske setup for måltagning er vist i figur 1A. Et billede af den faktiske nanohole matrix er givet i figur 1B. For at forstå fysik kørsel sensing processen, blev COMSOL simulation software brugt til at simulere fordelingen af feltet plasmonic i et vandigt miljø. Resultater fra simuleringen blev derefter relateret til de faktiske målinger. En tidligere offentliggjort undersøgelse indeholder detaljer om de antagelser og parametre, der bruges i simuleringen11,13. De fysiske dimensioner, der anvendes til simulering feltet plasmonic for matrixen nanohole var som følger: p = 400 nm, D = 150 nm, og T = 100 nm. Absorption og spredning effekter er også tages i konto14 ved beregning af transmission frekvenser. Den simulerede spektrum er i forhold til den eksperimentelt målte frekvenser i figur 1 c. Både den simulerede og de målte spektre viderebringe eksistensen af fire bands fra 450 til 850 nm. Bandet på 495 nm svarer til den interband overgang af guld. De tre efterfølgende bands, fremover kaldet bands I-III i stigende rækkefølge for bølgelængde, er placeret på 560 nm, 645 nm og 712 nm, henholdsvis. Bands I-III blev observeret for at have acceptabel tilpasning til de eksperimentelt målte bands, beliggende på 558 nm, 638 nm og 724 nm. Som de fabrikerede nanoholes er næsten cirkulær i form, bør disse bands ikke være følsomme over for polarisering af indfaldende lys. Derudover kan COMSOL simulation direkte visualisering af nær felt fordelingen af disse bands som de ville forekomme i en enhed celle i den periodiske struktur (fig. 1 d). Enhed på farvelinjen er optisk felt distribution (V/m) udtrykt i en log skala. Den højeste intensitet observeret var omkring 4.7 (50,119 V/m). I forhold til intensiteten af forekomsten bruges i simuleringen (4,340 V/m), repræsenterer denne størrelsesorden et 11.5-fold felt ekstraudstyr. Elektromagnetiske felter for bands I og III blev lokaliseret på overfladen af glas substrat. Derimod band II var overvejende lokaliseret på den øverste kant af nanohole og blev valgt til påvisning af bioanalyte. Figur 1E illustrerer transmission spektre af matrixen nanohole i væsker af kendte refraktive indeks, som varierede fra 1,31 til 1,39. Tre transmission bands, svarende til bands I, II og III, blev observeret i rækken spektrum af 400-900 nm. En rød Skift blev observeret med en ændring i RI. Omfanget af skiftet fulgt rækkefølgen band II > band jeg > band III. Figur 1F er en konsolidering af den observerede røde forskydninger af bands I, II og III. Bulk følsomhed beregnet for band jeg var 322 nm/RIU, for bandet II var 345 nm/RIU og for bandet II var 202 nm/RIU.

    Figur 2A indeholder skematisk af fænomenet sensing i aktion. Figur 2B viser ændringen i transmission spectra efter cardiac troponin molekyler binder til functionalized chip overflade. Ved lave koncentrationer er der en lineær skift i bandet med troponin niveau. Skift i positionen band kan monteres godt til en bindende isoterm Rasmussen2 værdi af 0.995. Ved nærmere observation synes 30 ng/mL at være den koncentration, hvor isoterm angiver starten af mætning (figur 2 c).

    Figur 3A viser sensorgram fra samspillet mellem serum med chip overfladen af en modificeret GLC chip i en opsætning af XPR36. Erobringen af cTnI er vist af stigningen i signalet. Derefter kan dissociation af cTnI i en PBST medium (1 x PBS, 0,05% tween 20) iagttages, da signalet falder fra 120-660 s. Injecting glycin (regenerering løsning) for 1 min reduceret signalet til 0, der angiver regenerering af sensing overfladen gennem den fuldstændige tilbagetrækning af cTnI. Sensorgram for den efterfølgende sammenslutning af cTnI folier chip overflade er vist i indsatsen figur3a. Den samme protokol (dvs. nedsænkning i glycin løsning til 1 min) blev brugt til at regenerere nanohole array overflade. Figur 3B viser, at placeringen af bandet 2 skifter tilbage til sin oprindelige position, hvilket bekræfter succes af trinnet regenerering.

    Figure 1
    Figur 1 : Karakterisering af matrixen nanohole. (A) forenklet skematisk af opsætningen af eksperimenterende. (B) Scanning elektron mikroskop billede af matrixen nanohole. (C) Sammenligningen mellem den simulerede spektrum og eksperimentelt målte transmission frekvenser i et vandigt miljø. (D) i nærheden af feltet distribution som simuleret i COMSOL bands I og III, set i en tværsnitsundersøgelse se. Rød repræsenterer stærkere nær felt distribution. Den enhed, der er vist i farvebjælken er | E |, fordelingen af det optiske område, taget i log skala. (E) måles eksperimentelt transmission spektre af matrixen nanohole i miljøer med standard brydningsindeks væsker (1,31 til 1.39). (F) Bulk følsomheder af tre transmission bands (I-III) ændringer i RI målt i den synlige at NIR rækkevidde. Sorte firkant: band jeg, rød cirkel: band II, blå trekant: band III. Tallet er blevet ændret fra Ding et al. 14 under en CC af licens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 2
    Figur 2 : Nanohole array bruges som en biosensor. (A) skematisk af nanohole array bruges som en biosensor til påvisning af cTnI. (B) ændring i transmission spektrum af biosensor ved interagere med menneskelige cTnI på en 30 ng/mL koncentration i en baggrund af serum. Blå: før interaktion, rød: efter interaktion. Den stiplede cirkel viser bandet spores. (C) Skift i bølgelængde for bandet II ved forskellige koncentrationer af troponin (2.5 ng/mL, 7,5 ng/mL, 30 ng/mL og 75 ng/mL).Fejllinjer Vis standardafvigelse blandt n = 3 chips anvendes for hver måling. Tallet er blevet ændret fra Ding et al. 14 under en CC af licens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 3
    Figur 3 : Regenerering af sensoren overfladen. (A) en SPR sensorgram fra XPR36 viser injektion af analysanden (cTnI) efterfulgt af injektion af glycin til at regenerere sensoren overfladen. Efterfølgende påvisning målinger af forskellige koncentrationer af cTnI baggrund serum er vist i indsatsen. Den røde bar repræsenterer den oprindelige værdi, mens den sorte bjælke viser målingen efter regenerering af overfladen med protokollen beskrevet i teksten. (B) Skift i bandet bølgelængder observeret efter regenerering af en nanohole biosensor chip. Σ: standardafvigelsen af forskydninger i bølgelængden af bandet holdning. Tallet er blevet ændret fra Ding et al. 14 under en CC af licens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Simulering af samspillet mellem indfaldende lys og nanostrukturer gør det muligt at identificere passende peak (i transmission frekvenser), hvis Skift kan blive registreret som funktion af koncentrationen af analysanden. Det er vigtigt at bemærke, at lokaliseringen af bandene med hensyn til strukturen af sensoren er afgørende for valget af den rigtige band, hvis Skift kan spores til at fornemme analysanden. Visualiseringen opnås via simuleringer. Det er også afgørende for udformningen af en optimal struktur, der muliggør biosensing af analysander. Som det ses her, bands I og III er lokaliseret på grænsefladen glas-guld og dermed er ikke nyttige for biosensing. En fremtrædende LSPR komponent kan observeres i bandet II. Det viser en kort henfald længde og er lokaliseret på kanten af nanoholes. Som sådan, egner dette sig godt til at blive anvendt til sensing analysand koncentrationer. Kvaliteten af de fabrikerede nanostrukturer over hele rækken er også afgørende for kvaliteten af spektre indsamlet. Non-uniform strukturer vil indføre artefakter.

    Spredning og uundgåelige absorption skabe artefakter i en vandig måling. Samlede signal til støj-forhold er også foruroliget over tilstedeværelsen af den vandigt medium. Hvis der er flere egnet bands hvis forskydninger kan overvåges for biosensing, skal følgende punkter overvejes. På sub 600 nm bølgelængde påvirkes observerede transmission spektrum markant af protein absorption og partikel spredning. På den anden side ved hjælp af bølgelængder større end 900 nm kan skabe forvirring ved skjuler de vigtige underliggende signaler stammer fra bindende begivenheder, som i denne region, absorption af vand øger med bølgelængde. For sensing analysander i et vandigt miljø, derfor er band II optimalt placeret i forhold til bølgelængde. En lille afvigelse i måling af bandet holdning kunne observeres. Dette er forårsaget af den store sensor størrelse. Mens den store sensor i sidste ende udmønter sig i kortere erhvervelse gange fordi hver af påvisning pixels nu se et større end sædvanligt flux af fotoner, påvirker det også negativt støj. Hvis samlingen signal ikke er udført korrekt og data conditioning ikke optimalt designet, ses i virkeligheden, en masse støj. Fra et gennemsnit af indsamlede signal over 100 frames15, støjniveauet kan sænkes. Mens der er andre måder at producere LSPR signaler, især fra gold nanopartikler16, er nanohole array meget mere realistisk at gennemføre i en transportabel format med mikrofluidik. Hele enheden kan bruges til POC applikationer på grund af lethed af automatisering af hele processen og mulighed for at regenerere sensing overfladen.

    Denne eksperimentel protokol er udviklet til at minimere eksperimentelle fejl ved hjælp af transmission tilstand i stedet for reflektionsgrad. Dette skærer muligt artefakter fra vinkel af forekomsten ændringer. Det er også vigtigt at påpege, hvilke kritiske trin 3.4, når antistoffet er crosslinked til sensoren overfladen. Det er vigtigt at bevare reaktiviteten af både sulfo-NHS og EDC. Det konstateredes også, at skifte fra NHS til sulfo-NHS var afgørende for forbedret stabilitet. Hvis prøverne skal genbruges, anbefales opbevaring under flydende nitrogen. Den platformteknologi, der er vist her kan bruges til at overvåge andre kliniske biomarkører, med passende overflade modifikation.

    Hidtil, er penetration af LSPR sensorer blevet begrænset af begrænsninger på muligheden for at oprette lydhør overflader over store områder med en reproducerbarhed svarer til halvlederindustrien. Store sensing overflader kan nemt interface med standard og omkostningseffektiv optik. Præcision i fabrikationsproces ville også mindske chip til chip varians, en kritisk flaskehals i at forbedre pålideligheden af målinger, som er kritiske i kliniske omgivelser. I forbindelse med medicinsk udstyr, hvor serielle målinger er påkrævet, er reproducerbarhed af overflade regenerering også afgørende. Det er også blevet påvist, at den optimale protokol for regenererende sensing overfladen kan etableret i et kommercielt tilgængelige SPR platform og derefter korrekt oversat til nanohole-array. Effektiviteten af regenerering kan nemt beregnes til nanohole-array, og egnetheden af regenereret overflade for gentagne målinger kan vurderes. Ved oprettelse af robust overfladekemi ændring og regenerering protokoller, kan LSPR sensorer være en følsom og enkle platform for real-time bioanalyte opdagelse. Det er nemt at forudse dens betydelig indvirkning på patientbehandlingen. Det er værd at bemærke, at den absolutte følsomheden af sensoren ikke kan matche de mest avancerede ELISA-baseret test. Nogle forstærkning strategierne skal være designet til at øge følsomheden. Selv i sin nuværende form, denne teknologi udgør en betydelig forbedring i forhold til etablerede nanoimprinted LSPR protokoller, som definerer en nye lavere grænse for etiket-fri påvisning af en hjerte-kar-biomarkør ved hjælp af en transmission-baserede optiske setup. Teknologien udvikler sig hen imod gennemførelsen af real-time overvågning af flere klinisk vigtige biomarkører. Yderligere forbedringer i dataopsamling (fx detektorer med bedre opløsning) og efterfølgende signalbehandling kunne hjælpe LSPR-baserede sensorer opnå dette.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.

    Acknowledgments

    AP anerkender støtte fra Prof T Venkatesan, direktør, NUS nanovidenskab og nanoteknologi initiativ og Office af vicepræsident (National University of Singapore) (R-398-000-084-646). CLD anerkender støtte af den Singapore Ministeriet for sundhed nationale Medical Research Council under sin kliniker videnskabsmand finansieringsordning, NMRC/CSA/035/2012-National University of Singapore. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Electron Beam Lithography setup Elionix ELS 700
    o-Xylene Sigma Aldrich 95662
    EB resist Sumitomo NEB-22A2
    Developer reagent Shipley Company Microposit MF 321
    Electroplating machine Technotrans AG RD 50
    Photoresist stripper  Rohm and Haas Electronic Materials LLC Microposit Remover 1165
    Etching System Trion Phantom
    Heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl)trichlorosilane  Gelest (PA, USA) 78560-44-8
    SAM coater  Sorona Inc. AVC 150M
    Photo-curable NIL resist micro resist technology GmbH mr-UVCur21-300nm
    Light Curing System Dymax  Model 2000 Flood
    E-beam deposition machine Denton Explorer
    UV-visible spectrometer  Ocean optic HR2000+ (Dunedin, FL, USA)
    Standard refractive index liquids  Cargill Inc (Cedar Grove, USA) 18032
    Plotting software Origin Origin Pro 9
    10-carboxy-1-decanethiol  Dojindo Laboratories (Japan) C385-10
    1-octanethiol  Sigma-Aldrich, MO, USA 471386
    Sulfo-N-hydroxysuccinimide and 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide  BioRad (CA, USA) 1762410
    Anti-troponin antibody 560 Hytest (Finland) 4T21
    Ethanolamine-HCl solution BioRad (CA, USA) 1762450
    Surface Plasmon Resonance setup BioRad XPR36 (Haifa, Israel)
    Multiplexed SPR chip BioRad GLC
    Human cTnI standard Phoenix Pharmaceuticals EK -311-05
    Glycine-HCl BioRad (CA, USA) 1762221

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Ebbesen, T. W., Lezec, H. J., Ghaemi, H., Thio, T., Wolff, P. Extraordinary optical transmission through sub-wavelength hole arrays. Nature. 391, (6668), 667-669 (1998).
    2. Krishnan, A., et al. Evanescently coupled resonance in surface plasmon enhanced transmission. Optics Comm. 200, (1), 1-7 (2001).
    3. Yang, J. -C., et al. Enhanced optical transmission mediated by localized plasmons in anisotropic, three-dimensional nanohole arrays. Nano letters. 10, (8), 3173-3178 (2010).
    4. Kim, J. H., Moyer, P. J. Transmission characteristics of metallic equilateral triangular nanohole arrays. Appl Phys Lett. 89, (12), 121106 (2006).
    5. Liu, H., Lalanne, P. Microscopic theory of the extraordinary optical transmission. Nature. 452, (7188), 728-731 (2008).
    6. Shon, Y. -S., Choi, H. Y., Guerrero, M. S., Kwon, C. Preparation of nanostructured film arrays for transmission localized surface plasmon sensing. Plasmonics. 4, (2), 95-105 (2009).
    7. Xiang, G., Zhang, N., Zhou, X. Localized surface plasmon resonance biosensing with large area of gold nanoholes fabricated by nanosphere lithography. Nanoscale Res Lett. 5, (5), 818 (2010).
    8. Valsecchi, C., Brolo, A. G. Periodic metallic nanostructures as plasmonic chemical sensors. Langmuir. 29, (19), 5638-5649 (2013).
    9. Gates, B. D., et al. New approaches to nanofabrication: molding, printing, and other techniques. Chem Rev. 105, (4), 1171-1196 (2005).
    10. Guo, L. J. Nanoimprint lithography: methods and material requirements. Adv Mater. 19, (4), 495-513 (2007).
    11. Wong, T. I., et al. High throughput and high yield nanofabrication of precisely designed gold nanohole arrays for fluorescence enhanced detection of biomarkers. Lab on a Chip. 13, (12), 2405-2413 (2013).
    12. Deng, J., Wong, T. I., Sun, L. L., Quan, C., Zhou, X. Acceleration of e-beam lithography by minimized resist exposure for large scale nanofabrication. Microelect Eng. 166, 31-38 (2016).
    13. Wu, L., Bai, P., Li, E. P. Designing surface plasmon resonance of subwavelength hole arrays by studying absorption. JOSA B. 29, (4), 521-528 (2012).
    14. Ding, T., et al. Quantification of a cardiac biomarker in human serum using extraordinary optical transmission (EOT). PloS one. 10, (3), 0120974 (2015).
    15. Im, H., Sutherland, J. N., Maynard, J. A., Oh, S. -H. Nanohole-based surface plasmon resonance instruments with improved spectral resolution quantify a broad range of antibody-ligand binding kinetics. Anal Chem. 84, (4), 1941-1947 (2012).
    16. Bhagawati, M., You, C., Piehler, J. Quantitative real-time imaging of protein-protein interactions by LSPR detection with micropatterned gold nanoparticles. Anal Chem. 85, (20), 9564-9571 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics