Time-lapse Confocal Imaging av Migrating Neurons i Organotypic Slice Kultur av Embryonic Mouse Brain Using

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokollen gir instruksjoner for direkte observasjon av radialt migrerende kortikale nevroner. I utero- elektroporasjon, organotypisk skivekultur og tidsforskjellende konfokal imaging kombineres for å direkte og dynamisk studere effekten av overekspresjon eller nedregulering av genene av interesse for migrerende nevroner og å analysere deres differensiering under utvikling.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (125), e55886, doi:10.3791/55886 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I utero elektroporasjon er en rask og kraftig tilnærming til å studere prosessen med radial migrasjon i hjernebarken for å utvikle musembryoer. Det har bidratt til å beskrive de ulike trinnene med radial migrasjon og karakterisere molekylære mekanismer som styrer denne prosessen. For å analysere migrerende nevroner direkte og dynamisk må de spores over tid. Denne protokollen beskriver en arbeidsflyt som kombinerer i utero- elektroporasjon med organotypisk skivekultur og tidsforskjellende konfokal bildebehandling, som muliggjør en direkte undersøkelse og dynamisk analyse av radialt migrerende kortikale nevroner. Videre er detaljert karakterisering av migrerende nevroner, for eksempel migrasjonshastighet, hastighetsprofiler, samt radiale orienteringsendringer, mulig. Metoden kan lett tilpasses for å utføre funksjonelle analyser av gener av interesse for radialt migrerende kortikale nevroner ved tap og gevinst for funksjon samt redningseksperimenter. Time-lapseImaging av migrerende nevroner er en toppmoderne teknikk som en gang opprettet er et kraftig verktøy for å studere utviklingen av hjernebarken i musemodeller av neuronal migrasjonsforstyrrelser.

Introduction

Neocortex er det viktigste stedet for kognitive, følelsesmessige og sensorimotoriske funksjoner. Den består av seks horisontale lag orientert parallelt med hjernens overflate. Under utvikling gir progenitorceller i lateralveggen til dorsaltelencephalon anledning til fremspringneuroner som migrerer radialt mot pialoverflaten og erverver en lagtype-spesifikk neuronal identitet. Etter å være generert i de ventrikulære / subventrikulære sonene (VZ / SVZ), blir disse nevronene transient multipolære og senker deres migrasjon. Etter et kort opphold i mellomsonen (IZ) bytter de til en bipolar morfologi, festes til den radiale glialstillasjen, og fortsetter radialt orienterte migrering i kortikalplaten (CP). Ved å nå deres endelige målprojeksjon, avtar nevroner seg fra de radiale glialprosessene og skaffer lagsspesifikke identiteter. Mutasjoner i gener som påvirker forskjellige trinn av nevronmigrasjon kan forårsake alvorlig kortikal misdannelse, som lissencEphaly eller white matter heterotopia 1 , 2 .

I utero elektroporasjon er en rask og kraftig teknikk for å transfektere nevrale stamceller i utviklingshjernen av gnagereembryoer 3 , 4 . Med denne teknikken er det mulig å knockdown og / eller overexpresse gener av interesse for å studere sine funksjoner i å utvikle nevroner. Denne metoden har spesielt bidratt til å beskrive de morfologiske detaljene og karakteriserer molekylære mekanismer i prosessen med radial migrasjon 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Radialt migrerende nevroner gjennomgår dynamiske endringer i celleform, migrasjonshastighet, samt migreringsretning, som krever direkte og kontinuerlig observasjon over tid. Organotypisk skivekultusRe og time-lapse konfokal avbildning av elektroporerte hjerner tillater direkte observasjon av migrerende nevroner over tid. Ved hjelp av denne kombinerte tilnærmingen er det mulig å analysere forskjellige egenskaper hos migrerende nevroner som ikke kan undersøkes i faste vevseksjoner av elektroporerte hjerner.

Vi har nylig brukt konfokal imaging av migrerende nevroner i skivekulturer av elektroporerte hjerner for å studere rollen som transkripsjonsfaktor B-celle CLL / lymfom 11a (Bcl11a) under kortikal utvikling 10 . Bcl11a uttrykkes i unge migrerende kortikale nevroner, og vi brukte en betinget mutant Bcl11a allel ( Bcl11a flox ) 11 for å studere dens funksjoner. Elektroporering av Cre rekombinase sammen med grønt fluorescerende protein (GFP) i kortikale stamceller av Bcl11a flox / flox hjerner tillot oss å skape en mosaikkmutant situasjon, hvor bare få celler muteres i enEllers villtype bakgrunn. På denne måten var det mulig å studere celleautonomiske funksjoner av Bcl11a på enkeltcellens nivå. Vi fant at Bcl11a-mutantneuroner viser redusert hastighet, endringer i deres hastighetsprofiler, samt tilfeldige orienteringsendringer under deres migrasjon 10 . I den skisserte protokollen beskriver vi en arbeidsflyt for vellykket elektroporasjon og skivekulturpreparasjon 12 av mushjerner, samt tidsforskjellende konfokal bildebehandling av kortikale skivekulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Dyrevelferdsutvalget (Regierungspräsidium Tübingen) og utført i henhold til tysk dyrevelferdsloven og EU-direktiv 2010/63 / EU.

1. I Utero Electroporation

  1. Mikroinjeksjonsnåler
    1. Trekk borosilikatglasskapillærene (ytterdiameter: 1,0 mm, innerdiameter: 0,58 mm, lengde: 100 mm) i mikroinjektionsnåler ved hjelp av en mikropipettdrakker med en boksfilament (2,5 mm x 2,5 mm) og følgende program: VARME: 540, PULL : 125, VELOCITY: 20, og DELAY: 140. Bestem VARV-verdien for hvert enkelt filament ved å utføre en RAMP-test (HEAT-verdi: RAMP + 25).
    2. Vinkel nåler i en vinkel på 38 ° og mellomliggende til høy revolusjonshastighet med en mikrogrinder for å få en spissstørrelse på 20 til 30 μm for injeksjon på embryonal dag (E) 13,5 eller yngre og 30 til 40 μm for injeksjon ved eldre embryonaleetapper. For lagring, fikse nåler i en eske eller petriskål med modelleringsleir for å unngå skader på spissene.
  2. Plasmid DNA Solution
    1. Klargjør plasmid-DNA-konstruksjon som inneholder fluorescerende reporterprotein ( f.eks. GFP) ved bruk av et endotoksinfritt maksi-preparatpakke i henhold til produsentens instruksjoner.
    2. Fortynn plasmid-DNA-oppløsningen til en sluttkonsentrasjon på 1 - 2 μg / μl i endotoksinfri Tris-EDTA-buffer inneholdende Fast Green ved en sluttkonsentrasjon på 0,01%. Aliquot-løsning og lagre ved -20 ° C.
  3. Bakteriostatisk natriumkloridløsning
    1. Forbered bakteriostatisk natriumkloridoppløsning ved å tilsette benzylalkohol til en sluttkonsentrasjon på 0,9% til isotonisk 0,9% natriumkloridløsning. Steril filterløsning umiddelbart før bruk.
  4. Carprofen Injection Solution
    1. Forbered carprofen injeksjonsoppløsning vedLegge til karprofen til en sluttkonsentrasjon på 0,5 mg / ml til steril isotonisk 0,9% natriumkloridløsning. Oppbevares ved 4 ° C i opptil 28 dager.
  5. Anestesi, DNA-injeksjon og elektroporasjon
    1. Vei en E14.5 timed-gravid mus og plasser den i et gjennomsiktig bedøvelseskammer koblet til en fordamper og mettet med 5% isofluran. Når dyret er bevisstløs, overfør det til en bedøvelsesmaske festet til en 37 ° C oppvarmingsplate og hold den bedøvet med 1,8-2,2% isofluran.
      Merk: Vurder utviklingen av kirurgisk anestesi ved tap av halefinger og pedalreflekser (tåspenning).
    2. For analgesi injiser 100 μL karprofen injeksjonsoppløsning per 10 mg muskassevekt (5 mg / kg kroppsvekt) subkutant. Vri musen med den ned og forsiktig dekke øynene med petroleumjell for å forhindre at de tørker.
    3. Forsiktig spre ut lemmer og fikse demTil oppvarmingsplaten med kirurgisk tape. Steriliser abdomen med 70% etanol etterfulgt av jodoppløsning (7,5 mg / ml) ved bruk av cellulose-svaber. Gjenta denne prosedyren tre ganger for å sikre riktig desinfeksjon.
    4. Dekk magen med sterilt gaze der et snitt har blitt kuttet for å sparer ut et felt (diameter: 2 - 2,5 cm) for mageinnsnittet. Fukt gazeen med bakteriostatisk natriumkloridløsning.
      Forsiktig: Forny utviklingen av kirurgisk anestesi ved tap av pedalrefleksen.
    5. Ved hjelp av Micro Adson Forceps (serrated, lengde: 12 cm) og fin saks (vinklet til side, lengde: 9 cm) skjærer huden ca. 1,5 cm langs bukets midterlinje. Kutt den underliggende muskelen langs linea alba.
    6. Fjern en livmorhorn med ringpinn (lengde: 9 cm, ytterdiameter: 3 mm, innerdiameter: 2,2 mm) og legg den forsiktig på den fuktede gazeen.
      Forsiktig: Hold livmorhinnen med ringfinger bare mellom embryoer ogD forstyrrer ikke moderkaken eller noen forsyningsbeholdere. Hold livmoren fuktig til enhver tid med bakteriostatisk natriumkloridløsning.
    7. Plasser forsiktig et embryo med ringpinn og lokaliser lateral ventrikel, som presenterer som en halvmåneformet skygge parallelt med sagittal sinus. Injeksjonsstedet ligger omtrent midt i en linje mellom det pigmenterte øyet og sammenføyningen av bihulene, hvor sagittal sinus grener til to tverrgående bihuler. Skyv mikroinjektionsnålen gjennom livmorveggen og inn i sidekammeret.
      Merk: Om nødvendig kan injeksjonens dybde korrigeres ved å trekke nålen tilbake.
    8. Injiser 1 til 2 μL DNA-løsning i sidekammeret med en mikroinjektor, som drives med en fotpedal, ved hjelp av følgende innstillinger: 25 psi, 10 til 20 ms per puls og 5 til 10 pulser. Vellykket injeksjon kan overvåkes av den fargede DNA-løsningen, som skal fylle ventrikulærsystemet.
    9. Plasser pincett-type elektroder (3 mm diameter for E13.5 eller yngre og 5 mm diameter for E14.5 eller eldre) på en slik måte at den "positive" terminalen er på samme side som den injiserte ventrikkelen og den "negative" Terminalen er på motsatt side av den injiserte ventrikkelen under øre av embryoens hode.
    10. Fukt elektroporasjonsstedet med noen dråper bakteriostatisk natriumkloridløsning og bruk 5 elektriske strømpulser (35 V for E13.5 eller yngre og 40 V for E14.5 eller eldre) med 50 ms varighet med 950 ms intervaller.
      Merk: Strømmer på 60 til 90 mA er vanligvis tilstrekkelig for vellykket elektroporering. Nedre strømmer vil ikke effektivt transfektere nevroner, mens høyere strømmer kan føre til embryonal død.
    11. Gjenta prosedyren (se trinn 1.5.7 til 1.5.10.) For hvert embryo i livmoderhornet og legg det forsiktig tilbake i bukhulen.
    12. Fjern livmorhornet fra den andre siden og gjenta prosessenEdure beskrevet i trinn 1.5.7. Til 1.5.11.
    13. Lukk bukhulen ved å sutere muskellaget før du sutter huden ved hjelp av Micro Adson Forceps, Mathieu Needle Holder (wolframkarbid, lengde: 14 cm) og ikke-absorberbar kirurgisk sutur (3/8 sirkel, 13 mm, taperpunkt).
      Forsiktig: Vær forsiktig så du ikke fanger uterus eller andre organer under sutur.
    14. Svært desinfiser hudens sutur med jodoppløsning (7,5 mg / ml) og fjern forsiktig periokulært overskudd av vaselin med cellulosebatterier. Plasser musen under en infrarød lampe til den våkner. Følg nøye med musen de neste to dagene. Gjenta smertestillende behandling som beskrevet i trinn 1.5.2 etter 12 til 24 timer.

2. Organotypisk Slice Culture

  1. Laminin Stock Solution
    1. Oppløs 1 mg lyofilisert laminin i sterilt vann for å oppnå en 1 mg / ml laminin stamløsning. Forbered 50 μl alikvoter aNd butikk ved -80 ° C.
  2. Poly-L-Lysin Stock Solution
    1. Oppløs 50 mg poly-L-lysin i sterilt vann for å oppnå en 1 mg / ml poly-L-lysin stamløsning. Tilbered 0,5 ml alikvoter og lagre ved -20 ° C.
  3. Komplett Hank Balanced Salt Solution (Complete HBSS)
    1. Klargjør fullstendig HBSS ved å kombinere 50 ml 10 x HBSS-oppløsning, 1,25 ml 1 M HEPES-buffer (pH 7,4), 15 ml 1 M D-glukoseoppløsning, 5 ml 100 mM kalsiumkloridoppløsning, 5 ml 100 mM magnesiumsulfat Oppløsning og 2 ml 1 M natriumhydrogenkarbonatoppløsning. Legg sterilt vann opp til 0,5 L, sterilt filter, og lagre ved 4 ° C.
  4. Slice Culture Medium
    1. Kombiner 35 ml Basal Medium Eagle (BME), 12,9 ml komplett HBSS (jf. Avsnitt 2.3.1.), 1,35 ml 1 M D-glukose, 0,25 ml 200 mM L-glutamin og 0,5 ml penicillin-streptomycin til Oppnå 50 ml stykkulturmedium. Sterilt filter og tilsett hesteserum til en sluttkonsentrasjon på 5%. Oppbevares ved 4 ° C i opptil 4 uker.
  5. Lav smeltepunkts (LMP) agaroseoppløsning
    1. Klargjør 3% LMP-agaroseoppløsning ved å oppløse 1,5 g LMP-agarose i 50 ml fullstendig HBSS ved oppvarming i en mikrobølgeovn i 1 til 2 minutter ved mellomstrøm.
      Merk: Overvåk varmen forsiktig for å forhindre overløp under koking.
    2. Plasser oppløsningen i et vannbad ved 38 ° C til klar for bruk. Oppbevares ved 4 ° C og gjenbrukes en gang.
  6. Belegg av membraninnsatser
    1. Legg til en alikvot av laminin lagerløsning (se trinn 2.1.1.) Og en alikvot av poly-L-lysin stamløsning (se trinn 2.2.1) til 6 ml sterilt vann for å oppnå belegningsoppløsning (nok til 6 innlegg) .
    2. Plasser membraninnlegg i en 6-brønnplate som inneholder 2 ml sterilt vann i bunnen av hver brønn. Tilsett 1 ml beleggoppløsning(Se trinn 2.6.1.) På toppen av hver membran og inkuber natten over ved 37 ° C og 5% karbondioksidatmosfære.
      Merk: Bruk kun innsatser med optisk klare membraner, som polytetrafluoretylen (PTFE) membran.
    3. Vask membranene tre ganger med 1 ml sterilt vann og tørk. Bruk belagte membraner på samme dag eller lagre i en ren 6-brønn plate ved 4 ° C i opptil fire uker.
  7. Hjerndisisjon og innbygging
    1. To dager etter elektroporasjon plasserer musen inn i et gjennomsiktig kammer koblet til en fordamper og mettet med 5% isofluran. Når dyret er bevisstløs, fjern det fra kammeret og ofre det ved cervikal dislokasjon.
    2. Fjern livmoren som inneholder embryoene og legg det i en 10 cm petriskål med iskald, fullstendig HBSS.
      Merk: Fra dette punktet behold alle løsninger, embryoer og hjerner på is.
    3. Bruk et stereomikroskop, fine tippede tang (rett,11 cm) og et par Vannas Tübingen Spring Scissors (vinklet opp, 9,5 cm lengde) for å skille hvert embryo fra livmoren og overføre det til en annen petriskål som inneholder iskald, fullstendig HBSS.
    4. Lag et snitt på nivået av hjernestammen og kutt langs sagittal midtlinjen. Skal bort huden og brusk som dekker hjernen. Deretter kutte hjernestammen rett bak hjerter og fjern hjernen fra skallen. Overfør hjernen med en mikroske spatel (185 mm x 5 mm) til en 12-brønn plate som inneholder iskald, komplett HBSS. Samle alle hjerner fra søppel i 12-brønnsplaten.
    5. Bruk et fluorescerende stereomikroskop til å skjerme hjernen i 12-brønnsplaten for fluorescenslysstyrke, samt størrelsen på det elektroporiserte området. Velg 2 til 4 hjerner med lyse fluorescerende signaler i presumptiv somatosensorisk cortex for videre behandling.
    6. Hell 3% LMP-agaroseoppløsning holdt ved 38 ° C i avfallsbeholder. fjernelse avE-hjernen fra 12-brønnsplaten med en mikseskjeftspatel og forsiktig tapp overflødig fullstendig HBSS rundt hjernen ved å bruke fint vevpapir.
    7. Legg hjernen forsiktig inn i agaroseoppløsningen, skyv den til bunnen av formen, og juster forsiktig posisjonen med en 20-gauge nål. For koronale seksjoner, orient hjernen med olfaktoriske pærer peker oppover. Hold mugg på is til agaroseoppløsningen er størknet og fortsett med snitting av hjernen.
  8. Vibratome Seksjon og Slice Culture
    1. Fjern agaroseblokken fra formen og legg den på lokket på en steril petriskål. Trim bort overflødig agarose med et rent barberblad som gir ca 2 til 3 mm under olfaktoriske pærer og 1 mm agarose på den andre siden. Fest den trimmede agaroseblokken med olfaktoriske pærer pekende nedover til en prøvefase ved bruk av cyanoakrylatlim.
      Merk: Steriliser instrumenter og utstyr med 70% etanoL før snitting.
    2. Overfør prøvetrinnet til skivekammeret i et vibrerende bladmikrotom som inneholder iskaldt, fullstendig HBSS, og plasser hjernen med sin dorsale side mot bladet. Klipp 250 μm tykke hjernesnitt som inneholder det elektroporerte området med en lav til moderat amplitude på 0,9 mm og en meget langsom snitthastighet på 0,09-0,12 mm / s. Vanligvis blir 4 til 6 skiver med lyse fluorescerende signal hentet fra hver vellykket elektroporert hjerne.
    3. Med en bøyd mikseskjeftspatel og fine tippede tanger, overfør forsiktig hjerneskiver med den omkringliggende agarosen til en 6-brønn plate som inneholder iskald, fullstendig HBSS.
      Forsiktig: Vær forsiktig så du ikke skader hjernevævet ved å bare berøre agarosefeltet rundt delene med tangen under overføringen.
    4. Behandle alle valgte hjerner som beskrevet i trinn 2.8.1. Til 2.8.3.
    5. Fukt membraninnsatsene med 100 μl fullstendig HBSS før du plasserer hjernenKrysser på membranene for å lette posisjonering av skiver. Opptil 5 skiver kan plasseres på 1 membraninnsats.
    6. Forsiktig overfør skivene til membranene ved hjelp av en bøyd mikseskålspatel og fint tippede tanger. Trekk forsiktig et stykke på spatelen ved bare å berøre agarosefeltet med tang og skyv forsiktig skiven fra spatelen på membranen. Plasser skiven med tanger og fortsett å overføre de resterende skivene. Fjern overflødig komplett HBSS med pipette.
      Merk: Ikke skar skivene med hverandre.
    7. Plasser membraninnsatsene forsiktig med skivene i en 6-brønnsplate som inneholder 1,8 ml skivekulturmedium (se trinn 2.4.1.) Og inkuber ved 37 ° C og 5% karbondioksidatmosfære til tidsperiode bildebehandling.

3. Time-Lapse Imaging

  1. Mikroskopoppsett
    1. Sett et klimakammer plassert på scenen av enInvertert konfokalmikroskop til 37 ° C og 5% karbondioksidatmosfære. Bruk en hybriddetektor for å redusere laserintensiteten og forbedre celleevnen. For detaljert analyse, bruk en ekstra lang arbeidsavstand 40X tørr objektiv med en numerisk blenderåpning på 0,6 eller høyere.
      Merk: Alle komponenter i mikroskopet må varmes opp til 37 ° C i 2-3 timer før bildebehandling for å gi et stabilt fokus under bildeprosessen.
  2. Slice Imaging
    1. Velg en hjerneskive for avbildning fra 6-brønnplaten som inneholder membraninnsatsene ved hjelp av et invertert fluorescensmikroskop.
      Forsiktig: Unngå langvarig eksponeringstid for ultrafiolett lys, da dette kan forårsake cellulær fotodamasje.
      Merk: Velg et stykke med lyse enkeltneuroner i den øvre SVZ som beveger seg radialt mot skiveflaten. Fine fluorescerende prosesser av radiale glialceller som spenner over hele CP, indikerer et intakt radial glialstillas, som er brukD ved radialt migrering av kortikale nevroner.
    2. Overfør membraninnsatsen med skiven, som ble valgt for tidsforsinkelse, inn i en 50 mm diameter glassbunnsskål som inneholdt 2 ml skivekulturmedium ved hjelp av pincet. Plasser fatet i klimakammeret i konfokalmikroskopet.
    3. Still oppløsningen til 512 med 512 piksler og øk skannehastigheten fra 400 Hz til 700 Hz for å øke rammen fra henholdsvis 1,4 og ca. 2,5 bilder per sekund. Bruk ikke mer enn to ganger gjennomsnittlig. Definer en z-stack gjennom det elektroporiserte området (vanligvis 400-100 μm) med en trinnstørrelse på 1,5 μm. Samlet gir disse innstillingene tilstrekkelig oppløsning og lysstyrke av bildet samtidig som fotodamagene blir lave under oppkjøpet. Start time-lapse-serien ved å ta en z-stack hver 30 min.
      Merk: Langvarig eksponering av skiven til laserlys vil forårsake fotodamasje som reduserer cellens levedyktighet. Juster expOsure tid til laserlys tilsvarende.
    4. Analyser time-lapse-serien ved hjelp av ImageJ-programvare (https://imagej.nih.gov/iij/) eller tilsvarende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tidligere har vi vist at genetisk sletting av Bcl11a ved utero- elektroporasjon forringer radial migrering av sen-fødte øvre lagprojeksjonsnekroner 10 . Elektroporering av en DNA-plasmidvektor inneholdende Cre-IRES-GFP effektivt slettet Bcl11a i betingede Bcl11a flox / flox- hjerner 11 . Da vi analyserte E14.5 elektroporerte hjerner tre dager etter elektroporasjonen, hadde de fleste kontrollneuroner migrert i CP, mens mange Bcl11a-mutantneuroner ble stoppet langs migreringsruten i IZ og VZ / SVZ. Videre fant vi en økning i antall multipolære celler på bekostning av bipolære celler spesifikt i IZ ved Bcl11a- sletning som antyder defekter ved polarisasjon 10 .

Å analysere migrere direkte og dynamiskTory-oppførsel av Bcl11a-mutantneuronene brukte vi tidsforskjell konfokal avbildning av migrerende nevroner i organotypisk skjærekultur fremstilt fra elektroporerte hjerner. Oversikt time-lapse-serien ved hjelp av et 10X objektiv med en numerisk blenderåpning på 0,4 bekreftet resultatene våre, at Bcl11a mutantprojeksjonsnekroner har defekter i radialmigrasjon . Innen 36 timer hadde mange kontrollneuroner migrert inn i CP, mens bare få Bcl11a mutantneuroner hadde forlatt IZ og migrert i CP. Interessant syntes det at mange Bcl11a mutante nevroner ikke migrert direkte mot hjerneflateflaten , men reduserte migrasjonen og vendte tangentielt eller til og med tilbake mot ventrikken (Film 1). For å videreutvikle disse funnene genererte vi time-lapse-serien ved høyere forstørrelse ved hjelp av et 40x objektiv med en numerisk blenderåpning på 0,6. Våre data viser at Bcl11a mutantneuroner ikke effektivt polariserte og fortsette radialt orienterte migratIon i CP. Innen 12 timer mislyktes mange Bcl11a-mutantneuroner til å bytte fra en multipolar til en bipolar morfologi og projiserte og trakk i stedet mange prosesser inn i omgivelsene (film 2, figur 1A ).

Videre trakte vi migreringsveiene til individuelle nevroner i forskjellige tidsforløpsserier og brukte disse til å beregne spesifikke parametere for migrerende nevroner. Vi fant at Bcl11a-mutantneuroner gjentatte ganger gjennomgår faser med flere timers varighet med redusert migrasjonshastighet og tilfeldige orienteringsendringer (Film 3, Figur 1B , røde pilespisser). Spesielt var hastighetsprofilen for Bcl11a-mutantneuroner forskjøvet fra høyere hastighet (25 μm / t) mot lavere hastighet (5 μm / t) sammenlignet med kontrollneuroner ( figur 1C ). I tråd med dette er den samlede overføringshastigheten til Bcl11En mutantneuron ble signifikant redusert fra 10,34 ± 0,34 μm / h i kontroller til 6 ± 0,54 μm / h (p = 2,4889E-05) ( Figur 1D ). Endelig var avviket fra rettet migrasjon mot hjerneflateflaten betydelig økt fra 17,15 ± 2,13 ° i kontroll til 40,16 ± 4,42 ° i Bcl11a-mutantneuroner (p = 0,0002) ( Figur 1E ). Sammen viser disse resultatene at tidsforskjellende konfokal avbildning av GFP-elektroporerte nevroner i organotypisk skivekultur er en verdifull metode for å studere molekylære mekanismer som styrer prosessen med nevronmigrasjon.

Film 1
Film 1: Migrasjon av GFP-merket kontroll i sammenligning med Bcl11a Mutant Neurons i kortiske skiver. Bcl11a flox / flox hjerner ble elektroporert påE14.5 med en plasmidvektor inneholdende IRES-GFP (A) eller Cre-IRES-GFP (B) og skivekulturer ble fremstilt ved E16.5. VZ / SVZ; Ventrikulære / subventrikulære soner; IZ, mellomsone; CP, kortisk plate. Skalbjelke = 100 μm. Filmen består av 108 rammer med en hastighet på 5 bilder / s. Reprinted fra Wiegreffe et al. 10 med tillatelse fra Elsevier. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Film 2
Film 2: Polarisering av en GFP-merket kontroll i sammenligning med Bcl11a Mutant Neurons i Cortical Slices. Bcl11a flox / flox hjerner ble elektroporert ved E14.5 med en plasmidvektor inneholdende IRES-GFP (A) eller Cre-IRES-GFP (B) og skivekulturer Ble fremstilt ved E16.5. Skalbjelke = 10 μm. Filmen består av 25 rammer med en hastighet på 5 bilder / s. Reprinted fra Wiegreffe et al. 10 med tillatelse fra Elsevier. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Film 3
Film 3: Animerte spor med 1 time intervalloppløsning av representativ kontroll og Bcl11a Mutant Neurons. Spor av migrerende nevroner ble oppnådd fra tidslapse-serien av E16.5 skivekulturer av Bcl11a floks / flaskhjerninger som ble elektroporert ved E14.5 med en plasmidvektor inneholdende IRES-GFP ( A ) eller Cre-IRES-GFP ( B ) . Skalbjelke = 20 μm. Reprinted fra Wiegreffe et al.> 10 med tillatelse fra Elsevier. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Figur 1
Figur 1: Migreringsadferd av Bcl11a Mutant Upper Layer Cortical Neurons.
( A ) Representative bilder av migrerende GFP-positive neuroner i E16.5 skivekulturer fra Bcl11a flox / flox hjerner elektroporert ved E14.5 med enten Cre-IRES-GFP eller en kontrollvektor over en total bildeperiode på 12 timer. ( B ) Representative spor med 1 timers intervalloppløsning av migrerende GFP-positive nevroner i E16.5 skivekulturer fra Bcl11a floks / flakshjerner elektroporert ved E14.5 med Cre-IRES-GFP eller en kontrollvektor over totale bildebehandlingsperioder avOpptil 22 timer. Bcl11a-mutantneuroner gjennomgår ofte repetitive faser med redusert migrasjonshastighet og tilfeldig forandret orientering (markert med røde pilespisser). ( C ) Hastighetsprofiler beregnet fra spor av migrerende nevroner som vist i B. ( DE ) Kvantifisering av hastighet ( D ) og avviksvinkel fra radial orientering ( E ) av migrerende GFP-positive neuroner i E16.5 skivekulturer fra Bcl11a flom / flom Hjerner elektroporert ved E14.5 med Cre-IRES-GFP eller en kontrollvektor (n = 15). Mean ± sem; Studentens t-test; *** p <0,001. Skalbjelke = 10 μm. Reprinted fra Wiegreffe et al. 10 med tillatelse fra Elsevier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Radial migrasjon er en sentral prosess i utvikling av neocortex. Mutasjoner i gener som påvirker forskjellige trinn i denne prosessen, kan forårsake alvorlige kortikale misdannelser, inkludert lissensfalisering og hvite substans heterotopia 1 , 2 . Vi viste nylig at Bcl11a, som uttrykkes i unge migrerende kortikale projeksjonsneuroner, spiller en rolle i radiell migrasjon. Vi brukte tidsforskjellende konfokal bildebehandling av migrerende nevroner i akutte kortikale skiver av elektroporerte hjerner for direkte å demonstrere at genetisk deletjon av Bcl11a i migrerende nevroner forårsaker polarisasjon og migrasjonsfeil. Time-lapse-serien ble brukt til å spore migreringsbaner for individuelle nevroner og beregne bestemte parametere for migrerende nevroner, inkludert hastighetsprofiler, gjennomsnittlig migrasjonshastighet og migreringsretning 10 .

Denne protokollen beskriver en viktig tilnærming når man studerer molekylerR mekanismer i radial migrasjon. Ved å bruke kort hårnål RNA eller DNA ekspresjon plasmider, kan nesten ethvert gen av interesse bli slått ned eller overuttrykt, henholdsvis. Det er en kraftig tilnærming til å kombinere elektroporasjon med Cre-LoxP-systemet. Transfeksjon av hjerner av betingede mutanter ("floxed") mus med Cre rekombinase genererer en mosaikkmutantsituasjon og tillater selektiv analyse av enkeltmutante nevroner som er omgitt av villtype-celler. På denne måten kan cellens autonome molekylære mekanismer i migrerende nevroner undersøkes. Også funksjonelle redningseksperimenter utføres lett. Forberedelse av time-lapse-serien av elektroporerte hjerneskiver muliggjør dynamisk analyse av migrerende oppførsel av enkeltmigrerende nevroner, som gir mye mer informasjon enn det som kan oppnås fra faste hjerneseksjoner. I utero elektroporasjon 3 , 4 krever opplæring, men - en gang i mesterskap - er aRask og enkel teknikk for å reproduserbart transfektere nevroner i hjernebarken in vivo . I protokollen beskrevet her brukte vi i utero elektroporasjon ved E14.5, da sen-fødte øvre lag neokortiske projeksjonsnekroner er født. For studiet av tidligfødt dyplags projeksjon må nevroner i utero- elektroporasjon utføres på tidligere utviklingsstadium ( dvs. E12.5) 13 . I prinsippet kan protokollen også brukes til å studere migrasjon av andre neuronale subpopulasjoner i hjernen som kan transfekteres med elektroporasjon, inkludert migrasjon av interneuroner 14 og cerebellære granulaceller 15 .

Slice culture protokollen som vi beskriver var tilpasset fra Polleux og Gosh 12 og tidligere, har vi brukt den til ex utero elektroporation 16 , 17 til stuDy hippocampal utvikling. Viktigst, hjerneskiverne må håndteres med forsiktighet gjennom hele prosedyren for å opprettholde deres levedyktighet. Vi bruker et invertert mikroskop og optisk kvalitet glassbunnsretter til å bilde skjærekulturen hviler på en cellekulturinnsats. Denne konfigurasjonen er veldig enkel å sette opp og tillater sterile forhold, siden objektivet aldri kommer i kontakt med skivekulturen eller -mediet. Imidlertid kreves lange arbeidsavstandsmål (> 2 mm) med en tilstrekkelig høy numerisk blenderåpning (0,6 eller høyere). Andre studier har satt hjerneskiven direkte på glassbunnen og brukt en kollagenmatrise 18 , 19 for å fikse skiven på plass, noe som gjør det mulig å bruke mål med kortere fri arbeidsavstand. Imidlertid gir bruk av cellekulturinnlegg enkel å håndtere, reproduserbare resultater, og tillater forskeren å skille stykkene selv 1 til 2 dager etter utarbeidelsen uten coMpromising levedyktighet av hjernen skive (data ikke vist). Et annet kritisk problem er å skade skiver med laserlys. Vi har brukt en svært sensitiv hybriddetektor, noe som tillot oss å redusere laserkraften til et minimum, mens du fremdeles oppnår tilstrekkelige fluorescerende signaler for time-lapse-bildebehandling. Ved å bruke multiphoton-bildebehandling, reduseres fotodamasje ytterligere, og det vil muliggjøre en dypere vevpenetrasjon samt effektivere lysdeteksjon sammenlignet med konvensjonell konfokalmikroskopi.

Til tross for at det er nyttig å studere nevronmigrasjon, har protokollen begrensninger og kan ikke helt bevare situasjonen for migrerende nevroner i den intakte hjernen. Ekstracellulær matrise, de klebende intercellulære kontaktene og vaskulaturen i migrasjonssonen kan dynamisk påvirke radialt migrerende nevroner 20 , 21 . Spesielt er øvre lagsneuroner avhengige av langstrakte radiale glialprosesser forDeres migrasjon 22 . For vellykket bildebehandling er det derfor viktig å velge hjerneskiver med GFP elektroporerte radiale glialceller som forlener prosessene gjennom hele kortikalbredden. "Skrå skiver", der det radiale glialstillaset er blitt avskåret før de når hjernens pialoverflate, bør kastes fra videre analyse. Noen ganger kan celledød forekomme ved hjernen på hjerneskiven, noe som begrenser bildeinnkjøp til dypere område i prøven. Elektroporerte nevroner i dyrkede hjerneskiver kan migrere mindre effektivt sammenlignet med elektroporerte nevroner in vivo , noe som kan være forårsaket av utilstrekkelig utvinning fra preparering. Dette krever analyser av flere skivekulturer for både eksperimentelle og kontroll situasjoner, og kritisk tolkning av representative datasett. I noen tilfeller kan de fornærmelser som er forbundet med utero- elektroporasjon forårsake embryonal død eller strukturelle endringerIoner i hjernen, inkludert utvidede ventrikler, asymmetrisk tynnet cortex, eller en glialærdannelse som resulterer fra DNA-injeksjon. I slike tilfeller skal prøven kasseres fra videre analyse.

Mens hjerneskiver fra embryonale donorer overlever godt på membraninnsatser 23 , er analyser begrenset til tidlige utviklingshendelser, inkludert nevronmigrasjon, og vi har ikke brukt den til å studere senere hendelser, som dendritutvikling eller synaptogenese. Sammendrag gir vi en detaljert protokoll for direkte og dynamisk å studere nevronmigrasjon av elektroporerte nevroner i skivekulturer, som lett kan tilpasses for å analysere funksjoner av gener involvert i nevrodevelopmental lidelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgements

Vi takker Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka og Matthias Toberer for utmerket teknisk assistanse, samt Victor Tarabykin for nyttige diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd fra Deutsche Forschungsgemeinschaft til SB (BR-2215).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
isoflurane Abbott Laboratories  506949 Forene
6-well plate Corning 351146
12-well plate Corning 351143
non-absorbable surgical suture Ethicon K890H 3/8 circle, 13 mm, taper point
Micro Adson Forceps Fine Science Tools 11018-12 serrated, length: 12 cm
fine scissors Fine Science Tools 14063-09 angled to side, length: 9 cm
Mathieu Needle Holder Fine Science Tools 12510-14 tungsten carbide, length: 14 cm
fine tipped forceps Fine Science Tools 11370-40 straight, 11 cm
Vannas Tübingen Spring Scissors Fine Science Tools 15005-08 angled up, 9.5 cm
ring forceps Fine Science Tools 11103-09 OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm
HBSS (10X) Gibco 14180046
L-Glutamine Gibco 25030081
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
horse serum Gibco 26050088
BME Gibco 41010026
borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus 30-0016 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm
anesthsesia system Harvard Apparaus 72-6471
anesthetizing chamber Harvard Apparaus 34-0460
fluosorber filter canister Harvard Apparaus 34-0415
low melting point agarose Invitrogen 16520100
vibrating blade microtome Leica VT1200 S
fluorescence stereo microscope Leica M205 FA
stereo microscope Leica M125
inverted fluorescence tissue culture microscope Leica DM IL LED
confocal laser scanning microscope Leica TCS SP5II
hybrid detector Leica HyD
objective, 40x/0.60 NA Leica 11506201
microscope temperature control system Life Imaging Services Cube, Brick & Box
cell culture insert Millipore PICM0RG50
microgrinder Narishige EG-45 use 38° angle for beveling
microinjector Parker Hannifin  052-0500-900 Picospritzer III
carprofen Pfizer Animal Health NDC 61106-8507 Rimadyl
emdedding mold Polysciences 18986-1
endotoxin-free plasmid maxi kit Qiagen 12362
fast green Sigma F7252
laminin Sigma L2020
poly-L-lysine Sigma P5899
HEPES Sigma H4034
D-glucose Sigma G6152
calcium chloride Sigma C7902
magensium sulfate Sigma M2643
sodium bicarbonate Sigma S6297
square wave electroporator Sonidel CUY21EDIT
tweezers with 5 mm platinum disk electrodes Sonidel CUY650P5
micropipette puller Sutter Instrument P-97
box filament Sutter Instrument FB255B 2.5 mm x 2.5 mm
micro-spoon spatula VWR 231-0191 185 mm x 5 mm
glass bottom dish, 50 mm World Precision Instruments FD5040-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
  2. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139, (9), 1535-1546 (2012).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, (1), 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, (4), 865-872 (2001).
  5. LoTurco, J. J., Bai, J. The multipolar stage and disruptions in neuronal migration. Trends Neurosci. 29, (7), 407-413 (2006).
  6. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, (2), 136-144 (2004).
  7. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23, (31), 9996-10001 (2003).
  8. Pacary, E., et al. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69, (6), 1069-1084 (2011).
  9. Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Medical Molecular Morphology. 49, (2), 63-75 (2016).
  10. Wiegreffe, C., et al. Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c. Neuron. 87, (2), 311-325 (2015).
  11. John, A., et al. Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development. Development. 139, (10), 1831-1841 (2012).
  12. Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), pl9 (2002).
  13. Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity. Nat Rev Neurosci. 14, (11), 755-769 (2013).
  14. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
  15. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
  16. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  17. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31, (13), 2922-2936 (2012).
  18. Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice. J Neurosci. 29, (49), 15520-15530 (2009).
  19. Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4, (2), 143-150 (2001).
  20. Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 21, (7), 1465-1474 (2011).
  21. Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i32-i41 (2009).
  22. Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128, (1), 29-43 (2007).
  23. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics