Ex vivo nervus Slice kultur fra embryonale GFP-uttrykker mus for time-lapse Imaging av nervus nerve utvekst

Denne protokollen tillater oss å identifisere axon veiledningsveier som er aktive i oculomotornerven og å vurdere sine roller på forskjellige punkter langs nervebanen i sanntid. Denne teknikken bevarer de lokale miljøene gjennom hvilke aksoner reiser og deres endelige mål. De voksende aksonene er ikke kuttet, så innledende aksonvekst, i stedet for regenerering, kan vurderes.

Denne metoden gir innsikt i axon veiledning i okulær motorsystemet, men kan tilpasses studiet av axon veiledning av andre nerver. Denne teknikken tar praksis for å mestre, og å jobbe raskt er ekstremt viktig. Når du prøver det for første gang, bruk bare noen få embryoer, i stedet for et helt kull.

Før du begynner prosedyren, må du først bekrefte graviditeten ved ultralyd på embryonisk dag 10,5 fra en tidsstet parring. Høst embryoene, spray magen til den gravide musen med 70% etanol, og bruk saks for å åpne bukhulen for å trekke ut livmoren. Vask livmoren i en petriskål med iskald HBSS før du plasserer orgelet i en annen petriskål med frisk iskald HBSS.

Under et dissekeringsområde fjerner du embryoene fra livmorhornet og deres individuelle fostersekker, plasserer hvert embryo på undersiden av lokket på en 12-brønns tallerken, på is, da de høstes. Bruk filterpapir for å fjerne væske rundt hvert embryo, uten å berøre embryoene selv, og senk embryoene i flytende 4% lavtsmeltende agarose. Legg platelokket på isen for å størkne agarose.

Når agarose har herdet, snu embryoene og dekk den andre siden av hver prøve med ekstra agarose. Når det andre volumet av agarose har størknet, bruk et fluorescensspisseksjonsmikroskop for å trimme agarose rundt hvert embryo slik at hvert embryo vil bli orientert riktig på vibratomstadiet. Oculomotorkjerner og tidlig aksonvekst bør være fluorescerende.

Juster hvert embryo slik at kjernen, utvoksende aksoner og øye danner en linje, og bruk et barberblad for å trimme agarose parallelt med denne linjen. Fyll deretter vibratomkammeret med iskald skivebuffer, og superlim det første embryoet til vibratomstadiet slik at bladet vil være parallelt med oculomotorkjernen og øynene. Når superlimet er tørt, senk vibratomestadiet slik at embryoet er orientert vendt bort fra bladet, og bruk et nytt vibratomblad for å oppnå 400-til 450-mikrometerskiver.

Bruk en steril overføringspipette til å overføre hver skive til kald kuttbuffer når den anskaffes, og bruk fluorescensspissende mikroskop til å velge skiven som inneholder oculomotorkjerner og øyne. Bruk en steril overføringspipette til å overføre skiven til en cellekulturinnsats i en seksbrønnsplate som inneholder 1,5 milliliter kulturmedium per brønn, og plasser platen i en 37-graders Celsius inkubator. Fjern rester agarose fra vibratom scenen, og superlim neste embryo på scenen, fortsetter å samle skiver til alle embryoene er seksjonert og belagt.

Tilsett deretter riktig konsentrasjon av inhibitoren eller rekombinant molekyl av interesse, fortynnet i et passende løsningsmiddel, til mediet for hver brønn. Opprett en doseresponskurve. Bilde skivene hvert 30.

Under normal utvikling av utero når de første grønne fluorescerende proteinpositive oculomotoraksonene banen ved embryonisk dag 11,5 før de forgrener seg til sine endelige mål, som observert i denne representative skivekulturen. Orienteringen av skiven på vibratomestadiet er avgjørende, da skivene ikke kan tolkes hvis de ikke er riktig orientert. For eksempel, hvis embryoet er vippet til siden, vil bare en oculomotorkjerne bli observert i skiven.

Hvis det innebygde embryoet vippes for langt mot ryggen, vil øynene ikke være tilstede i skiven, og i stedet kan øvre lem og bakbrain eller ryggmarg være inkludert. Det er også viktig å ta vare på at under plasseringen av skiven på kulturmembranen, at vevet ikke blir brettet. Vær forsiktig når du løser opp hemmere og vekstfaktorer i organiske løsemidler.

For eksempel, i dette eksperimentet døde skiven etter tilsetning av etanol til mediet. Husk å holde alt på is og for å minimere tiden mellom ekstraksjon av embryoene og plassere skivene i inkubatoren. Ved hjelp av denne teknikken har vi begynt å identifisere flere axon veiledningsmekanismer på jobb i det okulære motorsystemet.

Husk å være forsiktig når du arbeider med barberblad, og at noen inhibitorer kan være farlige og bør håndteres nøye i henhold til deres sikkerhetsprofiler.