Количественные иммунофлюоресценции для измерения глобального локализованный перевод

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Эта рукопись описывает метод для визуализации и количественно локализованное события субцеллюлярные отсеков. Подход, предложенный в этой рукописи требует базовой конфокальный тепловизионные системы и реагенты и быстрое и экономически эффективным.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bergeman, J., Huot, M. É. Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation. J. Vis. Exp. (126), e55909, doi:10.3791/55909 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Механизмы, регулирующие перевод мРНК участвуют в различных биологических процессах, например зародышевой линии развития, дифференцировки клеток и органогенез, а также в нескольких заболеваний. Многочисленные публикации убедительно показали, что конкретные механизмы плотно регулировать перевод мРНК. Повышенный интерес в перевод индуцированной регуляции экспрессии белков привело к разработке новых методов изучать и следовать de novo белка синтеза в cellulo. Однако большинство этих методов являются сложными, что делает их дорогостоящей и зачастую ограничивает количество мРНК-мишеней, которые могут быть изучены. Эта рукопись предлагает метод, который требует только основные реагенты и конфокальный флуоресценции тепловизионные системы измерения и визуализировать изменения в переводе мРНК, которые происходят в любой ячейке линии при различных условиях. Этот метод был недавно используется локализованный перевод в внутриклеточных структур адэрентных клеток за короткий период времени, таким образом предлагая возможность визуализации de novo перевода короткий период во время различных биологических процессы или проверка изменений переводческая деятельность в ответ на конкретные стимулы.

Introduction

Правила перевода различных клеточных функций побудило многие исследовательские группы для разработки новых инструментов и методов для определения субцеллюлярные локализации перевод мРНК и регулируемых белка синтез1,2 ,3,4. Эти последние технологические достижения позволяют добиться более глубокого понимания механизмов, связанных с переводом upregulation или репрессий конкретные мРНК в биологических процессах, например развития нервной системы, ответ наркотиков и метастазов5 ,6,,78. Однако большинство из этих методов требуют дорогих или опасных реагентов и специального оборудования, которые не могут быть доступны для большинства лабораторий. Таким образом был разработан эффективный метод для быстрой оценки перевод событий специально обойти эти потенциальные проблемы. Этот метод обнаруживает острый трансляционная модуляций, которые происходят во время конкретных клеточных процессов, а также позволяет для локализации перевода с помощью конфокальной микроскопии.

Описанные здесь методы были использованы для мониторинга локализованный перевод в течение субцеллюлярные отсеков под названием распространяя возбуждение центров (SIC)5. Шиц являются переходных структур, обнаруженных в сеяный клеток, которые локализуются на вершине зарождающейся адгезии комплексов. Хотя Шиц и адгезии комплексы отличаются друг от друга, их судьбы тесно связаны. Действительно SICs известны постепенно исчезают после фокуса адгезии комплекс созревания в сайт адгезии на начальном этапе адгезии. Мы обнаружили, что RNA-связывая протеинов, известный специально контролировать мРНК перевода (например, Sam68, FMRP и G3BP1) и polyadenylated, РНК обогатились в рамках этих структур5. С помощью методов, описанных здесь, мы показали, что регулирование SIC-связанные мРНК, перевод действует как КПП позволяет посеян клетки для консолидации клеточной адгезии. Этот метод, основанный на puromycin включения, можно считать адаптированную версию поверхности зондирования перевод пробирного (закат). Первоначально разработанный для измерения скорости синтеза глобального белка с помощью радиоактивно обозначенные аминокислоты, протеин puromycilation предлагает эффективный способ визуализации белка de novo синтеза9. Этот метод полагается на внутренние поведение puromycin, антибиотик, который блокирует перевод через прекращение преждевременной цепи в рибосома10. Действительно puromycin структурно аналогичен тирозил тРНК, который позволяет для включения в удлинения пептидные цепи через образование пептидных связей. Однако puromycin привязки к растущей цепи пептида предотвращает формируется с следующей аминоацил тРНК, так как puromycin не hydrolysable Амид облигаций вместо hydrolysable Эстер Бонд в tRNAs нового Бонда пептид. Таким образом включение puromycin в удлинения полипептиды приводит к преждевременной выпуска многочисленных усеченная puromycilated полипептиды, соответствующий активно переводится мРНК9,11,12 .

С помощью этого метода, можно было оценить активный перевод в течение короткого времени вдова (например, 5 минут) во время клеточной адгезии с использованием специфического антитела, направленные против puromycin на клетки, которые были дополнены антибиотика для периодов 5-мин в точках в разное время в ходе процесса адгезии клеток5. Точность этот assay полагается на весьма специфические антитела, направленные против puromycilated группу. Immunofluorescent обнаружения puromycilated полипептида обеспечивает общий субцеллюлярные передел недавно переведенные мРНК, которые также могут быть количественно с большой точностью с помощью конфокальной систем тепловидения.

Следовательно этот метод предлагает соответствующую опцию для большого числа лабораторий, изучая трансляционная регулирующих механизмов, участвующих в процессах таких нейронов грануляции6,13,14, 15, morphogen мРНК локализации и перевода во время развития16,17. Это также хорошо подходит для изучения локализованных или разобщенным перевод во время быстрого биологических событий, например миграции клеток, адгезии или вторжения, или просто оценить медикаментозного лечения, которые могли бы побудить поступательные изменения5, 7 , 18. в целом, этот метод позволяет для визуализации событий локализованных или контролируемых перевод в быстрый, точный и экономически эффективным способом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Определение Puromycilation условия

Примечание: Этот метод описывается метод, используемый для оценки локализованный перевод во время процесса адгезии MRC-5 клеток 5. Как puromycilation может быть сделано в любой ячейке, важно оптимизировать puromycilation условий для конкретных клеточных линий, которые будут использоваться, потому что условия лечения не являются идентичными для каждой ячейки строки с точки зрения концентрации puromycin и желаемого Время инкубации. Чтобы показать, каким образом определяются эти условия, с увеличением концентрации puromycin для различных инкубации раз лечили три примера клеточных линий (т.е., HeLa, MRC-5 и да-7) ( рис. 1).

  1. Растут идентичные количество клеток в 24-ну пластины в 0,5 мл соответствующий полный культуры среднего 16 h до испытания. Семян 30000 MRC-5 клеток, 50000 НеЬа клетки или 50000 ха-7 ячеек на хорошо. Убедитесь в том избежать превышения 60-70% слияния (рис. 1A).
  2. Подготовка 6 трубок с 1,5 мл полного ячейки питательной среды с увеличением концентрации puromycin (0, 5, 10, 15, 20 и 30 мкг/мл). Предварительно теплой температуре 37 ° C.
  3. Для каждой концентрации puromycin среды (подготовленные в шаге 1.2), передачи 0,5 мл от каждой трубки в 6 новых труб и добавьте циклогексимида в конечной концентрации 50 мкг/мл все 6 новой трубы. Предварительно теплой температуре 37 ° C.
  4. Изменения в среду с 0,5 мл полной питательной среды (строки 1 и 2). Для третьей строки, добавить 0,5 мл полной питательной среды, дополнена 50 мкг/мл циклогексимида ( рис. 1B).
    Примечание: Циклогексимида лечения был создан как лучший отрицательный контроль для белка puromycilation из-за его способность блокировать перевод удлинения. Потому что puromycin включения требует перевода удлинение, циклогексимида лечения приводит к потере puromycilated белка сигналов 5 , 18.
  5. Инкубируйте 15 мин при 37 ° C (5% CO 2).
  6. Добавить 0,5 мл puromycin среды в шаге 1.2 на второй строке готовы получить окончательный концентрации 0, 2.5, 5, 7,5, 10 и 15 мкг/мл, соответственно, в колонках A, B, C, D, E и F. В то же время, добавить 0,5 мл puromycin дополнены циклогексимида средний (шаг 1.3) в третьей строке ( рис. 1 c).
  7. Инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C (5% CO 2).
  8. Добавить 0,5 мл среды puromycin, подготовленный на шаге 1.2 в первой строке для получения окончательного концентрации 0.0, 2.5, 5, 7,5, 10 и 15 мкг/мл ( рис. 1 c).
  9. Инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C (5% CO 2).
  10. Мыть каждый хорошо от строки 1-3 с 1 мл ледяной 1 X фосфат амортизированное солевой раствор (PBS) 5 мин после того из puromycin скважин первой строки (мыть дважды). 75 мкл буфера 1 X Laemmli (4% лаурилсульфат натрия (SDS), 4% 2-меркаптоэтанол, 0.120 Tris-HCl M pH 6.8, 0,004% бромфеноловый синий и 10% глицерина) для получения всего-lysates клетки для каждого условия.
  11. Запуск 10% SDS-Полиакриламид гель-электрофорез (SDS-PAGE) с использованием 1/3 подготовленных образцов для оценки puromycin включения.
    1. Определяют уровень puromycin включение на Вестерн-блот анализ с использованием анти puromycin антитела (12 D 10) разводят в соотношении 1: 25000 в основное антитело инкубации буфер (2% бычьим сывороточным альбумином (БСА)) и 430 мм NaCl, 10 мм трис рН 7,4, 0.01% Азид натрия).
      Примечание: Представитель изображения, соответствующие линии различных клеточных экстрактов, как описано в шаге 1 приведены в качестве примера на рис. 2.

2. В Cellulo Локализованный перевод визуализации

Примечание: метод, описанный здесь была использована для оценки локализованный перевод в пределах SICs MRC-5 клеток во время процесса адгезии 5. Хотя здесь используются MRC-5 клетки, другие клеточные линии может использоваться с той же методологии, описанной в шаге 2.1.

  1. Клетки подготовки.
    1. Отсоединить MRC-5 клеток с использованием 0,25% трипсина/2.21 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в Хэнк ' s сбалансированный соли раствора (HBSS). Пелле клетки центрифугированием (5 мин на 200 x g) в 15 мл конические пластиковых пробирок и приостановить их в Дульбекко ' s Modified Eagle среднего (DMEM) дополнены 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) на 40 000 клеток/мл после подсчета с Счетной палатой.
    2. Инкубировать подвесной клетки при 37 ° C под нежным вращения с помощью трубки ротатор для 20 мин для поддержания их во взвешенном.
      Примечание: Этот шаг очень важен для полной диссоциации фокуса адгезии комплексов.
    3. Плита 2 мл взвешенных MRC-5 клеток (40 000 клеток/мл) в два 35-мм стекло дно блюда. Используйте первое блюдо 35-мм стекло дно для puromycilation анализа (см. шаг 2.1.5) и использовать второй как отрицательный контроль (см. шаг 2.1.6).
    4. Сохранить клетки при 37 ° C (5% CO 2) 55 мин для клеточной адгезии и формирования SIC.
    5. Puromycin добавить на носитель в 35-мм стекло дно блюда (проба) с использованием концентрации, ранее определенных в разделе 1. Для лечения MRC-5 ячеек, используйте 10 мкг/мл puromycin 5 минут при 37 ° C (5% CO 2).
    6. Как отрицательный контроль, добавить циклогексимида второе блюдо 35-мм стекло дно 40 мин после посева клетки предварительно относиться к ним с 50 мкг/мл циклогексимида ( рис. 2B). Затем, 15 мин после добавления циклогексимида, добавить puromycin на носитель, используя то же концентрации и инкубации время как шаг 2.1.5 (например, использование 10 мкг/мл puromycin 5 минут при 37 ° C (5% CO 2) для MRC-5).
    7. Мыть каждой пластины дважды с 2 мл ледяной 1 X PBS и исправить клетки с 1 мл 4% формальдегида (разводят в 1 X PBS) 15 мин при комнатной температуре (RT).
      Предупреждение: Параформальдегида должен использоваться строго в химической Худ.
  2. Иммуноокрашивания.
    1. После фиксации параформальдегида, мыть три раза с 2 мл ПБС и проинкубируйте 20 мин на RT для разрушения клеток в 500 мкл PBS-TritonX-100 (0,5%).
    2. Для предотвращения неспецифических антитела связывая, блокировать образца с 500 мкл PBS – BSA (1%), 20 мин на RT.
    3. Вымойте три раза с 2 мл PBS-Tween20 (0.1%) и проинкубируйте с 300 мкл 1:12,500 анти puromycin антитела (12 D 10) разводят в 1 X PBS для 1 h на RT.
    4. Мыть 3 раза с 2 мл PBS-Tween20 (0.1%) и проинкубируйте с 300 мкл анти мыши IgG проспряганное Флюорофор (здесь, 488 нм) разводят в PBS для визуализации puromycilated полипептиды и с конъюгированных Фаллоидин в другой Флюорофор (здесь, 555 Нм) чтобы визуализировать F-миозина. Инкубировать 1 час на RT.
    5. Мыть три раза с 2 мл PBS-Tween20 (0.1%) и затем Инкубируйте 5 мин на RT в 300 мкл PBS-Tween20 (0.1%) дополнены 1 мкг/мл 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
    6. Мыть в три раза с 2 мл PBS-Tween20 (0.1%), а затем вымыть с 2 мл ПБС. Предотвратить клетки от высыхания, сохраняя образца в 2 мл ПБС во время захвата изображений в.

3. Immunofluorescent получение изображения

Примечание: следующая методология может использоваться с любой коммерчески доступных конфокальный съемочной системы.

  1. Определить соответствующие параметры для каждой Флюорофор увеличить динамический диапазон для квантификации.
    Примечание: Представитель количественной оценки могут быть получены только если избегать насыщения пикселей и порог сигнала регулируется должным образом. Эти настройки могут быть достигнуты путем тщательно регулировки мощности лазера, высокого напряжения (ВН), получить, и смещение.
    1. Отрегулируйте масштаб фактор (5 X) и количество пикселей (512 x 512) оптимизировать размер пикселя.
      Примечание: Это должно быть по крайней мере в 2.3 - раз меньше, чем оптическое разрешение, в соответствии с теоремой Найквиста.
    2. Снизить скорость сканирования (12,5-20 µs/пиксель) и использовать усреднения (2 - 3 раза) для улучшения соотношения сигнал шум согласно настройкам, упомянутых выше.
  2. Вручную определить соответствующий верхней и нижней фокальной плоскости вдоль оси z с размером оптимальный шаг (0,4 мкм/ломтик).
    Примечание: Шаг размер плоскости определяется осевой резолюции, разделенных 2.3, в соответствии с теоремой Найквиста. Как правило, 20-25 слоев необходимо покрыть всю ячейку глубина адэрентных клеток.
  3. Получить конфокальное изображение всего одну ячейку с 60 X плана АПО масло погружения цель (1,42 числовая апертура).

4. Immunofluorescent изображение количественной оценки

  1. Определение обогащения.
    1. Открыть изображение, соответствующее z плоскости слоя интерес из файла данных приобретенных ячейки, используя ImageJ программное обеспечение (freeware доступны на http://fiji.sc).
    2. Нарисовать линию с помощью инструмента рисования линии (панель инструментов → прямой) через регионы ячейки, где пожелана количественной оценки. Изменить ширину линии, дважды щелкнув на " прямо; " значения интенсивности будет среднем через ширина линии (8 на рис. 3).
      Примечание: Тонкие линии предпочтительнее избежать дублирования сигналов от разных структур.
    3. После линии правильно установлен, профиль сигнала плотность вдоль оси определяется (меню → анализ → участок профиля).
      Примечание: Будет открыто новое окно который показывает профиль соответствует интенсивности сигнала для каждого пикселя выбранного канала (конкретные Флюорофор) вдоль линии для выбранного раздела z самолет.
      1. Повторите процесс для каждого канала, соответствующее Флюорофор используется (то есть, один квантификации для 488, один для 568 и один для 405).
        Примечание: Значение интенсивности сигнала будет всегда быть заказаны после ориентацию линии нарисованные.
    4. Для получения численных значений серым для каждого пикселя профиля соответствующей количественной выбранного слоя z самолет, скопируйте данные профиля (меню в окне изображения → копию) и вставьте его в любое программное обеспечение электронной таблицы.
    5. 4.1.1-4.1.4
    6. повторите шаги для каждой плоскости z раздел приобретенных конфокальное изображение и каждый канал, где пожелана квантификации.
      Примечание: Количественная оценка различных слоев в плоскости z можно объединить для получения общей оценки специальных обогащения сигнала путем расчета суммы значение каждого пикселя вдоль линии для каждого слоя z самолет. Этот тип объединения может быть достигнуто только в том случае, если линия идентичен для каждого слоя z самолет, включены в средние значения.
    7. Качестве альтернативного метода для количественной оценки поклеточного различных каналов с большим количеством слоев, используйте макрос называется StackprofileData (см. Дополнительный файл).
      Примечание: Этот макрос доступен свободно на https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt и могут быть использованы следующим образом:
      1. Вставить макрос в текстовый файл и сохраните его.
      2. Открыть файл изображения, который включает все конфокальный слои клеток.
      3. Нарисовать линию, как описано в шаге 4.1.2, откройте новое окно для импорта макрос (меню → плагины → макросы → запустить), выберите ранее сохраненный текстовый файл, соответствующий макрос StackprofileData и нажмите " открыть. "
        Примечание: После ввоза макрос, новое окно с именем " результаты " откроет все и количественной вдоль оси определяется для каждого слоя в плоскости z, будут перечислены канал присутствует в файлах изображений.
      4. Копирования данных для каждого канала (меню → редактировать → копия) для получения представления графический профиль, соответствующий сигнал количественной. Вставьте его в любое программное обеспечение электронной таблицы. Рассчитайте сумму значение каждого канала для каждого пикселя вдоль линии для каждого слоя в плоскости z. Использовать эти значения для создания графическое представление аналогично представленному на рисунке 3.
  2. Количественная оценка сигнала сотовой участком или объем.
    1. Открыть файл изображения с программным обеспечением ImageJ.
    2. Нарисовать область для обозначения области интересов, используя функцию геометрической формы (панель инструментов → " прямоугольник, " " овал, " или " полигона ").
      Примечание: Значение количественной оценки будет определяться для области соответствующим обращается форме.
    3. Настроить уровень порог чтобы избежать любого фонового сигнала (меню → настроить изображение → порог); представлять интенсивности пикселей в форме гистограммы появится новое окно. Измените значения для включения/исключения пикселей в количественной оценке с помощью ползунка. Выберите порог, который устраняет красные пиксели вне клетки, как пикселей, выделены красным цветом будут включены в квантификации.
    4. Определить параметры измерения для количественного определения пиксела сигнала внутри выделенной области, без фонового сигнала (меню → анализ → набор измерений) и не забудьте проверить " предел порогового значения " и " интегрированных плотность " коробки.
    5. Измерения количественных значений для выбранной области (меню → анализ → мера).
      Примечание: Количественная оценка интенсивности сигнала будет представлена в новом окне под " IntDen " идентификации, который представляет собой продукт средние значения серого и количество пикселей в выбранной области.
    6. Нарисовать область, которая включает в себя всю ячейку с помощью геометрической формы (панель инструментов → " прямоугольник, " " овал, " или " полигона ") и приступить к 4.2.3-4.2.5 шаги, чтобы получить значение, соответствующее общего сигнала. Рассчитать отношение сигнала в пределах выбранной области за весь сигнал для получения процентов сигнала в пределах области интересов.
    7. 4.2.2-4.2.6 повторить шаги для получения количественной оценки объема клетки для каждой плоскости z. Адаптировать геометрической формы, при необходимости.
    8. Скопируйте данные получены из " результаты " windows для каждого слоя плоскости z в электронную таблицу для графическое изображение и найти среднее значение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Точно соблюдать перевод событий с помощью puromycin включения, важно, чтобы определить оптимальные условия для каждой ячейки строки, потому что каждый показывает различные puromycin включения кинетика (рис. 1)9,11 ,12,18. Таким образом, чтобы проверить включение puromycin, это необходимо для лечения линии нужной ячейки с стандартизированных спектр увеличения концентрации puromycin (1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0 и 15,0 мкг/мл) для различных периодов времени (5-10 мин). Чтобы оценить локализованное или раннего реагирования к медикаментозному лечению, является более короткое время инкубации предпочтение (например, менее чем за 5 минут), поскольку она позволяет для прямой оценки трансляционного событиях непосредственно после специфического лечения. В идеале сигнал puromycin должно быть легко обнаружить, но следует также избегать насыщения (рис. 2). Как показано на рисунке 2 (левой панели), приемлемым puromycin концентрация составляет 7,5-10.0 мкг/мл для MRC-5 и HeLa, тогда как 5.0-7.5 мкг/мл puromycin предлагается ха-7. Оптимизация параметров экспериментальной важно, потому что цель данного метода является не полностью подавляют все поступательные удлинение на данный момент посвящения, но тег вновь синтезированный полипептидных цепей во время трансляции для выявления острого вариации в переводе. Этот первоначальный этап в протоколе не должно быть наличие пренебречь, как чрезмерное puromycin и время длительного лечения вызовет серьезные нежелательные последствия. Как отмечалось в рисунке 2 (в правой панели), клетках, обработанных за 10 мин с высоким puromycin концентрация будет генерировать главным образом мелких puromycilated полипептиды (например, да-7, 7.5 мкг/мл или более 10 мин). Эти небольшие полипептиды будет диффузный более быстрыми темпами в ячейке, которая может мешать точной оценке субцеллюлярные локализации. Другая проблема заключается, что увеличение протеолиза происходит после лечения чрезмерного puromycin19. Этот результат наблюдался в MRC-5 и HeLa клетках, обработанных за 10 мин, который показал снижение сигнала интенсивности в присутствии 10 или 15 мкг/мл puromycin. Оба эти явления вводят в заблуждение, если включение puromycin оценивается иммунофлюоресценции потому, что предотвращает увеличение распространения точной визуализации перевод локализации, puromycin-деградации значительно уменьшается, в то время как -чувствительность обнаружения. Эти нежелательные последствия легко избежать, правильно определив оптимальные экспериментальных условиях, как описано в разделе 1 этого протокола.

При визуализации puromycin включения, также важно для выполнения надлежащего контроля. Как показано на рисунке 3A, puromycin включение может быть эффективно заблокирован добавлением 50 мкг/мл циклогексимида, известный для ингибирования перевод удлинение20 и, таким образом, включение puromycin соединение. Это поведение показано на рисунке 3B, который показывает, что циклогексимида лечение эффективно предотвратить большую часть сигнал, соответствующий puromycin включения в адэрентных клеток MRC-5. Действительно в то время как puromycilated пептиды могут быть визуализированы в клетках, обработанных с puromycin только, слабый сигнал обнаружен в клетках, которые лечили также циклогексимида в одинаковых условиях окрашивание. Кроме того другой антибиотик (анизомицина) может также использоваться как отрицательный контроль, как он имеет возможность блокировать peptidyl трансферазы деятельности5 и было показано, быть максимально эффективной циклогексимида на блокирование инкорпорации puromycin5 ,18

После приобретения immunofluorescent изображение можно оценить общий локализации puromycilated полипептиды, соответствующий вновь синтезированный белков (рис. 4). Слои изображения выбираются на разных глубинах в пределах адэрентных клеток, позволяя интенсивности сигнала в субцеллюлярные отсеках должны оцениваться в различные ячейки плоскостях. Таким образом можно сравнить локализованных puromycilation реакции в нижней части клетки (рис. 4A), в середине ячейки (рис. 4B), или в верхней части ячейки (рис. 4 c). Расположенный чуть выше структур зарождающегося и созревания адгезии, SICs основном наблюдаются в середине ячейки. Как ожидается, интенсивный puromycilation обнаруживается в Шиц, о том, что перевод мРНК изолированы от этих внутриклеточных структур. Как упоминалось ранее, это возможно для сравнения интенсивности сигнала по желаемой оси. Это сравнение возможна только если изображения, полученные не включают насыщенных пикселей, которые появляются красные в изображение в градациях серого (второй панели сверху), полученных с помощью микроскопа, эксплуатации программного обеспечения. Эти изображения могут быть импортированы в ImageJ программного обеспечения для количественной оценки и анализа интенсивности пикселей по назначенным оси. Количественная оценка пикселей может быть графически представлен (средняя группа) для иллюстрации интенсивности относительных пикселей на назначенных позициях вдоль оси. Пристальный взгляд на вставки в верхней панели показывает SIC-актина границы (в красном) и зеленый сигнал в рамках структуры, которая соответствует высокоактивный перевод событий, которые обогащаются в этих структурах (нижней части). Хотя этот метод количественной оценки является не лучшим способом определить точный процент общего перевода, происходящих в этих структурах, это визуально информативным, позволяя для быстрой оценки интенсивности сигнала и хорошее приближение распределения сигнала всей ячейки.

Для получения количественных распределения сигнала на протяжении всей ячейки, следует использовать другой метод. Как показано на рисунке 5, одним из ключевых шагов является для обозначения областей интересов, которые должны быть количественно для каждой плоскости z, составляющих конфокальный графические файлы. Это назначение может быть достигнуто с помощью различных инструмента рисования в ImageJ. С помощью этого метода, вполне возможно определить одну область или несколько областей, которые можно затем сравнить, вычитается или даже компиляции. Основные трудности заключаются в том, чтобы: (i) найти оптимальный изображений условия, избежать насыщения пикселей и фонового сигнала, которые могут искажать количественное значение полученного сигнала и (ii) создание оптимальной калибровки порога в ImageJ. Предполагая, что оба эти условия являются оптимальными, этот метод количественной оценки высокую воспроизводимость оставаясь легким для выполнения. До приобретения изображений также важно тщательно определить нижнего и верхнего пределов z самолеты ячейки, выбранные для количественной оценки. В случае, представлены на рисунке 4в нижней части соответствует резолюции предел цели, которая часто включает в себя, загрязняя затухающих флуоресценции, который может уменьшить соотношение сигнала SIC/клеток тела. Как упоминалось ранее, SICs участвуют в адгезии сайт формирования и созревания; Таким образом SIC структуры расположены чуть выше вновь образуя комплексы адгезии, которая исключает затухающих флуоресценции из нижних слоев. Таким образом сигнал puromycilation SIC-прыгните едва видны в нижней секции, в то время как мы можем четко obsЭрве это в средней секции, объясняя увеличение соотношения между объемом SIC/клетки тела сигнал в регионе среднего по сравнению с нижней или верхней плоскости.

Figure 1
Рисунок 1. Экспериментальное представление оптимизация лечения puromycin, описанных в разделе 1.
(A)
24-ну представление клеток, отобранный для эксперимента (шаг 1.1). (B) схематическое представление шаг 1.4 показаны средние изменения в строках 1 и 2 пластины 24-Ну и добавлением циклогексимида (CHX) для каждой скважины третьей строки для конечной концентрации 50 мкг/мл. Схематическое представление (C) puromycin лечения во второй и третьей строках (шаг 1.6) 15 мин после шага 1.4. Схематическое представление (D) puromycin лечения в первой строке (шаг 1.8) 5 мин после шага 1.6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Определение оптимальных условий для включения puromycin.
Западный анализ помаркой целом-ячейки извлечь от (A)MRC-5, да-7 (B) и (C) клетки HeLa, инкубировали с увеличением концентрации puromycin (0, 2.5, 5, 7,5, 10 и 15 мкг/мл) в течение 5 мин (левой панели) или 10 мин (справа панели). Puromycilated пептиды были обнаружены с помощью антитело против puromycin. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
На рисунке 3. Ингибирование puromycilation с помощью циклогексимида.
(A)
иммуноблоттинга показаны действие циклогексимида на 5-мин puromycilation assay. Эффективность регистрации в MRC-5, да-7 и клетки HeLa после Мока (PBS 1 X) или циклогексимида лечения. (B) конфокальное изображение показывает действие циклогексимида на включение puromycin. MRC-5 клетки были предварительно обработанных с PBS (макет) или циклогексимида 15 мин и затем дополнена 10 мкг/мл puromycin + PBS 1 X (левая панель) или были обнаружены 10 мкг/мл puromycin + 50 мкг/мл циклогексимида (правая панель) для 5 минут Puromycilated белков использование антител против puromycin (зеленый). F-актина был обнаружен с помощью Фаллоидин (красный), и ядро был запятнан DAPI (синий). Вставки справа соответствует 2,5 крат белой коробки. Бары = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4. Количественная оценка переводческая деятельность в SICs адэрентных клеток MRC-5.
(A-C)
Представитель конфокальное изображение адэрентных клеток MRC-5 обрабатывают 10 мкг/мл puromycin 5 мин. Представленные изображения соответствуют нижней (A), средней (B)и верхней части (C) клетки. Верхней панели показывают puromycilated белков, обнаруженные с помощью антитело против puromycin (зеленый). F-актина был обнаружен с помощью Фаллоидин (красный), и ядро был запятнан DAPI (синий). Вставки на права соответствуют 2 x увеличением белой коробке. Бары = 10 мкм. Средней панели показывают отсутствие насыщенных пикселей, которые будут выделены красным цветом. Нижней панели показывают графическое представление puromycilated белка обогащения в адэрентных клеток MRC-5 путем сравнения интенсивности сигнала для puromycin (зеленый), F-актина (красный) и DAPI (синий) вдоль оси ячейки обозначается белой стрелкой. (D-F) Представленные изображения соответствует 4.4 x увеличение Вставка Шиц, представленные в (A-C). Количественная оценка показывает на границе SIC (красные пики: актина), а также локализованный перевод в пределах SICs (зеленые вершины: puromycin) в низкие (D), средний (E), и верхних регионах (F) клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5. Количественная оценка поклеточного сигнал puromycilated белков в адэрентных клеток MRC-5.
(A)
определение сигнала в различных областях нижней плоскости z слоя адэрентных клеток MRC-5. (Левая панель) Выбор района, (I), охватывающих всю совокупность клеток для получения количественных значение, соответствующее общее сотовым сигналом для этого слоя z самолет. (Средний панель) Выбор области сотовой, соответствующие ядра и цитоплазмы часть, которая не включает в себя НИЦ (II). (Правая панель) Визуализация области, соответствующей SICs (III) путем вычитания значения, полученные из района II из значения, полученные для всей ячейки (область I). Бары = 10 мкм. (B) значения количественных пикселей для каждой области перечислены в таблице для изображения изображающие выбор области в (A), а затем график, показывающий доля (%) сигнала в Шиц. (C) определение сигнала в различных областях середины слоя плоскости z адэрентных клеток MRC-5. (Левая панель) Выбор области (I), охватывающих всю совокупность клеток для получения количественных значение, соответствующее общее сотовым сигналом для этого z плоскости слоя. (Средний панель) Выбор области ячейки, соответствующие ядра и цитоплазмы часть, которая не включает в себя НИЦ (II). (Правая панель) Визуализация области, соответствующей SICs (III) путем вычитания значения, полученные для области II от значения, полученные для всей ячейки (область I). (D) значения количественных пикселей для каждой области перечислены в таблице для изображения изображающие выбор области в (C), следуют график, показывающий доля (%) сигнала в Шиц. (E) определение сигнала в различных областях верхнего слоя плоскости z адэрентных клеток MRC-5. (Левая панель) Выбор области, (I) охватывающих всю совокупность клеток для получения количественное значение, соответствующее ячейке сигнал для этого слоя z самолет. (Группа Ближний) выбор области ячейки, соответствующие ядра и цитоплазмы часть, которая не включает в себя SICs (II). (Правая панель) Визуализация области, соответствующей SICs (III) путем вычитания значения, полученные для области II от значения, полученные для всей ячейки (область I). (F) значения количественных пикселей для каждой области перечислены в таблице для изображения изображающие выбор области в (E), следуют график, показывающий доля (%) сигнала в Шиц. (G) количественной оценки значения для всех слоев z самолет из клетки, представленные выше, включая один рассчитаны для z самолеты представлены в A (z = 1), C (z = 9) и E (z = 19), которые выделяются красным цветом в таблице. (H) графическое представление доли сигнала, найденных в Шиц по всему объему всей ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Последние технологические достижения позволили лучше понять механизмы, участвующие в трансляционной upregulation или репрессии в отношении конкретных mRNAs в биологических процессах, например развития нервной системы, ответ наркотиков и метастаз. Экономически эффективные методологии, описанной здесь позволяет перевод событий для отображения в ячейках для изучения, как RNA-связывая протеинов регулировать метастатических процессов, таких как клеточной адгезии, миграции и вторжения.

Хотя были разработаны многочисленные методы для оценки de novo белка перевод, все они разделяют ту же стратегию, в которой elongating полипептида включает изменение аминокислоты, отмеченных обнаружить общие. Первый из этих методов опирается на 35S-radiolabeled аргинин включения недавно переведенные белка. Хотя это эффективно для сравнения общие коэффициенты перевода при определенных условиях, использование radiolabeled аминокислоты делает этот метод непривлекательными для большинства команд исследований. Таким образом разработка развитие новых методов, с помощью нерадиоактивные меток, таких как закат, нажмите it, или трюк подход, открывают новые возможности для оценки и наблюдения в естественных условиях перевод событий. Хотя гениальный, большинство из этих методов только позволяют для оценки перевод событий после лечения или конкретных клеточных событий, с помощью конкретных внешних cDNA построить конкретных целей, ограничивая эксперименты уже определены цели . Это верно для трюк подход4, который позволяет оценивать трансляционная регулирование одной экзогенно выраженной mRNA цели. Хотя это позволяет для проверки трансляционная активации эндогенного мРНК, время минимальным инкубации метод «Click-IT» для включения AHA является по крайней мере 1 h13, который считается слишком долго для наиболее острых механизмов перевода.

Хотя очень универсальный и простой в настройке, метод, описанный здесь требует критические шаги на начальном этапе протокола. Как показано в результатах представительных, различных клеточных линий будет иметь различные puromycin учет кинетики, который может быть просто из-за скорость метаболизма каждой клеточной линии, как представляется, быть для MRC-5 клеток5,21. Действительно-трансформированных клеток не как пролиферативной как HeLa, и поэтому, белок массового обновления является менее надежной, чем в трансформированных клетках. Это следует учитывать при использовании протокола. Соответственно первая часть протокола имеет решающее значение для остальной части метода. Тщательно определения концентрации puromycin и длина инкубации позволит лучше оценить перевода, происходящих во время эксперимента. Как упоминалось выше, лечение с чрезмерное количество puromycin увеличивает соотношение малых puromycilated полипептиды и кажется стимулировать протеолиза, который может легко привести к неправильному толкованию обычно происходит поступательное события19 . Как правило тем дольше время инкубации, меньше puromycin необходимо, тогда как более короткое время инкубации требует более высокую концентрацию puromycin. Концентрации и времени могут быть адаптированы для конкретных экспериментальных ограничений.

Представленные здесь методы весьма гибкой и легко могут быть изменены согласно лечения применяются или биологического процесса учился. Puromycin включение позволяет для быстрой оценки изменений в перевод кинетики за короткий период времени, в то время как метод количественной оценки обеспечивает весьма информативные изображения клеточных событий. Несмотря на мощные, эти методы имеют ограничения, которые должны быть рассмотрены. Puromycin будут включены в белки, недавно синтезированных из всех мРНК, которые активно переводятся. По этой причине puromycilation метод, описанный здесь может быть не подходит для изучения конкретных целей (т.е. одной мРНК), но он идеально подходит, чтобы получить общий обзор переводческая деятельность в одну ячейку или ячейки населения. Как упоминалось выше, чрезмерное puromycin имеет крупные недостатки, и puromycin дозы и время лечения должны быть тщательно определены, как это предлагается в протоколе. Действительно как показано на рисунке 2, наличие чрезмерного puromycin приведет к формированию небольших puromycilated полипептиды которые диффузного более быстрыми темпами в ячейке, приводит к неточным субцеллюлярные локализации данных. Кроме того увеличение протеолиза известно после чрезмерного puromycin лечения19, эффект, который может привести к полной потере сигнала.

Хотя не как конкретно Click-it или трюк методы, подход, предложенный здесь весьма доступным и позволяет для быстрой оценки общих изменений в перевод кинетики. Даже если другие методы лучше подходят для определенных приложений, puromycin включение анализов могут быть выполнены как дополнительного элемента управления. Действительно если эксперимент должен показать, что конкретные целевые мРНК является единственным пострадавшим в особое состояние, необходимо показать, что это не вызвано общего увеличения в переводе. Таким образом негативные puromycin включения могут предоставить доказательства того, для этого случая. Кроме того этот метод хорошо подходит для наблюдения за общие изменения в тарифы на перевод. Следовательно он может использоваться для Показать перевод механизм репрессий, как и в случае стресса блок формирования9, или проверки если циклогексимида лечения, используемых на начальном этапе трансляционного комплекса фракционирования эффективно блокирует Удлинение22. Важно также отметить, что, хотя методы количественной оценки, описанные в разделах 2.3 и 2.4 связаны с упором на окрашивание puromycin эксперименты, они могут применяться к любому типу разобщенным окрашивание с помощью различных видов флуорофоров. Действительно эти методы количественной оценки могут использоваться для количественного определения сотовой распределение молекулы или белка и можно даже проверить локализация цели в конкретных субцеллюлярные отсека.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

Мы благодарим д-р Рашид Mazroui (Университет Лаваля, Квебек, Канада) для критических чтении рукописи. Мы благодарим Imaging группа клеток научно-исследовательского центра для их технической помощи. М.-É. Хуот является младший 1 исследования ученый Fonds de Recherche дю Квебек-здоровью (FRQ-S). Эта работа была поддержана канадской институтов медицинских исследований (номер КНИИЗ, СС-286437 к. м.-É гранта. Хуот).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM wisent 319-005-CL
Trypsine wisent 325-043 EL
FBS Thermo Fisher Scientific 12483020
Puroycin antibody 12D10 EMD millipore MABE343 western blot dilution 1:25,000
Immunofluoresence dilution 1:10,000
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody cell signaling technology 7076 western blot dilution 1:8,000
Western Lightning Plus-ECL Perkin Elmer NEL104001EA
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) cell signaling technology 4408 immunofluoresecence dilution 1:400
CF568 Phalloidin biotium 00044 immunofluoresecence dilution 1:400
Cyclohexmide Sigma C1988-1G 50µg/ml final concentration
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 final concentration 1µg/ml
Puromycin bio-Basic PJ593 2.5µg/ml to 10µg/ml
Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat Ibidi 81156
MRC-5 cells ATCC CCL-171
HeLa cells ATCC CCL-2
Huh-7 cells from Dr. Mazroui (Université Laval)
Fv1000 olympus confocal imaging system
Fiji software http://fiji.sc
PBS (Phosphate BuffeRed Saline) bio-Basic PD8117
Formaldehyde 37% Solution bio-Basic C5300-1
Triton X-100 bio-Basic TB0198
BSA Fisher Bioreagents BP9702-100
Tween20 Fisher Bioreagents BP337-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  2. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  3. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  4. Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
  5. Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
  6. El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
  7. Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
  8. Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
  9. Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. nS. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
  10. Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
  11. Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
  12. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
  13. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
  14. Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
  15. Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
  16. Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
  17. Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
  18. Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
  19. Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
  20. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
  21. Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
  22. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics