Live-cell mätning av luktämnet Receptor aktiveringen med en realtid cAMP-analys

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Karaktärisera funktionen av luktämnet receptorer serverar en oumbärlig del i processen deorphanization. Vi beskriver en metod att mäta aktivering av luktämnet receptorer i realtid med en cAMP-analys.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. J. Vis. Exp. (128), e55831, doi:10.3791/55831 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De enorma storlekarna av de nuvarande svårigheterna för däggdjur luktämnet receptor (OR) familjer att hitta deras cognate ligander bland många flyktiga kemikalier. För att effektivt och korrekt deorphanize ORs, kombinera vi användningen av ett heterologt cellinje uttrycka däggdjursceller ORs och en genetiskt modifierade biosensor plasmid för att mäta cAMP produktion nedströms OR Activation i realtid. Denna analys kan användas för att skärmen odoranter mot ORs och vice versa. Positiv luktreceptor interaktioner från skärmarna därefter kan bekräftas genom att testa mot olika lukt koncentrationer, generera koncentration-respons kurvor. Här använde vi denna metod för att utföra en high-throughput screening av en illaluktande förening mot en mänsklig OR bibliotek uttryckt i Hana3A celler och bekräftat att positivt-svarar receptorn är besläktat receptorn för sammansatta av intresse. Vi hittade denna hög genomströmning detektionsmetod vara effektiv och tillförlitlig bedömning av OR aktivering och våra data ger ett exempel på dess potentiella användning i OR funktionella studier.

Introduction

Luktsinnet spelar en viktig roll i djurens överlevnad eftersom de förlitar sig på sin lukt förmåga att skaffa föda, undvika rovdjur och fara, skilja arter och välj mate1,2. Förverkligandet av dessa funktioner beror på luktämnen receptorer (ORs), som uttrycks individuellt vid strålkroppen ytan av lukt sensoriska nervceller (OSNs) ligger i luktepitel (OE). ORs utgör den största familjen av G-protein kopplade receptorer (GPCR) superfamiljen med ungefär 400 och 1200 olika OR gener i mänskliga och mus, respektive3,4,5. ORs aktiveras av odoranter leda till ökade intracellulära cAMP-nivåerna via sekventiell aktivering av lukt G-protein (Golf) och typ III viktreglerande cyclase (ACIII). Den resulterande ökad nivån av intracellulära cAMP kunde fungera som en andra budbärare, som öppnar nukleotid-gated kanal på cellytan, utlöser tillströmning av katjoner inklusive Ca2 + och handlingspänningar, och slutligen inleda neuro-potential överföring och lukt perception. Processen för att upptäcka och diskriminera ett stort antal doftämnen av ORs betraktas som det första steget av lukt perception6,7.

Eftersom Buck och Axel8 först framgångsrikt klonat luktämnet receptorer och klarlagd mekanismen av lukt perception initierats av ORs, blev deorphanization OR familjen en av hotspots i fältet. Olika i vivo, ex vivo och in vitro- metoder att mäta OR aktiveringen har varit rapporterade9,10,11,12. En traditionell metod som används Ca2 + imaging följt av encelliga RT-PCR på OSNs aktiverat identifiering av olika ORs till alifatiska odoranter13,14,15. Mer nyligen, tillkomsten av storskaliga transkriptom analyser främjas utvecklingen av mer hög genomströmning i vivo metoder. Kentucky analysen identifieras eugenol - och muscone-lyhörd mus ORs med användning av S100a5-tauGFP reporter mus stam och microarray analys9. Den dröm-tekniken baserat på minskningen av OR mRNA nivåer efter luktämnet exponering, och anställd en transcriptomic strategi att bestämma OR aktiveringen profiler i både ryggradsdjur och icke-ryggradsdjur arter16. Likaså ges fosforyleringen av S6 i neuronala aktiveringar, Matsunami gruppen sekvenserade mRNA från fosforyleras Ribosomen immunoprecipitations att identifiera lyhörd ORs12. Slutligen rapporterade gruppen Feinstein super sniffer möss som kan fungera som en plattform för att studera lukt kodning i vivo, kallas den MouSensor teknik17.

I in vitro- sfären gör utmaningen att odla OSNs ett heterologt uttryck system som härmar OR funktionella uttryck i vivo en idealisk lösning att bedriva storskalig screening av illaluktande kemikalier för ORs. Ändå, eftersom odlade cellinjer av icke-lukt ursprung skiljer sig från infödda OSNs, eller proteiner behålls i endoplasmatiska retiklet och oförmögen att trafiken till plasmamembranet, vilket resulterar i OR försämringen och förlusten av receptor funktion18 , 19. för att lösa problemet, omfattande arbeten har gjorts att replikera OR funktionella uttryck på cellmembranet i heterologa cellinjer. Krautwurst et al. först bifogas de första 20 aminosyrorna av rhodopsin (Rho-tagg) N-terminalen av OR protein och detta främjas cellytan uttrycket av vissa ORs i mänskliga embryonala njurar (HEK) celler20. Genom att bedriva en seriell analys av gen uttryck (SAGE) bibliotek analys från enda OSNs, Saito et al. första klonade receptor-transporterar protein (RTP) familjemedlemmar, RTP1 och RTP2 och receptor uttryck enhancer protein 1 (REEP1) som underlättat OR människohandel till cellmembranet och förbättrat luktämnet-medierad Svaren av ORs i HEK293T celler 21. baserat på dessa fynd, gruppen Matsunami framgångsrikt etablerat raden Hana3A cell, stabilt transfekterade med RTP1, RTP2, REEP1 och Gαolf i HEK293T och övergående transfekterade med Rho-taggade ORs, för effektiv eller funktionella uttryck. Senare studier visade 1) en kortare form av RTP1, RTP1S, som mer kraftfullt kan främja eller funktion än det ursprungliga RTP1 proteinet och 2) typ 3 muskarina acetylkolin receptorn (M3R) som skulle kunna förbättra OR aktiviteten via hämning av β-arrestin-2 rekrytering, vilka båda infördes till heterologa uttryck systemet för att optimera experimentella utgång22,23.

Flera identifieringsmetoder har använts för att kvantifiera receptor aktiveringen i heterologa system. Utsöndras via placenta alkaliskt fosfatas (SEAP) analysen fungerar med en reporter enzym transcriptionally regleras av cAMP svar element (CREs), vilket gör det till ett attraktivt alternativ för att bedöma OR aktivering. Fluorescensen upptäcks lätt i ett prov av odlingssubstratet efter inkubering med SEAP upptäckt reagens24. Med den här metoden kännetecknas fungerar av ORs samt en sekundär klass av chemosensory receptorer uttrycks i OE-the spårningen amine-associerade receptorer (TAARs) har varit25,26,27. En annan vanlig metod, luciferas analysen, använder en firefly luciferas reporter gen under kontroll av elementet cAMP svar (CRE). Mäta luminiscens genereras av luciferas produktion erbjuder ett effektivt och robust sätt att kvantifiera OR aktiveringen10,11,28.

Realtid cAMP analyser har också använts i dynamiskt övervakning funktionen av heterologa eller endogena varandra. Ett exempel på sådana avancerade analyser tar fördel av en genetiskt kodade biosensor variant, som äger en cAMP-bindande domän smält till en muterad form av luciferas. När lägret binder, leder conformationaländring till aktivering av luciferas, luminiscens som sedan kan mätas med en chemiluminescence läsaren29,30. Realtid cAMP tekniken har rapporterats passar den de föräldralösa av mänskliga luktämnet receptorer i HEK293 och NxG 108CC15 cellerAss = ”xref” > 31,32,33, som liksom den HEK293T-derived Hana3A celler34,35. Krautwurst gruppen också beskrivs i detalj i realtid cAMP tekniken för att vara lämplig för dubbelriktad storskalig eller screening metoder32,33.

Här beskriver vi ett protokoll för att mäta OR aktivering med en realtid cAMP-analys i Hana3A celler. I detta protokoll mäts luminiscens pre skakad levande celler kinetiskt för 30 min efter behandling med specifika flyktiga föreningar, som representerar en mer effektiv och korrekt analys av OR aktivering som är mindre känsliga för artefakter som förekommer i den cellulära miljön med längre tid och lukt-inducerad cell toxicitet. Denna realtid mätning möjliggör en storskalig undersökning av både ORs och ligander, samt karakterisering av specifika OR-ligand par av intresse. Med den här metoden identifierat vi framgångsrikt OR5AN1 som receptorn för den mysk sammansatta muscone-genom att utföra en screening mot 379 mänskliga ORs och därefter bekräftar positiv screening resultatet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Culturing och underhåll av Hana3A celler

  1. Underhåll celler i 10 mL minsta viktigt medium (MEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 µg/mL penicillin-streptomycin och 1,25 µg/mL amfotericin B i en 100 mm cell kultur skålen i en 37 ° C cell kultur inkubator med 5% CO 2. Med varje annan passage, lägga till 1 µg/mL puromycin för att upprätthålla stabila transfection av plasmider (se Inledning).
    Obs: Utföra alla åtgärder som rör cellkultur i en klass II biologiska säkerhetsskåp för steril miljö.
  2. Subkultur i ett förhållande av 10-20% i 100 mm rätter varje 2-3 dagar.

2. Plätering celler för Transfection

  1. Observera Hana3A cellerna under ett faskontrastmikroskop att säkerställa cellernas viabilitet och uppskatta sammanflödet.
  2. Aspirera alla medium från cell kultur skålen.
  3. Tvätta cellerna genom att tillsätta 10 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på plattan, virvlande skålen och aspirera PBS.
  4. Tillsätts 3 mL 0,05% trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) på plattan. Blanda i 1 min eller tills alla celler är flytande.
    Obs: Iaktta utvecklingen av celler du lossar från botten av plattan under mikroskopet som nödvändigt.
  5. Inaktivera trypsin genom att tillsätta 5 mL MEM med 10% FBS och pipett upp och ned för att bryta upp bitar av cell Mass
    Obs: För plätering före transfection, det medium som används bör inte innehålla antibiotika. Tillägg av antibiotika kan minska transfection effektivitet.
  6. Överför en lämplig mängd celler till en 15-mLl slang beroende på antalet plattor att vara transfekterade. För varje plattan med 96 brunnar, plattan 2 x 10 6 celler, eller ungefär 1/5 av en 100% konfluenta 100 mm maträtt, ger en cell sammanräkning av 2 x 10 4 celler per brunn eller en täthet av ca 15-30% sammanflödet per brunn. Centrifugera rören vid 200 x g i 5 min och Aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten.
    Obs: Beräkna rätt mängd celler att vara klädd på 96 brunnar att undvika igenväxning eller undergrowing celler innan stimulering.
  7. Lägga till en lämplig mängd MEM med 10% FBS till de 15 mL tub och Pipettera upp och ner att bryta upp bitar av cellen samlas. För varje plattan med 96 brunnar, Omsuspendera cellerna med 6 mL MEM med 10% FBS.
    Obs: Var noga med att inte generera luftbubblor i röret.
  8. Tillsätt de suspenderade cellerna i en reservoar. Med hjälp av en flerkanalspipett, pipett 50 μl av celler till varje brunn en plattan med 96 brunnar. Inkubera över natten vid 37 ° C med 5% CO 2.

3. Transfection av plasmider

  1. före transfection, iaktta guldpläterade cellerna för att säkerställa en korrekt sammanflödet av cirka 30-50% per brunn under ett faskontrastmikroskop och återgå till inkubatorn.
  2. Förbered i förväg Rho-taggade OR konstruera 11 , 21 , 22 , 28, tillbehör faktorn konstruerar (RTP1S 22 , 36 och M3R 23), och den biosensor varianten konstruera 29 , 30 genom miniprep. Kvantifiera den DNA-koncentrationen av en spektrofotometer och justera plasmid DNA koncentrationer (t.ex., till 100 ng/µL) med destillerat vatten vid behov.
  3. Beredning av Transfection blandningarna
    1. förbereda en plasmid transfection blandning i 500 µL MEM för varje plattan med 96 brunnar enligt tabell 1.
      Obs: När olika ORs är testade på den samma plattan med 96 brunnar, volymen av transfection blandningen och mängden plasmid DNA lagt till måste anpassas i funktion av antalet transfekterade brunnar med en given eller.
    2. Förbered en transfection blandning i en tub med 18 µL av lipid-medierad transfection reagens i 500 µL MEM.
  4. Blanda plasmid blandningen med transfection blandningen genom pipettering upp och ner. Odla i rumstemperatur i 15 min.
  5. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 5 mL MEM med 10% FBS.
  6. Utspridda på ett tjockt lager av sterila pappershanddukar i cell kultur huven. Ta en plattan med 96 brunnar med celler från inkubatorn. Försiktigt och upprepade gånger trycka plattan uppochner på högen av pappershandduk så att medlet absorberas helt av pappershandduk.
    Obs: Kraftfullt eller plötsligt tryck inte plattan som man kunde förlora celler.
  7. Överför 50 µL av kombinerade transfection blandningen till varje brunn plattan med 96 brunnar och inkubera över natten för 18-24 h vid 37 ° C med 5% CO 2.
    Obs: En tid-hanterade transfection och stimulering schema bör föregå mätningen när mer än en plattan med 96 brunnar testas i ett experiment för att få alla plattor mätt efter transfection samtidigt och stimulans exponeringstid.

4. Stimulering och mäta eller aktivitet med Real-Time cAMP analys

  1. iaktta de transfekterade cellerna under ett faskontrastmikroskop att säkerställa en korrekt sammanflödet av 50-80% per brunn och återgå till inkubatorn.
  2. Förbereda stimulering mediet genom att lägga till 10 mM hydroxietylstärkelse piperazineethanesulfonic syra (HEPES) och 5 mM glukos till Hank ' s balanserad Salt lösning (HBSS).
  3. Tina i realtid cAMP assay substrat reagens alikvoter på is. Förvara substrat reagens vid-80 ° C 55 µL per rör i PCR-rören. Använd 1 tub per platta.
  4. Förbereda 2% Jämviktstiden lösning genom att blanda 55 µL av substrat reagens och 2750 µL HBSS/HEPES/glukoslösning.
  5. Utspridda på ett tjockt lager hushållspapper på bänken. Försiktigt och upprepade gånger trycka plattan uppochner på hushållspapper så att transfection medlet absorberas helt av pappershandduk.
  6. Tvätta cellerna genom pipettering 50 µL HBSS/HEPES/glukos lösning till varje brunn.
  7. Försiktigt och upprepade gånger knacka ut HBSS/HEPES/glukoslösning från plattan med 96 brunnar.
  8. Pipettera 25 µL 2% Jämviktstiden lösning till varje brunn och odla i rumstemperatur i mörkret för 2 h.
  9. Förbereda i förväg 1 M stamlösningar luktämnet i DMSO och förvaras vid-20 ° C tills används.
  10. Före slutet av inkubationstiden, späd ut luktämnet lager lösningarna arbetar koncentrationer i HBSS/HEPES/glukos stimulering medium.
    Obs: Koncentrationerna av luktämnet spädningarna förberett i det här steget bör fördubblas för att ge de rätta slutliga koncentrationerna i varje brunn.
  11. Använder en chemiluminescence tallrik läsare och innan luktämnet dessutom mäta basala luminiscens nivån av plattan för 2 gånger i rad med en hastighet av 1000 ms per väl 34.
  12. Avlägsna snabbt plattan från plattan läsaren och tillsätt 25 µL luktämnet utspädningar i varje brunn och omedelbart börja kontinuerlig luminiscens mätning av alla brunnar i 20 cykler inom 30 min.
    Obs: Pipett noggrant för att undvika kontaminering av angränsande brunnar när du använder olika doftämnen eller olika koncentrationer av den samma odoranter i samma platta.

5. Dataanalys

  1. Exportera data från chemiluminescence plattan läsarprogrammet.
  2. Beräkna normaliserade OR svar för varje tidpunkt med hjälp av formeln
    (luminiscens N – luminiscens basal) / (luminiscens högsta – luminiscens basal)
    där N = luminiscens värde av en viss väl; basala = genomsnittliga luminiscens värdet av två basala luminiscens värden; högsta = högsta luminiscens värdet av ett fat eller tallrikar.
    Obs: Beroende på syftet med försöket, alternativa grafiska representationer kan antas. T.ex. för screening analyser (se figur 1) och för att skapa koncentration-respons kurvor, luminiscens värdet av en viss väl en önskad tidpunkt under kinetiska mätningen, såsom det högsta värdet eller den det slutliga värdet, kan användas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Muscone är den viktigaste aromatiska komponenten från naturlig mysk. Senaste studier identifierade OR5AN1 som en mänsklig receptor för muscone och andra makrocykliska mysk föreningar baserat på homologi till mus eller, MOR215-1, klonad från muscone-lyhörd glomeruli i beter sig möss37,38. Av screening mänskliga OR repertoaren, vår grupp och gruppen Touhara också identifieras OR5AN1 som en större receptor för två makrocykliska mysk föreningar, cyclopentadecanone och muscone, respektive, med hjälp av luciferas assay system38,39 .

Med realtid cAMP analys beskrivs här, vi mänskliga OR repertoar mot 30 µM muscone (figur 1). Bland 379 mänskliga ORs skärmad, framkom OR5AN1 med ett framstående svar på muscone, medan andra ORs och de negativa kontrollerna (nr-lukt kontroll och kontrollen tom vektor) inte visade ett betydande svar. Den positiva kontrollen testas OR5AN1 mot 30 µM mysk tibetenmysk, en ligand för OR5AN1 (opublicerade data), och användes för att normalisera de yttersta randområdenas svar på muscone. För grafisk representation av denna uppsättning data plockade vi tidpunkten när maximala luminiscens behandlingen uppnådde OR5AN1 mot 30 µM mysk tibetenmysk.

Vi undersökte nästa koncentration-respons förhållandet av lukt-OR par med 3 olika koncentrationer av muscone. För varje koncentration av muscone som testat, under de första 20 min efter muscone dessutom svar på OR5AN1 ökat gradvis och sedan nått sitt tak på de sista 10 min (figur 2A) medan spårningen för no-lukt tillägg kontroll (0 µM muscone) förblev relativt platt. Högre koncentrationer av muscone framkallade starkare OR svar än de lägre, som kan särskiljas genom hela mätningen. Använder den senaste tidpunkten från kinetic mätning, genererade vi en koncentration-respons-kurva och koncentrationen för 50% av maximal effekt (EG50) värdet på kurvan beräknas vara 20.82 µM (figur 2B).

Figure 1
Figur 1: Screening för mänskliga ORs av muscone.
379 unika mänskliga ORs screenades mot 30 µM muscone med realtid cAMP analys. Färgade block längs x-axeln visar olika mänskliga OR familjer. Varje kolumn på x-axeln representerar en enda OR typ förutom de tre sista kolumnerna, som är OR5AN1 svar till 30 µM mysk tibetenmysk (positiv kontroll), OR5AN1 svar på HBSS/HEPES/glukoslösning (en no-lukt negativ kontroll). och svaret från Rho-pCI till 30 µM muscone (en tom vektor negativ kontroll), från vänster till höger. y-axeln representerar normaliserade luminiscens på 30 min efter luktämnet tillägg när svaret nådde högst för positiv kontroll (N = 3). Alla svar är normaliserad till den positiva kontrollen. Felstaplar representera standardfel medelvärde (SEM). För tydlighetens skull visas endast positiva felstaplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Kinetic mätningar av OR5AN1 svar på muscone.
(A) realtid mätningar av OR5AN1 aktivering av muscone av olika koncentrationer och en no-lukt negativ kontroll utfördes inom 30 min av luktämnet tillägg. Pilen anger tidpunkten av luktämnet tillägg. (B) koncentration-respons-kurva för OR5AN1 mot muscone vid 30 min efter luktämnet tillägg. y-axlarna representerar normaliserade luminiscens (N = 3). Alla svar är normaliserade till 100 µM muscone högsta svar. Felstaplar representera SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Plasmid Belopp per plattan med 96 brunnar (µg)
Rho- eller 5
RTP1S 1
M3R 0,5
cAMP biosensor variant 1

Tabell 1: Transfection blandningens komponenter.
Per plattan med 96 brunnar mängd Rho-OR, RTP1S, M3R, och i realtid cAMP biosensor variant plasmider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Exakt mätning en eller aktivering vid exponering för en viss luktämnet är det första steget i dechiffrera kodningen av lukt information. I experiment visat i denna studie utgör ett exempel på hur man kan identifiera, använder en in vitro- OR uttryck systemet, lyhörd ORs bland den mänskliga OR repertoaren för den illaluktande kemiskt av intresse och därefter kännetecknar receptorn farmakologi med olika koncentrationer av kemikalien. Våra resultat bekräftar OR5AN1 som en bona fide -receptor för muscone. Detta överensstämmer med en tidigare rapport39 och ger ytterligare bevis för spekulationer om att endast ett litet antal receptorer är involverade i avkänning mysk lukt27,40. Vid jämförelse med screening data från Sato-Akuhara et al. som genereras av luciferas analysen på en liknande eller heterologt uttryck-systemet, vår screening resultaten visade något sämre signal-brus-förhållande. Förutom variationerna som är förbundna med de olika teknikerna inblandade, kan skillnaden i utdata vara på grund av att vi använde en lägre muscone koncentration (30 µM vs. 100 µM). I själva verket är EG50 värdet av en koncentration-respons kurva över OR5AN1 mot muscone som vi fått via realtid cAMP analysen i av samma storleksordning som den som Sato-Akuhara et al. erhållits i deras luciferas test system, visar jämförbara resultat för samma heterologa OR uttryck systemet även när olika identifieringsmetoder används. I en annan studie fann vår grupp att realtid cAMP systemet kan vara något känsligare än systemets luciferas reporter gen i bedömningen av OR2T11 receptor selektivitet, med tanke på att ett litet antal odoranter var bara aktiv i den förra men inte i den senare systemet35. Jämfört med en rad uppgifter som rapporterats av Geithe et al. 31 på OR1A1 mot (+)-karvon, våra data på OR5AN1 mot muscone visade en försening i den tid som behövs för att nå platån, som direkt följd olika typer av ORs och doftämnen som används. I andra realtid cAMP assay data rapporteras från vår grupp, visade vi också olika tider till topp beroende på de yttersta randområdena och odoranter34,35. Dessutom olika cellinjer som används för att uttrycka ORs, olika substrat används, olika realtid cAMP biosensor variant plasmider, olika känslighet chemiluminescence Plattläsare, eller olika experimentella villkor, såsom variation i rumstemperatur, kan alla bidra till variationer i luminiscens utdata.

Realtid cAMP analysen visar flera fördelar jämfört med andra metoder för att mäta OR aktivering. Första, liknar luciferas reporter gen analysen, realtid cAMP analysen ger en ytterligare i vitro identifieringssätt hög genomströmning av OR repertoarer svara att doftämnen. Storskaliga receptor eller luktämnet skärmar av realtid cAMP analysen kan erbjuda en stor mängd information på receptor-lukt ihopkoppling med användning av ett litet antal plattor. När avancerad luminometers och pipettering robotar finns, det 96 brunnar-protokollet som beskrivs här kan enkelt uppgraderas till en 384-väl format, i vilken ännu mindre plasmid DNA och reagenser krävs per enhet av utdata. Andra är metoden realtid läger kunna mäta förändringar i den intracellulära koncentrationen av cAMP i realtid. Medan de flesta analyser används för att mäta OR aktivitet hittills är fluorescens - eller chemiluminescence-baserade slutpunkt identifiering som kräver cellys, realtid lägret assay isimplemented under icke-lytisk, live-cellen villkor som är mer lik den endogena situation och som möjliggör övervakning av förändringar i lägret nivåer. För det tredje krävs relativt kortare tid att utföra metoden i realtid. En annan hög genomströmning analysmetod för eller-funktion, som bygger på ett luciferas reporter genuttryck, måste en ytterligare 4 h efter lukt stimulering att slutföra ett experiment. I vissa fall kan en långvarig lukt inkubation intervall resultera i potentiella luktämnet toxicitet till celler, som effektivt lindras under övergående exponering. Dessutom i långvariga experiment ökar risken för kontaminering av angränsande brunnar av flyktighet när du använder olika doftämnen eller olika koncentrationer av samma luktämnet i samma platta också. Omedelbar identifiering efter lukt tillägg gör realtid cAMP analysen en snabb och tillförlitlig paradigm.

Begränsningar i realtid lägret assay för mätning eller aktiveringen är följande. Först bygger vår in vitro- analys på en HEK293T-derived cellinje som saknar många endogena molekyler av infödda olfactory sensoriska nervceller. Dessutom kan lösliga proteiner och enzymatiska omvandlingar som förekommer i näsans slem binda med doftämnen eller påverka ORS affinitet för doftämnen. Aktivering i heterologa systemet kan därför skilja sig från i vivo situationen när det gäller känslighet och lukt tuning. Andra kräver identifiering av ORs för en given luktämnet en hela OR repertoar av åtminstone en viss art. ORs är en stor familj av varandra och numrerar av OR proteiner i mänskliga och mus är mycket stor4,5,41. Avsevärd tid och ansträngning kan vara inblandade i kloning varje OR repertoar av intresse. För det tredje, även om systemets OR heterologa uttryck innehåller OR sekvens modifieringar (till exempel Rho-taggen) och några av de viktigaste eller tillbehör proteinerna (såsom RTP1S och M3R), vi misstänker att inte alla ORs funktionellt uttrycks på cellmembranet av den HEK293T-derived celler. Avsaknad av Svaren till en viss luktämnet i vitro utesluter därför inte nödvändigtvis OR svar i vivo, till följd av det faktum att vissa ORs kan bara vara dåligt uttryckt på cellytan och inte identifiera deras ligander. Således, närhelst möjligt realtid cAMP bör användas tillsammans med andra in vitro- och in-vivo -analyser för att få mer övertygande resultat.

Flera kritiska steg bör ges extra uppmärksamhet under realtid cAMP analysen. Först, för experiment med luminiscens i allmänhet, temperaturen är en viktig faktor som påverkar resultatet av experimentet som ökar i temperatur minska basal och inducerad nivåer av ljusflöde och minskning av temperaturen öka ljuseffekt. Därför, före equilibrating plattorna till steady state driftstemperatur i instrumentNT före luktämnet tillägg är nödvändigt för att undvika påverkan på de resultat som orsakas av förändringar i temperatur. Det andra bör koncentrationerna av realtid cAMP assay substrat reagens anpassas efter verkligheten. När den basala luminiscens misslyckas att nå den lägsta påvisbara gränsen chemiluminescence plattan läsaren, bör en öka substrat koncentrationen för att öka signal. Slutligen, trots att en vidhäftande cellinje, Hana3A celler kan lossna under experimentet. När aspirera eller lägga till mediet, kan placera pipettspetsarna vid sidan av brunnen minimera avbrott i den cellen enskiktslager. Det är också viktigt att plattan celler i en lämplig och enhetlig täthet att undvika igenväxning celler som tät fläckar celler tenderar att lossna under förändringen av medium.

Förutom att identifiera OR(s) för en luktämnen av intresse, realtid cAMP analysen kan också användas till skärmen för cognate ligander för en given eller när det finns bibliotek av kemikalier. Slutligen när lämpliga celltyper och transfection villkor används, kan analysen också tillåta för detektion av överuttryckt eller endogena GPCR aktivering och ge koncentrationsberoende responskurvor både agonister och antagonister.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgements

Arbetet stöddes av kinesiska National Science Foundation (31070972), vetenskap och teknik kommissionen i Shanghai kommun (16ZR1418300), programmet för innovativ forskning Team av Shanghai kommunala utbildningskommissionen, Shanghai östra Scholar Program (J50201), och programmet nationella grundforskning av Kina (2012CB910401).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B Sigma A2942
DMSO Sigma D2650
FBS Gibco 10099-141
GloSensor cAMP reagent Promega E1290
pGloSensor-20F cAMP plasmid Promega E1171
Hana3A cells available from authors upon request
HBSS, without calcium or magnesium GIBCO 14175095
HEPES Hyclone SH30237
Lipofectamine2000 Invitrogen 11668-019
M3R plasmid cloned into a mammalian expression vector such as pCI
MEM, with EBSS and L-glutamine Hyclone SH30024
Muscone Santa Cruz sc-200528
Musk tibetene Sigma-Aldrich S359165
OR plasmids cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI
PBS, without calcium or magnesium Cellgro 21-040-CV
Penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
Plasmid miniprep kit Tiangen DP103-03
Puromycin Sigma P8833
RTP1S plasmid cloned into a mammalian expression vector such as pCI
Trypsin-EDTA Hyclone SH30236
0.2-mL PCR tube Axygen PCR-02-C
1.5-mL Eppendorf tube Eppendorf
15-mL 17 mm x 120 mm conical tube BD Falcon 352096
8-well and/or 12-well multichannel pipetman Eppendorf
96-well flat-bottomed white cell culture plate Greiner 655098
100 mm x 20 mm cell culture dish BD Falcon 353003
Class II biological safety cabinet with laminar flow
Cell culture incubator, with 5% CO2
Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes
Infinite F200 plate reader Tecan
Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives
Spectrophotometer
Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution
Sterile paper towel

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malakoff, D. Following the scent of avian olfaction. Science. 286, (5440), 704-705 (1999).
  2. Zippel, H. P. The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8. Behav Processes. 7, (2), 198-199 (1982).
  3. Dryer, L., Berghard, A. Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci. 20, (10), 413-417 (1999).
  4. Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nat Neurosci. 5, (2), 124-133 (2002).
  5. Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome Res. 11, (5), 685-702 (2001).
  6. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5, (4), 263-278 (2004).
  7. Reed, R. R. After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction. Cell. 116, (2), 329-336 (2004).
  8. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, (1), 175-187 (1991).
  9. McClintock, T. S., et al. In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors. J Neurosci. 34, (47), 15669-15678 (2014).
  10. Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity. J. Vis. Exp. (88), e51640 (2014).
  11. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal. 2, (60), ra9 (2009).
  12. Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nat Neurosci. 18, (10), 1446-1454 (2015).
  13. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, (5), 713-723 (1999).
  14. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (7), 4040-4045 (1999).
  15. Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. J Neurosci. 21, (16), 6018-6025 (2001).
  16. von der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nat Neurosci. 18, (10), 1455-1463 (2015).
  17. D'Hulst, C., et al. MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding. Cell Rep. 16, (4), 1115-1125 (2016).
  18. Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors. Traffic. 4, (6), 416-433 (2003).
  19. McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain Res Mol Brain Res. 48, (2), 270-278 (1997).
  20. Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95, (7), 917-926 (1998).
  21. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, (5), 679-691 (2004).
  22. Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. J Biol Chem. 282, (20), 15284-15293 (2007).
  23. Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Sci Signal. 4, (155), ra1 (2011).
  24. Durocher, Y., et al. A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture. Anal Biochem. 284, (2), 316-326 (2000).
  25. Liberles, S. D., Buck, L. B. A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium. Nature. 442, (7103), 645-650 (2006).
  26. Saraiva, L. R., et al. Combinatorial effects of odorants on mouse behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (23), E3300-E3306 (2016).
  27. Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium. J Neurosci. 31, (25), 9179-9191 (2011).
  28. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, (9), 1402-1413 (2008).
  29. Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem Biol. 3, (6), 346-351 (2008).
  30. Fan, B. F., Wood, K. V. Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications. Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).
  31. Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors. J Agric Food Chem. 63, (43), 9410-9420 (2015).
  32. Noe, F., et al. OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol. Chem Senses. 42, (3), 195-210 (2016).
  33. Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chem Senses. 42, (3), 181-193 (2016).
  34. Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (9), 3492-3497 (2012).
  35. Li, S., et al. Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols. J Am Chem Soc. (2016).
  36. Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps. J Biol Chem. 287, (26), 22287-22294 (2012).
  37. Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81, (1), 165-178 (2014).
  38. Block, E., et al. Implausibility of the vibrational theory of olfaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (21), E2766-E2774 (2015).
  39. Sato-Akuhara, N., et al. Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection. J Neurosci. 36, (16), 4482-4491 (2016).
  40. Gane, S., et al. Molecular vibration-sensing component in human olfaction. PLoS One. 8, (1), e55780 (2013).
  41. Young, J. M., et al. Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families. Hum Mol Genet. 11, (5), 535-546 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics