Metoder for klassifisering av cytoplasmisk foci som mammalstresskorn

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Stress Granuler (SG) er ikke-membraniske cytoplasmatiske strukturer som dannes i celler utsatt for en rekke spenninger. SG inneholder mRNAer, RNA-bindende proteiner, små ribosomale underenheter, translationsrelaterte faktorer og forskjellige cellesignalproteiner. Denne protokollen beskriver en arbeidsflyt som bruker flere eksperimentelle tilnærminger for å oppdage, karakterisere og kvantifisere bona fide SG-er.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Aulas, A., Fay, M. M., Szaflarski, W., Kedersha, N., Anderson, P., Ivanov, P. Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules. J. Vis. Exp. (123), e55656, doi:10.3791/55656 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cellene utfordres ofte av plutselige miljøforandringer. Stresskorn (SG), cytoplasmatiske ribonukleoproteinkomplekser som dannes i celler utsatt for stressforhold, er involvert i ulike aspekter ved cellemetabolisme og overlevelse. SG'er modulerer cellulære signalveier, post-transkripsjonelle genuttrykk og stressresponsprogrammer. Dannelsen av disse mRNA-holdige granulatene er direkte forbundet med cellulær oversettelse. SG-samling utløses av inhibert oversettelse-initiering, og SG-demontering fremmes ved translasjonsaktivering eller ved inhibert translationsforlenging. Dette forholdet blir ytterligere fremhevet av SG-sammensetningen. Core SG-komponenter er stalled-pre-initieringskomplekser, mRNA, og utvalgte RNA-bindende proteiner (RBPs). Formålet med SG-samlingen er å bevare cellulær energi ved å sekvestrere translasjonelt stalled housekeeping mRNAs, slik at den forbedrede translasjonen av stress-responsive proteiner blir mulig. I tilleggPå kjernebestanddelene, som for eksempel stalled translation preinitiation komplekser, inneholder SGer en mengde andre proteiner og signalmolekyler. Defekter i SG-formasjon kan forringe cellulær tilpasning til stress og kan dermed fremme celledød. SG og lignende RNA-holdige granulater har vært knyttet til en rekke humane sykdommer, inkludert nevrodegenerative forstyrrelser og kreft, som fører til den siste interessen for å klassifisere og definere RNA-granulertubtyper. Denne protokollen beskriver analyser for å karakterisere og kvantifisere pattedyr SG.

Introduction

Cellene bruker mange mekanismer for å reagere på stress. Noen responser forekommer på post-transkripsjonsnivå og involverer regulering av mRNA-oversettelse og / eller stabilitet 1 , 2 . Stressmodulert mRNA-translasjonsarrest og nedbrytning er assosiert med dannelsen av spesifikke ikke-membrancellulære foci, den mest vel karakteriserte er Stress Granules (SGs) 3 . SG er cytoplasmatiske foci som konsentrerer ikke-translaterende mRNP i translasjonelt-arresterte celler som reagerer på stress ( f.eks. Oksidasjon, varmestokk, næringsstimulering og virusinfeksjon) 4 . I tillegg til ikke-translaterende mRNAer inneholder SGer translationsinitieringsfaktorer, RNA-bindende proteiner og forskjellige signalproteiner 5 . SG er biomarkører av inhibert proteinoversettelse og endret RNA-metabolisme og har vært knyttet til celleoverlevelse og apoptose, signalveiS og kjernekraftprosesser 5 .

SG er dynamiske enheter, og deres formasjon er tett knyttet til statusen for mobil oversettelse 6 . Til tross for deres tilsynelatende solide utseende, flytter de fleste SG-proteinkomponenter raskt inn og ut, med en oppholdstid på sekunder. Mens SGs vedvarer i minutter til timer, er de fleste av komponentene i rask flux. Inhiberingen av translationsinitiering og den resulterende demontering av translatoriske polysomer fremmer dannelsen av SG'er; Således er SG i likevekt med å oversette polysomer. Denne polysom ​​/ SG-likevekten er nøkkelen til å skille mellom bona fide SG'er fra andre stress-inducerte foci 6 , 7 .

Å arrestere oversettelsesinitiering innebærer konvertering av oversettelseskompetente pre-initieringskomplekser som inneholder mRNA, translasjonsinitieringsfaktorer (eIF) og 40S ribosomale underenheter (s O-kalt 48S-komplekser) til translasjonelt stallede komplekser (såkalte 48S * komplekser) som kan samle seg inn i SG 4 , 6 . SG'er fremmes ved translasjonsarrest ved to forskjellige trinn oppstrøms for 48S kompleks dannelse: interferens med funksjonene til det cap-bindende eIF4F-komplekset ( f.eks. Målrettet mot eIF4A-underenheten) eller fosforylering av a-underenheten av translationsinitieringsfaktor eIF2, formidlet av en Eller flere av de fire eIF2-kinaser. Tilstedeværelsen av stalled 48S-komplekser ( dvs. 40S ribosomale underenheter og utvalgte translationsinitieringsfaktorer) er et kjennetegn for SG 8 , 9 .

SG har vært knyttet til ulike patologiske tilstander, for eksempel virusinfeksjoner, neurodegenerasjon, autoimmunitet og kreft 3 , 10 , 11 ,Ss = "xref"> 12 , 13 . Muterte former av flere SG-komponenter er forbundet med nevrodegenerative sykdommer ( f.eks. Amyotrofisk lateralsklerose) der nevroner viser intracellulære patologiske inneslutninger som kan spille aktive roller i nevronedød 13 . Noen virus kapsler SG-komponenter for å hemme SG-dannelse og for å forsterke viral replikasjon 14 . Nylige studier kobler også SG til kreft 15 og til kreftcelleoverlevelse under kjemo- og strålebehandlinger 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Selv om slike funn har stimulert stor interesse for SG-biologi, mangler mange av de publiserte rapportene viktige kontroller for å skille dannelsen av bona fide SG fra andre stressfremkalte foci.

SG ble først beskrevet som ikke-membraniske cytoplasmatiske foci sammensatt av utvalgte mRNA-bindende proteiner (RBPs), inkludert T-celle ntracellulært antigen 1 (TIA-1) og Poly-A-bindingsprotein (PABP); Oversettelse initieringsfaktorer; Polyadenylert mRNA; Og små ribosomale underenheter 4 , 6 , 21 , 22 . Tradisjonelt har deres sammensetning blitt bestemt ved teknikker som immunfarging og det ektopiske uttrykket av fluorescens-merkede proteiner 23 , 24 . På grunn av sin svært dynamiske natur forblir immunokalokalisering av SG-proteiner og / eller mRNAer den definerende metodikken for å detektere SGs 23 , 24 . Til dags dato er mange RBP og andre proteiner (over 120 forskjellige proteiner) beskrevet som SG-komponenter 11 . Så mange SG-lokaliserte proteiner endrer lokaliseringen i både stressavhengig og uavhengig måte og kan akkumulere ved andre intracellulære rom og foci. Det er viktig å velge riktige SG markører og å benytte funksjonelle kriterier for å skille SG fra andre typer stressfremkalt foci. Bona fide SG inneholder mRNA, oversettelse initiasjonsfaktorer og små ribosomale underenheter og er i dynamisk likevekt med oversettelse.

Denne enkle arbeidsflyten er utformet for å avgjøre om stressinducerte foci er bona fide SG. Denne arbeidsflyten inkluderer flere eksperimentelle tilnærminger ved hjelp av U2OS-celler, celler som vanligvis brukes til å studere SG'er. Disse cellene er ideelle, da de har en stor cytoplasma, er relativt flate og festes sterkt til glassdeksler. Andre celletyper kan brukes til å studere SG, men det er viktig å være klar over at forskjeller i timing, legemiddelkonsentrasjon og overflod av SG-kjerneproteiner kan endre kinetikken og komposisjonensammensetningen. I tillegg reagerer noen celler på paraformaldehydfiksering ved å danne celleoverflater, og gir deretter et ruffled utseende som forårsaker punktat lokalisering av noen SG markører; Uten grundig analyse kan disse kategoriseres som SG-er. Dette understreker nødvendigheten av å vurdere alle kriteriene som kreves for å identifisere stressinducerte foci som bona fide SG. Vinorelbin (VRB), en kreftbehandling som fremmer SGS 20 , samt Sodium Arsenite (SA), en robust og velkarakterisert SG-induktor, brukes som stress for forsøkene i denne protokollen.

Canonical SG inneholder flere SG markører (både proteiner og mRNAer) som kolokaliseres i cytoplasmatiske foci. Denne protokollen bruker både immunofluorescens og fluorescens in situ- hybridisering (FISH) for å detektere lokalisering av proteinmarkører og polyadenylert mRNA 22 . Kort fortalt bruker indirekte immunofluorescens antistoffer ( dvs.e. Primære antistoffer) som er spesifikke for et gitt protein for å oppdage det i cellen. Deretter gjenkjenner sekundære antistoffer (vanligvis artsspesifikke) knyttet til fluorokrom det primære antistoffet og avslører målproteinlokaliseringen. Fluorescerende mikroskopi brukes til å detektere det lokaliserte signalet i cellen. Ved å bruke antistoffer produsert i forskjellige arter og detektere dem med forskjellige farget sekundære antistoffer, muliggjør deteksjon av kolokalisering av flere antistoffer, hvilket indikerer at deres proteinmål er funnet på samme sted 23 . Det er viktig å velge markører som er verifisert for å kolokalisere på bona fide SG.

FISH bruker en merket probe som baserer seg til en bestemt RNA- eller DNA-sekvens 25 . For å oppdage mRNA bruker denne protokollen en biotinylert oligo (dT) 40- probe som hybridiserer (eller basepar) til polyA-halen av mRNA ( dvs. polyA FISH). Den biotinylerte sonden blir så detektert ved bruk av fluorescenskonjugert streptavidin, da streptavidin har en høy affinitet for biotin. Ved vurdering av SG er det viktig å koble polyA FISH med immunfluorescens som oppdager en SG-markør, som i bona fide SG, skal de to signalene kolokalisere.

Ved hjelp av denne protokollen blir kolokalisering vurdert på flere måter. I et flerkanalsbilde ( dvs. RGB: rødt, grønt og blått) vil kolokalisering endre fargen på det overlappede signalet ( f.eks. Kolokalisert rød og grønn blir gul) 23 . I tillegg kvantifiseres kolokalisering grafisk ved hjelp av linjeskanningsanalyse, hvor intensiteten av hver av fargene måles over en gitt linje 8 , 20 . Denne protokollen beskriver to linjeskanneanalyseprosedyrer ved hjelp av ImageJ 26 . En prosedyre er manuell og går gjennom hele prosessen, hvemDen andre bruker en makro, eller et enkelt program som automatiserer de manuelle trinnene. Det er viktig å gå gjennom det manuelle programmet for å forstå makroprosedyren.

SG-skjemaer i celler der oversettelsen er undertrykt; Derfor skal celler med SG-enheter vise reduserte nivåer av global oversettelse sammenlignet med ubehandlede celler. Eksperimentelt brukes ribopuromycylering. Puromycin og emetin blir tilsatt til celler i en kort varighet før fiksering, slik at puromycinet innlemmes i aktivt dannende polypeptider og forårsaker avslutning 27 , 28 . Behandling med emetin er nødvendig for å forhindre re-initiering 29 . Puromycin kan da detekteres ved bruk av anti-puromycin-antistoff, noe som gir et øyeblikksbilde av aktiv oversettelse. Denne metoden brukes fordi den er rask, krever ikke for sulting med et medium som mangler en bestemt aminosyre (og potensielt forspenner cellene), og avslørerSubcellulær lokalisering av protein oversettelse. Andre metoder, spesielt ved bruk av modifiserte aminosyreanaloger, så som metioninanalog-L-azidohomoalain (AHA), kombinert med "click-it" -kjemi 30 , har blitt brukt til å vise at celler som inneholder SG'er, har meget lavere oversettelse enn nærliggende celler 31 . Denne teknikken krever imidlertid metionin sult etterfulgt av pulsmerking i 15-30 minutter. Methionin sult utgjør en ekstra stress, mens den lange merketiden ( dvs. 15-30 min) resulterer i måling av kumulativ snarere enn pågående oversettelse, og tillater også at de nylig syntetiserte proteinene beveger seg fra deres syntese til deres endelige destinasjon innenfor celle. I motsetning er ribopuromycylering mye raskere og er kompatibel med hvilket som helst medium, for eksempel glukosefritt medium som brukes til å indusere SG via glukosestørrelse.

Canonical SG er i dynamisk likevektMed aktivt oversette polysomer. Dette kan vurderes eksperimentelt ved å behandle prøver med stoffene som stabiliserer eller destabiliserer polysomer, og dermed tippe balansen mellom SG og polysomer 23 . Sykloheximid (eller emetin, som oppfører seg på samme måte) blokkerer forlengelse ved å "fryse" ribosomer på mRNA, og dermed redusere bassenget av tilgjengelige ikke-polysomale mRNPer som er i stand til å danne SG. Eksperimentelt kan dette brukes på to måter: Ved å legge til cycloheximid (eller emetin) før spenning for å hindre dannelse av SG eller ved å tilsette cykloheximid (eller emetin) etter at SG har dannet, selv uten å fjerne spenningsmiddelet, forårsaker SG-demontering, som stoppet Preinitiasjonskomplekser blir langsomt inntatt i polysomfraksjonen. I motsetning til dette forårsaker puromycin for tidlig avslutning og fremmer polysom-demontering, og øker puljen av initierende mRNAer som er i stand til å samle seg inn i SG. Eksperimentelt øker puromycinbehandlingen antall SG eller senker tresolD hvor de dannes som svar på gradert stress eller legemiddeldosering. Når man vurderer effekten av puromycin, er det viktig å bruke et sub-maksimal nivå av legemiddelet av interesse, da puromycin forventes å øke effekten av legemidlet og øke prosentandelen av celler som viser SG - dette kan ikke skje hvis stoffet / Stress forårsaker SG i 100% av cellene i utgangspunktet. Dette kontrasterer med cycloheximidbehandling, som adskiller SG og fungerer best når ~ 95% av cellene først viser SG, slik at størst mulig reduksjon kan observeres og nøyaktig kvantifiseres.

Denne protokollen gir et rammeverk for å studere SG i pattedyrceller. Metoder inkluderer: (1) immunfluorescerende farging og ImageJ analyse for å vurdere kolokaliseringen de klassiske SG-assosierte markørene eIF4G, eIF3b og Ras GTPase-aktiverende proteinbindende protein 1 (G3BP1) i formodede SG'er; (2) oligo (dT) fluorescens in situ hybridisering (polyA FISH) for å detektere polyadenylert mRNA; (3) cykloheximid og puromycinbehandling for å bestemme hvorvidt stressinducerte foci er i dynamisk likevekt med polysomer; Og (4) ribopuromycylering for å vurdere translasjonsstatusen til celler som inneholder formodede SG'er. Sammen kan disse analysene avgjøre om stressinducerte foci kan klassifiseres som bona fide SG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellpreparat

  1. Legg til autoklaverte dekselplater til 12 brønner på en brønn med 24 brønner, som angitt i figur 1A ; Dette kan gjøres ved å bruke en steril Pasteur pipette festet til et vakuum for å hente hver deksel. Trykk forsiktig på dekslet på siden av brønnen for å frigjøre sugingen, slik at dekslet faller i brønnen.
  2. Plate 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) osteosarkom celler per brønn ved et sluttvolum på 500 ul medium. Flytt platen side til side og opp og ned flere ganger for å sikre at cellene er jevnt fordelt.
  3. Trykk forsiktig på dekselplaten med en ren P1000-spiss for å sikre at dekslet er på bunnen av brønnen, og at det ikke er noen bobler under dekslet.

2. Stressceller

  1. Den følgende dagen, kontroller platen visuelt for å sikre at cellene er jevnt spredt og jevnt sammenflyttende over dekselet, som variasjoner mellom saMples kan ha negativ innvirkning på resultatene som kan reproduseres. Bruk et 10X objektiv på et invertert vevskulturmikroskop.
  2. Forvarmet mediet til 37 ° C. Unngå å bruke kaldt eller varmt media til cellene, da disse forårsaker kald støt eller varmestokk, henholdsvis.
  3. Fortynn narkotika i forvarmet media. For hver annen medisinsk konsentrasjon, lag 2 brønner inneholdende 500 μl medium. Forbered ytterligere 500 μL for å tillate tap under pipettering. Aliquot 4 rør, hver inneholdende 1,5 ml.
    1. For natrium arsenitt: Til hver brønn som inneholder 500 μL, tilsett 1,5 μL 100 mM natriumarsenitt (sluttkonsentrasjon: 100 μM) eller tilsett 0,75 μl 100 mM natriumarsenitt (sluttkonsentrasjon: 50 μM).
    2. For vinorelbin: Til hver brønn som inneholder 500 μL, tilsett 22,5 μL 10 mM vinorelbin (sluttkonsentrasjon: 150 μM) eller tilsett 18,75 μL 10 mM vinorelbin (sluttkonsentrasjon: 100 μM).
      MERK: Sodium arsenitt Er en velkalkulert og ofte brukt stressgranuleringsinducer og brukes derfor klassisk som en positiv kontroll.
  4. Fjern og kassett mediet fra brønnene B1 - 4 og C1 - 4. Legg mediet med narkotika og vent i 60 minutter (Figur 1A).
    1. Tilsett 500 μl medium med 100 μM natriumarsenitt til brønnene B1 og B2. Tilsett 500 μL medium med 50 μM natriumarsenitt til brønnene B3 og B4.
    2. Tilsett 500 μl medium med 150 μM vinorelbin til brønner C1 og C2. Tilsett 500 μL medium med 125 μM vinorelbin til brønner C3 og C4.
  5. 30 minutter før fiksering, behandle brønnene i kolonne 2 med 5 μl cykloheximid (1 mg / ml lager) og brønnene i kolonne 4 med 2 μl puromycin (1,25 mg / ml lager). Steng platen forsiktig for å blande før platen kommer tilbake i 37 ° C inkubatoren.

3. Cellfiksering og immunfluorescens

NB: Før forsøket, sørg for at metanolen blir avkjølt til -20 ° C. Lag buffere, inkludert fosfatbuffert saltvann (PBS), 5% normal hesteserum (NHS) i PBS og 4% paraformaldehyd (PFA ) I PBS.

  1. Kast mediet og vask brønnene som inneholder dekselplater med PBS. Avhengig av stoffene som brukes, kan det være viktig å kassere mediet som inneholder medisiner ordentlig. Ta kontakt med det lokale miljøkontoret for spesifikke instruksjoner. For å vaske effektivt, fyll en klemflaske med PBS, skjær spissen for å tillate en svak strømning i stedet for en tett strøm, og bruk dette for å legge PBS til hver brønn etter å ha aspirert den opprinnelige PBS.
  2. Fest cellene ved bruk av ~ 250 μl 4% PFA i 15 minutter ved romtemperatur under forsiktig omrøring. Fullstendig dekke toppen av dekselet med PFA; 250 μL bør være tilstrekkelig, men hvis ikke, legg til mer. Unngå alltid pipettering direkte på dekslet, da noen celler (eller spenningsbehandlinger av celler) kan endre vedlegget, og tHan tvinger fra pipettering kan løsne cellene.
  3. Fjern PFA og kast bort riktig. Kontakt det lokale miljøvernkontoret for detaljer om hvordan du skal kassere paraformaldehyd på riktig måte.
  4. Tilsett ~ 250 μL metanol (-20 ° C) og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur under forsiktig goking; Dette permeabiliserer og flater cellene begge.
  5. Fjern og kast metanolen og blokkere cellene ved å påføre ~ 250 μL 5% NHS i 1 time ved RT O / N ved 4 ° C. Kontakt det lokale miljøvernkontoret for detaljer om hvordan man skal kassere metanol på riktig måte.
  6. For primære antistoffer, fortynn antistoffene i 5% NHS.
    MERK: Bruken av flere SG-markører er nøkkelen til å bekrefte om de observerte granulatene er bona fide SG. Antall SG markører som kan brukes, avhenger av filtene som er tilgjengelige i mikroskopet. Hvis standard grønne, røde og farrøde filter sett er tilgjengelige, bruk G3BP1, eIF4G og eIF3b ved en 1/250 fortynning.
  7. Vask brønnene 3 ganger med PBS, og inkuber hver vask i 5 minutter.
  8. For sekundære antistoffer, fortynne alle sekundære antistoffer (1/250 fortynning) og Hoechst-fargestoff (1/1000 fortynning) i 5% NHS.
    1. Til dette forsøket (12 deksler på 250 μl hver-totalt: 3 ml 5% NHS), tilsett 12 μl av hver av de følgende: Cy2-Mouse, Cy3-kanin og Cy5-geit (en 1/250 fortynning av hver ) Og tilsett 3 μL Hoechst-fargestoff.
    2. Inkubér dekselet med de sekundære antistoffene i 1 time ved RT. Under dette og følgende trinn beskytter du prøvene fra lys ved å dekke platen med en boks eller ved å plassere folie over toppen av vevskulturskålen.
  9. Vask vi3 ganger med PBS i 5 minutter hver.
  10. Monter dekslene på merkede glassrør med monteringsmedium. Varm monteringsmediet i en 37 ° C varmeblokk i 10 minutter; Dette reduserer viskositeten og gjør det lettere å pipette. Med en kutt P200-tipp, pipetter 25 μl monteringsmedium per deksel på en glidelåse; 4-8 dekselglass kan passe på en glidelås, forutsatt at mikroskopetrinnet tillater dette. Ved å bruke fine tang, overfør dekselet fra brønnen til lysbildet, pass på at du setter cellesiden ned på monteringsmediet. Bruk et rent P200-tips ved å trykke på dekselet nedover.
  11. Når alle dekslene har blitt montert, bruk foldet laboratorievæv for å rydde opp overflødig monteringsmedium ved å trykke laboratoriefliet veldig godt på glidebanen. Bruk en klemflaske med H 2 O for å skylle ut overflødig monteringsmedium, og gjenta deretter blottet med foldet laboratorievev for å fjerne vannet.

4. Fluorescens i situ </ Em> Hybridisering (FISH)

  1. Plate og behandle cellene, ved hjelp av trinn 1 og 2.1-4 som en veiledning; Det er bare nødvendig å plate cellene i kolonne 1, da det kun er behov for 3 deksel i det følgende eksperimentet.
  2. Sørg for at alle buffere er tilberedt ( dvs. 4% PFA i PBS, 70% etanol i vann, 2x saltvann-natrium-sitrat (SSC) og 5% NHS), at metanolen avkjøles til -20 ° C, og at Hybridiseringsovnen oppvarmes til riktig temperatur.
  3. Utfør trinn 3.1-3.3 for å vaske og fikse cellene.
  4. Permeabiliser celler ved å tilsette -20 ° C metanol i 10 minutter.
  5. Fjern metanolen og inkuber dekselplatene i 70% etanol. Plasser platen ved 4 ° C over natten. Tett platen med parafilm for å forhindre fordampning.
  6. Den følgende dagen, fjern etanolen og rehydrere cellene ved å tilsette 500 μl 2x SSC. Inkuber dekselglassene i 5 minutter med mild omrøring ved RT.
  7. Fjern 2x SSC og legg til 500ΜL 2X SSC. Inkuber i 5 minutter under forsiktig omrøring.
  8. Legg et stykke parafilm flat på bunnen av hybridiseringsovnen. Pipetter 25 μl hybridiseringsbuffer på parafilmen for hver deksel. Ta av dekslet fra brønnen på 24 brønner (på dette punktet er dekselene på siden opp) og plasser dekselet på siden på hybridiseringsbufferen. Gjør dette ved 42 ° C eller eventuelt ved 65 ° C i 15 minutter.
    MERK: Ved å fullføre dette trinnet ved 65 ° C vil denaturere cellulære RNAer; Dette kan forbedre signalet hvis polyA er maskert av interaksjoner med proteiner.
  9. Fortynn Biotin-Oligo (dT) sonden (100 ng / μl) i hybridiseringsbuffer til en konsentrasjon på 2 ng / μl; 25 μL per deksel er tilstrekkelig.
  10. For hver dekselglass pipetter 25 μl hybridiseringsbuffer som inneholder Biotin-Oligo (dT) på parafilmen. Plukk dekselglasset med tang og trykk forsiktig på kanten av dekselet på et laboratorievev for å fjerne overflødigHybridiseringsbuffer. Overfør dekselglasset til hybridiseringsbufferen med Biotin-Oligo (dT); Husk å holde celle siden nede.
  11. Legg dekselplatene i en hybridiseringsboks for å begrense fordampningen. Inkuber dekselglassene med Biotin-Oligo (dT) i hybridiseringsbuffer i 60 minutter ved 42 ° C.
  12. Plasser 2x SSC i hybridiseringsovnen slik at den kan balansere til 42 ° C.
  13. Tilsett ~ 500 μL oppvarmet 2x SSC til brønnene i 24-brønns parabolen og bruk tetninger for å overføre dekslene til brønnen. Inkuber i 10 minutter.
  14. Gjenta ovennevnte vaske trinn to ganger ved 42 ° C og deretter to ganger ved RT.
  15. Fullfør trinn 3.5-3.10, sørg for å bruke streptavidin fluorokrom for å oppdage Biotin-Oligo (dT) i stedet for ett konvensjonelt antistoff.

5. Ribopuromycyleringsanalyse for å vurdere translasjonsstatus

  1. Plate U2OS-celler på dekselglass, som angitt i trinn 1, men bare plate en deksel per tilstand (i detteTilfelle, 3 dekselplater: ikke-behandlet, 100 μM natriumarsenitt og 150 μM vinorelbin) ( Figur 1 A).
  2. Stressceller som bruker protokollen i trinn 2, fullfører trinn 2.1-2.4.
  3. 5 min før fiksering, tilsett 2 μl puromycin (lager: 1,25 mg / mL, fortynnet 2 μl i 500 μl for å oppnå en endelig puromycinkonsentrasjon på 5 μg / ml) og 2,9 μl emetin (lager: 20 μg / ml; 2,9 μl til den samme løsningen som allerede inneholder puromycinet) til hver brønn inneholdende 0,5 ml.
  4. Fullfør trinn 3.1-3.10 som angitt ovenfor, ved bruk av et anti-puromycin-antistoff (1/1000 fortynning) for å oppdage puromycin. Ideelt sett, bruk to andre SG markører i de resterende kanalene.
  5. Når du kvantifiserer puromycinsignalet, ta alle bilder med samme eksponering. Velg denne eksponeringen ved å bruke den lyseste (ubelastede) prøven og ta et bilde så lyst som mulig uten metning.
    MERK: Intensiteten av anti-puromycin fluorescerende signal representererEnts kontinuerlig oversettelse, som puromycinsubstitutter for en aminosyre, inkorporerer i det naserende proteinet og styrker prematur terminering av proteinet.

6. Bildeoppkjøp og analyse

  1. Kvantifiserende stresskorn
    1. For å kvantifisere SG, få 3 - 5 bilder på totalt> 100 celler per prøve ved hjelp av et 40X objektiv. Alternativt kan du skaffe bilder ved hjelp av andre mål, men sørg for at> 100 celler telles per deksel og at forstørrelsen er stor nok til å tydeligvis visualisere granulene. Gjør dette ved å dele dekselet til fem omtrent like regioner og tilfeldig velge et felt fra hver region ( figur 1B ); Bilder av samme felt bør inkludere alle kanaler for å vurdere kolokalisering av markører.
    2. Når alle bildene er ervervet, slå sammen kanalene. Noen kameraprogrammer vil automatisk gjøre dette, mens andre krever manuell sammenslåing; Dette kan gjøres medImageJ ved å åpne alle bildene og deretter velge [Bilde | Farge | Flett kanaler].
    3. Manuelt telle totalt antall celler ved å telle antall kjerner, ved hjelp av Hoechst som kjernemarkør. Teller manuelt antall celler som inneholder mer enn to SG'er per celle.
      MERK: Hvis du for eksempel bruker et flettet trekanalsbilde som viser G3BP1 (grønt), eIF4G (rødt) og Hoechst (blå), telle kjernene (eller antall celler) ved hjelp av den blå kanalen. Deretter teller SG-positive celler som de med to eller flere gule foci per celle. Granulene vil bli gul, som grønn fra G3BP1 og rød fra eIF4G virker gul hvis den er kolokalisert.
    4. Bestem prosentandelen celler som er SG-positive ved å kombinere dataene fra de 3-5 uavhengige områdene og deretter beregne:
      Antall SG positive / antall kjerner) * 100 = prosent av SG-positive celler
  2. Vurdere kolokalisering ved hjelp av Line Scan Analysis - Manuell metode
    1. ÅpenImageJ. Last ned det gratis fra ()
    2. Åpne avkastningsbehandleren: [Analyser | Verktøy | Avkastningsbehandler ...].
    3. Åpne det fusjonerte bildet i ImageJ: [File | Åpen].
    4. Ved hjelp av linjeprogrammet som ligger i ImageJ-verktøylinjen, legg til en linje som går gjennom en SG, sørg for å inkludere før og etter SG. Legg denne linjen til avkastningsbehandleren ved å klikke på [Legg til] i avkastningsbehandlingsvinduet.
    5. Del det sammenslåtte bildet i separate kanaler for å vurdere lokaliseringen av hver markør til granulen: [Bilde | Farge | Split kanal]; Dette vil dele det sammenslåtte bildet i tre svart-hvite bilder.
    6. I svart-hvitt-bildet må du kontrollere at linjen er valgt; Linjen velges hvis den vises i bildet. Hvis ikke, klikker du på linjen i panelet i avkastningsvinduet. Dette vil markere linjen i blått i ROI-ledervinduet og gjøre linjen synlig på svart-hvitt-bildet. Hvis linjen fremdeles ikke vises, vær sikker på at "Vis alle" er chEcked i avkastning manager og deretter klikke på linjen i bildet.
    7. Analyser intensiteten til linjen: [Analyser | Plot Profile]; Dette vil gi opp "Plot Profile" -vinduet, som viser intensiteten til signalet over linjen.
    8. I vinduet "Plottprofil" klikker du på [Liste], som gir et vindu som inneholder de rå dataene fra grafen. Kopier alle dataene i dette vinduet og lim det inn i en regnearkfil. For å gjøre dette, velg alle dataene i vinduet: [Rediger | Velg alle]. Kopier dato: [Rediger | Kopiere]. Åpne en regnearkfil og lim inn dataene: [Rediger | Lim inn].
    9. Fullfør trinn 6.2.6 - 6.2.8 for hver kanal separat. Pass på å holde styr på kanalen som vurderes.
    10. I et regneark generer du en linjediagram av resultatene. Velg kolonnene som inneholder data ved å trykke på [kontroll] og klikke på brevet øverst i hver kolonne. Deretter velger du linjediagram: [Sett inn | Linjediagram].
    11. Gjenta denne analysen for multIple stress granulater på tvers av flere uavhengige eksperimenter.
  3. Vurdere kolokalisering ved hjelp av Line Scan Analysis - ImageJ Plugin
    1. Last ned og installer RGB-profilverktøyet fra ImageJ-nettstedet (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Når korrekt installert, vises et rødt, grønt og blått (RGB) -linjet ikon på verktøylinjen.
    2. Åpne bildet ( f.eks. Tiff, JPG) i ImageJ: [File | Åpen].
    3. Klikk på RGB-ikonet som ligger i ImageJ-verktøylinjen.
    4. Klikk og dra for å legge til en linje som strekker seg gjennom en SG, og sørg for å inkludere tilstøtende områder; Et bilde av histogrammet vil vises i et popup-vindu.
    5. Lagre dataene som et bilde: [Fil | Lagre som | Tiff]. Alternativt kan du eksportere og deretter grave dataene i et annet grafikkprogram ved hjelp av trinn 6.2.8 ovenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stressinducerte foci er ikke nødvendigvis SG. SG er klassifisert som cytoplasmatiske foci som inneholder mRNAer, translationsinitieringsfaktorer og RNA-bindende proteiner og er i likevekt med aktiv oversettelse. Ovennevnte protokoll kan brukes som en mal for å karakterisere om en gitt stress induserer bona fide SG.

SG'er kolokaliseres med andre kjente SG markører, inkludert både proteiner og mRNA. SA og VRB induserer cytoplasmatiske foci som inneholder G3BP1, eIF4G og eIF3b ( figur 2A ). Kolokaliseringen av disse markørene er bekreftet ved hjelp av linjeskanningsanalyser og enkeltkanalbilder med økt forstørrelse ( figur 2A ). I tillegg inneholder disse fusene Mrna, som indikert av polyA FISH, og oligo (dT) -signalet kolokaliseres med G3BP1-immunfluorescenssignalet ( figur 2B ). Det er kritisk å vise at polyA-FISHSignal overlapper med en kjent SG markør, som et stress kunne fremme flere typer foci.

SG'er forekommer under en translasjonelt hemmet tilstand. Både VRB og SA fremmer en translasjonelt undertrykt tilstand, som eksperimentelt vurderes med ribopuromycylering ( Figur 3 ). Bona fide SG er i dynamisk likevekt med aktivt oversette polysomer. SA- og VRB-induserte SG'er oppløses med CHX, som fanger polysomer på mRNA, og dermed stopper polysom ​​demontering og forhindrer SG ( Figur 4A, 4B ). Omvendt induceres flere SA og VRB SG'er etter behandling med puro, idet puro fremmer polysom-demontering, og derved favoriserer SG-dannelse ( Figur 4A, 4C ).

Sammendrag, som med positivkontrollen SA, inducerer VRB bona fide SG'er som: (1) kolokaliserer med kjente SG markører, (2) inkluderer både protein og mRNA ( Figu Re 2), (3) finnes i celler der oversettelsen er undertrykt ( figur 3 ), og (4) er i dynamisk likevekt med aktiv oversettelse ( figur 4A-4C ).

Figur 1
Figur 1: Eksperimentelle diagrammer. ( A ) Frøceller på dekselplater som tidligere er plassert i en brønn med 24 brønner, som angitt. Behandle rader A og B i 60 minutter med SA eller VRB ved å bruke konsentrasjonen i μM som angitt. Etter 60 minutter tilsettes CHX (sluttkonsentrasjon: 20 μg / ml for kolonne 2) eller puro (20 μg / ml puromycin for kolonne 4) til det medikamentholdige medium. Fortsett inkubasjon i ytterligere 30 minutter før fiksering og farging. ( B ) Diagram over et deksel, som angir feltene som skal avbildes for telling. Dekklipset er delt inn i fem omtrent like like områder; Ett bilde er tatt i hver region."Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55656/55656fig1large.jpg" target = "_ blank"> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: SA og VRB Induce Cytoplasmic Foci som inneholder SG Markers anPoly (A) mRNA. ( A ) U2OS-celler immunfargede for G3BP1 (grønn), eIF3b (rød) og eIF4G (blå). Celler ble behandlet med 100 uM SA eller 150 uM VRB i 60 minutter eller ikke behandlet (kontroll). Zoomede områder forstørres (2X) og vises som separate kanaler i svart og hvitt (under). Grafen indikerer linjeskanningsanalysen av en region (hvit linje) granulat og viser omfanget av overlapping eller kolokalisering. Målestangen representerer 10 μm. ( B ) PolyA-FISH kombinert med immunfarging detekterer polyA-mRNA med en oligo (dT) 40- probe (rød), G3BP1 (grønn) detekteres ved å bruke en anti-G3BP antistoff, og atom-DNA blir detektert ved å bruke Hoechst-fargestoff (blå). Zoomede regioner (2X), enkeltkanalbilder og linjeskanningsanalysen viser kolokalisering. Skalbjelke = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: SA- og VRB-behandlingsårsakstrykk. Immunofluorescensen av U2OS-celler pulsmerket med puromycin i 5 minutter etter de angitte behandlinger. Puromycin (grønn), eIF3b (rød) og nukleær DNA farget med Hoechst (blå). Cellene ble behandlet med 100 uM SA eller 150 uM VRB i 60 minutter eller ikke behandlet (kontroll). Skalbjelke = 10 μm. Vennligst klikk her for å se et større versIon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: SA og VRB Induce Cytoplasmic Foci som er i dynamisk likevekt med polysomer. ( A ) Generell skjema som beskriver polysom ​​/ SG-forholdet. ( BC ) U2OS-celler farget for G3BP1 (grønn), eIF3b (rød) og nukleær DNA ved bruk av Hoechst (blå). Celler ble behandlet med 100 μM SA eller 150 μM VRB i 60 minutter eller ble ikke behandlet (kontroll) før tilsetningen av ( B ) CHX (cykloheximid, 20 μg / ml), ( C ) puro (Puromycin, 10 μg / ml ), Eller ingen additiv i ytterligere 30 min inkubasjon. Tallene tilsvarer prosentandelen av celler med SG i et representativt eksperiment. Skalbjelke = 25 μm, i (BC). Vennligst klikk her for å se en størreVersjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som påvist ved immunhistologiske studier i flere sykdommer, fører kronisk stress til dannelsen av forskjellige intracellulære foci. For eksempel er de fleste nevrodegenerative sykdommer preget av intracellulære aggregater av uoppløselige proteiner. Tilstedeværelsen av SG-assosierte proteiner i slike aggregater er ofte grunnlaget for å konkludere at slike foci er SG. En lignende konklusjon trekkes også når SG markør-positive cytoplasmatiske foci observeres i celler behandlet med nye stress-stimuli. Denne protokollen gir en enkel arbeidsflyt for å identifisere bona fide SG.

Flere kriterier må oppfylles for at formodende SG skal bekreftes som sådan, herunder karakterisering av både sammensetning og dynamikk. For det første er SG'er cytoplasmatiske foci som inneholder translationelt stalled mRNPs. Dermed er den første tilnærmingen å karakterisere deres sammensetning ved bruk av to mikroskopi-baserte teknikker, nemlig polyA-FISH og IF. FISH er en pålitelig metode for visuell brukIze mRNA som colocalize med SGs. En oligo (dT) 40 sonde brukes til å detektere polyadenylerte mRNAer som pakker inn i SG under stressbetingelser. Siden oligo (dT) ikke vil detektere deadenylerte mRNA, som er kjernebestanddeler i behandlingsorganer (PBs), er tilstedeværelsen av et sterkt oligo (dT) -signal i cytoplasmatiske foci en første indikasjon (selv om det ikke er nok for definisjon) at disse fociene er SGS. Den andre testen er å demonstrere kolokalisering av et poly (A) signal med andre SG markører ( f.eks. G3BP1) ( Figur 2A ). Dette gjøres ved å utføre IF mot SG markørproteiner. SG-markørene eIF3b, eIF4G og G3BP1 brukes rutinemessig fordi eIF3b og eIF4G er translationsinitieringsfaktorer kjent for å være komponenter av 48S * komplekser og G3BP1 er nødvendig for SG-dannelse ( Figur 2B ). Det er viktig å understreke at mer enn en SG-markør er nødvendig, da forskjellige spenninger rekrutterer forskjellige SG-assosierte faktorer til SG, og noen spenninger kan cAuse protein aggregering som kan forveksles med SG-dannelse.

For det andre blir SG dannet på grunn av translationsinhibering. Selv om inhiberingen av oversettelse kan påvises ved forskjellige tilnærminger ( f.eks. Ved tradisjonell [ 35 S] Met chase-merking), er ribopuromycylering foretrukket, da den detekterer kontinuerlig proteinoversetting i behandlede celler. Denne teknikken er også kompatibel med standard immunofluorescens mot SG markører, slik at det muliggjør samtidig overvåking av SG og graden av translationsinhibering i individuelle celler. Som vist i figur 3 , fremmer både SA og VRB både SG-formasjon i forskjellige grader. Mens SA forårsaker SG i nesten 100% av cellene, fremmer VRB SG-dannelse i omtrent 75% av cellene. Evnen til å promotere SG er korrelert med graden av oversettelsesinhibering: Selv om ubehandlede celler har et høyt basalt nivå av oversettelse, hemmer SA oversettelse helt, men VRB bare paHindrer vanligvis oversettelse ( figur 3 ).

Tredje, SG er dynamiske og er i likevekt med å oversette polysomer. Behandling av celler med cykloheximid før stress eller samtidig med stress forhindrer polysom ​​demontering og SG-dannelse. SG-polysome-likevekt er toveis, da stressede celler som utviser SG, kan behandles med cykloheximid for å håndheve SG-demontering ved å fange mRNA i polysomer eller monosomer når de blir produktivt initiert. En viktig kontroll er å bruke puromycin, som hemmer forlengelse ved å fremme prematur avslutning, og dermed øke mengden av ikke-polysomale mRNP'er som er tilgjengelige for SG-dannelse. Dramatiske endringer i SG er observert når SA eller VRB behandling er kombinert med CHX eller puro behandling ( Figur 4 ). Således vurderer man om det er oppdaget hypoteser i forbindelse med sykloheximid, men forsterkes eller upåvirket av puromycin, er en nøkkeleksperimentell parameter for bruk i SG identifikasjonkation. Emetin-håndhevet SG-demontering i svært små, ikke-adherente, primære humane beinmarg-CD34 + -celler ble vellykket demonstrert ved behandling av cellene i suspensjon før cytospinning 32 .

Natriumarsenitt er mye brukt til å utløse SG ved å indusere eIF2-a fosforylering 33 , men den bør nøye titreres , da den retter seg mot mange proteiner og aktiverer et antall signalveier 34 , 35 . Ulike cellelinjer utviser varierende grad av følsomhet overfor natriumarsenitt. U2OS er relativt sensitive (100 μM), mens COS7, MEFs og HeLa krever 200 μM. DU-145 6 , primære normale humane knoglemarv CD34 + -celler 32 , humane lymfoblaster 36 , musekortikale neuroner 37 og Huh7-celler 31 krever 500-1000 uM.

Den eksperimentelle arbeidsflyten som beskrives her tillater deteksjon av SG i forskjellige celler og under forskjellige spenninger. Den største fordelen med denne arbeidsflyten er at den er enkel og muliggjør en entydig gjenkjenning av bona fide SG, samt for samtidig undersøkelse av mobil oversettelse i stressbehandlede celler. Denne protokollen bruker U2OS-celler, men den kan endres for forskjellige cellelinjer eller til og med for primære celler. En nylig og omfattende liste over celler som brukes til stressgranulærstudier, er gjennomgang 11 . Antallet av celler skal justeres for å nå 80% konfluens på dagen for legemiddelbehandling. Konsentrasjonen og varigheten av behandlingen bør også justeres, ettersom cellene reagerer annerledes. I tillegg, mens denne protokollen er konfigurert for et 24-brønnformat, kan det justeres til enhver størrelse plate eller tallerken hvor dekselplater (av hvilken som helst størrelse) kan ligge flatt under plating og medikamentbehandlingnt. Cellelinjer som stabilt uttrykker SG / PB markører, har blitt brukt i high-throughput, siRNA-baserte skjermer 33 og levende celledannelse 38 . Bildebasert screening ble ansatt ved bruk av HeLa-celler farget for den endogene SG-markør PABP for å detektere kjemiske forbindelser som blokkerer SG-samling 39 . Det forventes at denne arbeidsflyten vil være nyttig i fremtidige studier og applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer av Ivanov og Anderson labs for deres nyttige diskusjon og tilbakemelding på dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [GM111700 og CA168872 til PA, NS094918 til PI], National Science Centre i Polen [gi UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 til WS]. WS anerkjenner også departementet for vitenskap og høyere utdanning i Polen (Mobility Plus Program) og den polsk-amerikanske Fulbright-kommisjonen for økonomisk støtte til sin forskning i USA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U-2 OS ATCC ATCC®HTB-96™ Commonly written "U2OS"
Culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Corning 10-013-CV Contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red
Supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin
Prewarm prior drug(s) dilution
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F2442-500ml Used to supplement media
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080 Used to supplement media
penicilline streptomycine Sigma P0781-100ml Used to supplement media
24-well plate Costar 3524
lab tissues (kimwipes) KIMTECH SCIENCE 34120
Coverglass for Growth Cover Glasses Fisher Scientific 12-545-82 Autoclaved before use
Keep sterile in the tissue culture hood
Sodium (meta)arsenite ≥90% (SA) Sigma S7400-100G Dissolve in water to 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock
Vinorelbine (VRB) TSZ CHEM RS055 Dissolve in water to 10 mM
Puromycin Sigma P9620 Used to assess translation level (ribopuromycylation)
-Used to assess SG connection with active translation
Dilute in water to 10 mg/mL
Emetine dihydrochloride hydrate Sigma E2375 Used in combination with puromycin to assess general translation level
Used to assess SG connection with active translation
-Dilute in water to 10 mg/mL
Cycloheximide (CHX) Sigma C4859 Used to assess SG connection with active translation
Dilute in water to 10 mg/mL
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza / VWR 95042-486 Wash buffer for immunofluorescence
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) Sigma P6148-500G Make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved
Aliquots can be stored at -20 °C for several months
Hazardous, use ventilation
Discard in special waste
Methanol, ACS BDH / VWR BDH1135-4LP Prechill to -20 °C before use
Discard in special waste
Normal Horse Serum (NHS) Thermo Fisher Scientific 31874 Dilute to 5% in PBS
Add sodium azide for storage at 4 °C
Blocking solution for immunofluorescence
Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC Decon Labs / VWR 89125-188 Dilute to 70% with water
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y) Santa Cruz sc-81940 Store at 4 °C
1/100 dilution
rabbit anti eIF4G antibody (H-300) Santa Cruz sc-11373 Store at 4 °C
1/250 dilution
goat anti eIF3η (N-20) antibody Santa Cruz sc-16377 eIF3η is also known as eIF3b
Store at 4 °C
1/250 dilution
mouse anti puromycin 12D10 antibody Millipore MABE343 Store at 4 °C
1/1,000 dilution
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 715-225-150 Reconstitute in water per manufacturer’s instructions then store at 4 °C
1/250 dilution
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 711-165-152 Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C
1/2,500 dilution
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immunoresearch 705-175-147 Reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C
1/250 dilution
Hoechst 33258 solution Sigma 94403-1ML Incubate with secondary antibodies
Stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light
-Store at 4 °C
Cy3 Streptavidin Jackson Immunoresearch 016-160-084 Reconstitute in water per manufacturer’s instructions, then store at 4 °C
1/250 dilution
oligo-(dT)40x probe biotinilated Integrated DNA Technologies (IDT) / Reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20 °C
Dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use
Custom order
hybridation box / / Make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom
- prewarm the box prior use
20x SSC buffer Thermo fisher Ambion AM9763 Dilute to 2x SSC using RNase Free water (DEPC treated)
Store at RT
Wash buffer for FISH
PerfectHybPlus Hybridization Buffer Sigma H7033-50ml Block and probe incubation buffer for FISH
slide mounting media home made / Mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 mL of PBS
Mix by sonication, followed by stirring O/N at RT
Add 5 mL of glycerol and 0.2 mL of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT
Centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet
Aliquot viscous liquid, long-term storage at -20 °C, 1 week at 4 °C
Parafilm "M" Sigma P7793-1EA
Poly(vinyl alcohol) Sigma P-8136-250G Reagent to make vinol
Glycerol Sigma G5516-100ML Reagent to make vinol
sodium azide Fisher Scientific S2002-5G Preservative agent for blocking solution and vinol
Make a 20% dilution in water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, (4), 318-327 (2005).
  2. Yamasaki, S., Anderson, P. Reprogramming mRNA translation during stress. Curr Opin Cell Biol. 20, (2), 222-226 (2008).
  3. Buchan, J. R. mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease. RNA Biol. 11, (8), (2014).
  4. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13, (1), 195-210 (2002).
  5. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase? Trends Biochem Sci. 38, (10), 494-506 (2013).
  6. Kedersha, N., et al. Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules. J Cell Biol. 151, (6), 1257-1268 (2000).
  7. Bley, N., et al. Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress. Nucleic Acids Res. 43, (4), e26 (2015).
  8. Kedersha, N., et al. G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits. J Cell Biol. 212, (7), 845-860 (2016).
  9. Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics. J Cell Biol. 215, (3), 313-323 (2016).
  10. Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. Stress granules, P-bodies and cancer. Biochim Biophys Acta. 1849, (7), 861-870 (2015).
  11. Aulas, A., Van de Velde,, C, Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS? Front Cell Neurosci. 9, 423 (2015).
  12. Ivanov, P., Anderson, P. Post-transcriptional regulatory networks in immunity. Immunol Rev. 253, (1), 253-272 (2013).
  13. Wolozin, B. Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease. Discov Med. 17, (91), 47-52 (2014).
  14. Lloyd, R. E. Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, (3), 317-331 (2013).
  15. Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208, (7), 913-929 (2015).
  16. Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. (2015).
  17. Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell Int. 10, 12 (2010).
  18. Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation. Mol Biol Cell. 18, (7), 2603-2618 (2007).
  19. Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules. Cancer Cell. 5, (5), 429-441 (2004).
  20. Szaflarski, W., et al. Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation. Oncotarget. 7, (21), 30307-30322 (2016).
  21. Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Mol Biol Cell. 15, (12), 5383-5398 (2004).
  22. Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules. J Cell Biol. 147, (7), 1431-1442 (1999).
  23. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  24. Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).
  25. Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, (14), 4381-4385 (1982).
  26. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  27. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, (1), 45-57 (2012).
  28. Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells. Methods. 90, 57-64 (2015).
  29. David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells. Histochem Cell Biol. 139, (3), 501-504 (2013).
  30. Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat Neurosci. 13, (7), 897-905 (2010).
  31. Ruggieri, A., et al. Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection. Cell Host Microbe. 12, (1), 71-85 (2012).
  32. Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells. Biochem Biophys Res Commun. 420, (4), 768-774 (2012).
  33. Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly. Nat Cell Biol. 10, (10), 1224-1231 (2008).
  34. Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite. Oncogene. 18, (54), 7794-7802 (1999).
  35. Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. Arsenic binding to proteins. Chem Rev. 113, (10), 7769-7792 (2013).
  36. McDonald, K. K., et al. TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1. Hum Mol Genet. 20, (7), 1400-1410 (2011).
  37. Aulas, A., et al. G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA. J Cell Biol. 209, (1), 73-84 (2015).
  38. Martin, S., Tazi, J. Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells. J Vis Exp. (87), (2014).
  39. Wippich, F., et al. Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling. Cell. 152, (4), 791-805 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics