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Localizzazione dei geni del recettore degli odoranti nell'antenna di Locust da RNA

Neuroscience

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Summary

Questo articolo descrive un protocollo dettagliato e altamente efficace di ibridazione in RNA in situ , in particolare per i geni espressi a basso livello del recettore dell'Odorant (OR), così come altri geni, nelle antenne degli insetti utilizzando digoxigenina (DIG) o sonde con biotina.

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Xu, X., You, Y., Zhang, L. Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (125), e55924, doi:10.3791/55924 (2017).

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Abstract

Gli insetti hanno evoluto sofisticati sistemi di accoglienza olfattiva per sensibilizzare i segnali chimici esogeni. Questi segnali chimici sono trasdolati da Neuroni Receptor Olfattivi (ORNs) alloggiati in strutture di capelli, chiamate chemosensilla, delle antenne. Nelle membrane delle ORN, si ritiene che i recettori ordoranti (OR) siano coinvolti nella codifica degli odori. Quindi, essere in grado di identificare i geni localizzati alle ORN è necessario per riconoscere i geni OR e costituisce una base fondamentale per ulteriori studi funzionali in situ . I livelli di espressione di RNA di OR specifici nelle antenne insettici sono molto basse e la conservazione del tessuto degli insetti per l'istologia è impegnativa. Pertanto, è difficile localizzare un OR ad un tipo specifico di sensilla usando l'ibridazione RNA in situ . In questo articolo viene introdotto un protocollo dettagliato e altamente efficace di RNA in situ di ibridazione in particolare per i geni OR insoddisfatti di espressione debole. Inoltre, uno specifico OR Gene waS identificata condurre esperimenti di ibridazione in situ fluorescenti a doppio colore usando un gene recettore co-esprimente, Orco , come marker.

Introduction

Le antenne degli insetti, che sono gli organi chemo-senoriali più importanti, sono ricoperti da molte strutture del capello, chiamate sensilla, che sono innervate dai neuroni dell'orecchio olfattivo (ORN). Sulla membrana degli ORN insetti, i recettori ordoranti (OR), un tipo di proteina contenente sette domini transmembranti, vengono espressi con un coreceptore (ORco) per formare un eteromero che funge da canale ionico 1 , 2 , 3 . ORs differenti rispondono a diverse combinazioni di composti chimici 4 , 5 , 6 .

Le locuste ( Locusta migratoria ) si basano principalmente sulle indicazioni olfattive per attivare comportamenti importanti 7 . Gli OR Locust sono fattori chiave per comprendere i meccanismi olfattivi molecolari. Localizzare una specifica locusta OR gene al neurone di aTipo sensilismo morfologicamente specifico da RNA In Hybridization In Situ (RNA ISH) è il primo passo per esplorare la funzione OR.

RNA ISH utilizza una sonda RNA complementare etichettata per misurare e localizzare una sequenza specifica di RNA in sezione di tessuti, cellule o montanti interi in situ , fornendo approfondimenti nei processi fisiologici e nella patogenesi della malattia. Sono state ampiamente utilizzate sonde RNA con etichettatura digossigenina (DIG-etichettata) e biotina. L'etichettatura di RNA con digoxigenina-11-UTP o biotina-16-UTP può essere preparata mediante trascrizione in vitro con le polimerasi RNA di SP6 e T7. Le sonde RNA con DIG e biotina hanno i seguenti vantaggi: non radioattivi; sicuro; stabile; Altamente sensibile; Altamente specifiche; E facile da produrre usando PCR e trascrizione in vitro . Le sonde RNA con DIG e biotina possono essere rilevate in modo cromogeno e fluorescente. Le sonde RNA con etichetta DIG possono essere rilevate con anti-digoxigenin AlkaliNe anticorpi concomitanti con fosfatasi (AP) che possono essere visualizzati con substrati chemiluminescenti altamente sensibili nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato toluidina (NBT / BCIP) utilizzando un microscopio ottico o con 2 Acido-2-fenilanilide fosfato (HNPP) accoppiato con sale di cloruro di emiciclo 4-chloro-2-methylbenzenediazonium (Fast Red) utilizzando un microscopio confocale. Le sonde RNA con biotina possono essere rilevate con anticorpi coniugati con anti-biotina streptavidina per rade di rapa perossidasi (HRP) che possono essere visualizzati con tiramidi di fluoresceina usando un microscopio confocale. Così, l'ibridazione in situ fluorescente a doppio colore può essere eseguita per rilevare due geni bersaglio in una fetta usando sonde RNA etichette DIG e biotina.

RNA ISH con sonde DIG e / o biotina è stato utilizzato con successo per localizzare i geni correlati agli olfattivi, come OR , recettore ionotropico, proteina legante odoranteE proteine ​​della membrana del neurone sensoriale, nelle antenne insettuali di, ma non solo, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria e la locusta di deserto Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Tuttavia, ci sono due sfide sostanziali quando si esegue RNA ISH per gli OR di insetti: (1) OR geni (ad eccezione di ORco ) sono espressi a bassi livelli e solo in poche cellule, rendendo molto rilevante il rilevamento del segnale e (2) Istologia, tale che la morfologia sia preservata e il rumore di fondo è basso, può essere impegnativo. In questo documento un protocollo dettagliato ed efficace che descrive RNA ISH per localizzare i geni OR in insettoVengono presentate antenne, tra cui sia la rilevazione cromatica e la tastatura del segnale di tiramide (TSA).

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Protocol

NOTA: per limitare il degrado del RNA, preparare le soluzioni utilizzando acqua distillata autoclavata a umido (a 121 ° C per 60 min) e anche materiali autoclave a umido.

1. Preparazione di RNA ISH Antisense e Sense Probes

  1. Amplificazione e purificazione del gene target
    1. Innanzitutto, produrre un frammento a doppio filamento di L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) dal plasmide contenente il cDNA di LmigOR1 a piena lunghezza con una polimerasi Taq DNA che aggiunge adenine a entrambe le estremità dei frammenti.
      1. Utilizzare un volume di reazione di 100 μL, contenente 50 μL di miscela di reazione 2x, 4 μl di ciascuno dei sensori di senso e antisenso ( Tabella 1 ), 1 μL di plasmide template e 41 μL di H 2 O senza RNasi. Utilizzare il seguente PCR Protocollo: 94 ° C per 5 minuti, seguito da 30 cicli di 94 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 s e 72 ° C per 1 min, Seguita da 72 ° C per 10 min.
      2. Ripetere questi passaggi per produrre il frammento a doppio filamento di 1,303 bp di LmigOR2 (GenBank: JQ766966) e 1,251 bp frammento a doppio filamento di LmigORco (GenBank: JN989549). I primer utilizzati in questi esperimenti sono presentati nella Tabella 1 .
      3. Eseguire i prodotti PCR su gel agarosio dell'1,2% in tampone 1x Tris-acetato-EDTA e visualizzare utilizzando la colorazione del bromuro di etidio.
    2. Estrarre questi prodotti PCR utilizzando un kit di estrazione del gel.
      1. Dopo l'elettroforesi, inserire le fasce di DNA di accisa dal gel e inserire le fette di gel in un tubo da 1,5 mL. Quindi aggiungere 100 μl di buffer di legame (Buffer PN) per 0,1 g di fetta di gel. Vorticali e incubare a 50 ° C fino a quando la fetta di gel è completamente sciolta.
      2. Inserire una colonna di adsorbimento CA2 nel tubo di raccolta e aggiungere 500 μL di buffer di bilanciamento (Buffer BL). Ciò migliora la capacità di assorbimento e la stabilità della membrana di silice. CentriSi muove a 12.400 xg per 1 min.
      3. Trasferire la miscela di gel dissolta al gruppo di colonna di adsorbimento e incubare a temperatura ambiente per 2 min. Poi, centrifuga i tubi a 12.400 xg per 1 min. Scartare il flusso e reinserire la colonna di adsorbimento nel tubo di raccolta.
      4. Aggiungere due volte 600 μL di soluzione di lavaggio (aggiunta di etanolo, Tampone PW). Centrifugare a 12.400 xg per 1 min. Eliminare il flusso e reinserire la colonna di adsorbimento nel tubo di raccolta.
      5. Svuotare il tubo di raccolta e recuperare nuovamente la colonna a 12.400 xg per 2 minuti per consentire l'evaporazione di qualsiasi etanolo residuo.
      6. Trasferire con cautela la colonna di adsorbimento in un tubo centrifugo da 1,5 ml. Asciugare a pellet il pellet per 5-10 min e ricollegare il DNA in un volume adatto ( ad esempio, 30 μL) di acqua priva di nucleasi.
      7. Incubare a RT per 2 min. Centrifugare a 12.400 xg per 2 min. Scartare la colonna di adsorbimento e memorizzare il DNA a 4 ° C o -20 ° C.
  2. Costruire i plasmidi ricombinanti
    1. Individualmente lega il frammento di 387 bp di LmigOR1 , frammento di 1,303 bp di LmigOR2 e 1,251 bp frammento di LmigORco in un vettore T che contiene promotori per polimerasi RNA a T7 (a monte) e SP6 (a valle) adiacenti al DNA inserito usando ligasi del DNA di T4. Preparare la seguente 10 μL di reazione: 5 μL di tampone di legatura 2x, 1 μL di T vettore, 3 μL (~100 ng) del DNA del gene inserito e 1 μl di T4 ligasi DNA e incubare O / N a 4 ° C.
    2. Aggiungere 5 μl di ciascun plasmide ricombinante contenente il frammento di 387 bp di LmigOR1 , 1,303 bp di LmigOR2 e 1,251 bp di LmigORco separatamente in 50 μl di competenti Escherichia coli DH5α in tubi sterili da 1,5 ml.
      1. Mescolare delicatamente e mettere i tubi in ghiaccio per 30 minuti e poi incubarli per 90 s a 42° C. Trasferirli nuovamente in ghiaccio per 3 minuti.
      2. Aggiungere a ciascun tubo 450 μl di mezzo liquido Luria-Bertani (LB) senza ampicillina e incubarli in un agitatore a 150 giri / min per 1 h a 37 ° C per ripristinare l' E. coli DH5α.
      3. Prendere un'aliquota di 100 μl di ciascun trasformante e utilizzarle per inoculare le lastre di substrato solido di LB contenenti ampicillina da 50 μg / ml, 24 μg / mL isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e 40 μg / ml 5-bromo-4 -chloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-gal).
      4. Incubare queste piastre in un incubatore costante a 37 ° C per 18 h. Schermate i plasmidi ricombinanti di destinazione utilizzando il metodo di screening blu-bianco. Sequenza dei plasmidi ricombinanti di destinazione utilizzando sequenziamento di Sanger e identificazione delle direzioni di inserto di tre geni OR.
  3. Selezionare endonucleasi di restrizione per linearizzare i plasmidi ricombinanti
    1. Usare endonucleasi di restrizione tIl cappello non solo digerisce nel sito di clonazione multiplo del vettore ma anche non taglia il DNA dell'inserto. In questo esperimento, tutti i 3 geni vengono inseriti nel vettore T nella direzione corrispondente a quella del vettore.
    2. Utilizzare l'endonucleasi di restrizione Nco I per linearizzare i plasmidi ricombinanti contenenti il ​​frammento di 387 bp di LmigOR1 , 1,303 bp di LmigOR2 e 1,251 bp di LmigORco per produrre le sonde antisenso. Utilizzare l'endonucleasi di restrizione Sp e I per produrre le sonde di sensazione.
      NOTA: Se la direzione dell'inserto corrisponde a quella del vettore, viene selezionato un sito di restrizione univoco dalla fine di T7 per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA di SP6 viene utilizzata per preparare la sonda antisenso. Un sito unico di restrizione dalla fine dello SP6 viene scelto per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA T7 viene utilizzata per preparare la sonda di sensazione. Altrimenti, se la direzione dell'inserto non corrisponde a tLa direzione del vettore, quindi un sito unico di restrizione dalla fine di SP6 viene scelto per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA T7 viene utilizzata per preparare la sonda antisenso. Il sito unico di restrizione dalla fine di T7 viene scelto per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA di SP6 viene utilizzata per preparare la sonda di senso.
  4. Purificando i plasmidi ricombinanti linearizzati
    1. Digest 20 μg ciascuno dei tre plasmidi ricombinanti contenenti il ​​387 bp frammento di LmigOR1 , 1,303 bp frammento di LmigOR2 e 1,251 bp frammento di LmigORco utilizzando l'endonucleasi restriction Nco I in una reazione di 100 μl che contiene 10 μL di tampone 10x, 40 μL di 0,5 μg / μl di plasmide, 3 μL di Nco I e 47 μl di H 2 O senza RNasi, seguita da un'incubazione di 3 ore a 37 ° C.
    2. Allo stesso modo, digerire 20 μg di ciascuno di questi tre plasmidi ricombinanti uCantare l'endonucleasi di restrizione Spe I.
    3. Purificare questi plasmidi digeriti usando un kit di estrazione del gel come descritto in 1.1.2. Determinare le concentrazioni di questi plasmidi ricombinanti linearizzati estratti mediante spettrofotometria e regolare a 0,5 μg / μL.
  5. Preparare antisenso e sonde sensoriali
    1. Utilizzare il sistema di trascrizione RNA T7 / SP6 per generare sonde antisenso e sensori. La polimerasi RNA SP6 è usata per trascrivere RNA a doppio filamento per le sonde antisense DIG e biotina per questi tre geni OR utilizzando plasmidi ricombinanti linearizzati come modelli in vitro . La polimerasi RNA T7 viene utilizzata per produrre sonde di senso. Eseguire la reazione in un volume finale di 20 μl, contenente 2 μL di 10 volte NTP mix, 2 μL di 10X buffer di trascrizione, 1 μL di inibitore della RNasi, 2 μL di T7 o SP6 RNA polimerasi, 4 μL di 0,5 μg / μl di plasmidi linearizzati e 9 μL H 2 O senza RNasi, seguitiDa un incubo di 3 ore a 37 ° C.
    2. Incubare le sonde antisense e sensori con DIG e biotina per 30 min con 1 μl DNasi a 37 ° C. Aggiungere 2,5 μL di 5 M LiCl e 75 μl di etanolo assoluto, quindi incubare le reazioni per 30 minuti a -70 ° C.
    3. Centrifugare a 15.000 xg per 30 minuti a 4 ° C. Decanta con cautela il surnatante. Aggiungere 150 μl di etanolo al 70% per lavare il precipitante. Preparare l'etanolo al 70% (1 L) aggiungendo l'etanolo al 95% (736.8 mL) in acqua distillata sterile (263.2 mL).
    4. Centrifugare a 15.000 xg per 30 minuti a 4 ° C e asciugare in aria il pellet per 5-10 min a RT. Aggiungere 25 μL di H 2 O senza RNasi per sciogliere le sonde antisense e sensori RNA.
    5. Se la lunghezza del gene inserito è più lunga di 1 kb, successivamente frammenti di RNA antisenso e sensori a una lunghezza media di ~ 300 bp per incubazione in soluzioni di tampone bicarbonato-carbonato. Eseguire la reazione in un volume finale di 50 μL, cCon 25 μL di sonda RNA e 25 μL di soluzione tampone bicarbonato-carbonato (80 mM NaHCO 3 , 120 mM Na 2 CO 3 , pH 10,2) a 60 ° C. Il tempo di idrolisi richiesto è dato da una formula pubblicata in precedenza 17 .
    6. Aggiungere 5 μl di 10% di acido acetico per fermare la reazione. In questo esperimento, frammentare i LmigOR2 e LmigORco antisense e sonde di sensazione per 24 e 23 minuti, rispettivamente.
      T = (L o -L f ) / kXL o XL f
      L o = lunghezza iniziale del frammento in ca.
      L f = lunghezza del frammento finale in ca.
      K = la costante di velocità per l'idrolisi, circa 0,11 kb -1 min -1
      T = tempo di idrolisi in min
    7. Infine, aggiungere 250 μl di tampone di ibridazione e conservare a -80 ° C.

2. Preparazione delle Sezioni del Cryostat

  1. Precool il freeziNg del microtomo a -24 ° C.
  2. Selezionare le nuove locuste di adulazione adulta che sono attive e che hanno antenne intatte. Tagliare le antenne in pezzi da 2-3 mm utilizzando i rasoi sterili.
  3. Mettere il composto OCT su un supporto di microtomo congelante e mettere uno o due campioni sul composto orizzontalmente. Quindi, trasferire il supporto nel microtomo a congelamento a -24 ° C per equilibrare fino a quando il composto si blocca. Estrarre il supporto e coprire i campioni con un piccolo composto. Trasferire il titolare nel microtomo di congelamento a -24 ° C per almeno 10 minuti ( Figura 1 ).
    NOTA: Evitare di ottenere bolle nel composto.
  4. Fissare il supporto con i campioni nel microtomo di congelamento, quindi dividere i campioni congelati in fette di 12 μm a -24 ° C.
  5. Fissare le fette uno ad uno su diapositive (25 x 75 mm, senza nucleasi) e asciugare all'aria per 10 min.

3. Sezioni di fissaggio

  1. Dopo aver preparato il criostatoMettere le diapositive in un contenitore di plastica (~ 100 x 40 x 80 mm) e fissare i tessuti incubando le diapositive in soluzione 4% di paraformaldeide (PFA) per 30 minuti a 4 ° C.
  2. Lavare le diapositive in 1X saline fosfato-bufferizzato (PBS) per 1 minuto.
  3. Per eliminare le proteine ​​alcaline, trasferire le diapositive a 0,2 M HCl per 10 minuti.
  4. Per eliminare la proteina superficiale dell'acido nucleico, trasferire le diapositive a 1XPBS con 1% di Triton X-100 per 2 min.
  5. Lavare le diapositive due volte per 30 s in 1x PBS.
  6. Infine, sciacquare le diapositive in soluzione formamide per 10 minuti a 4 ° C.

4. Ibridazione

  1. Preparare le sonde antisenso e sensore
    1. Utilizzare un tampone di ibridazione per diluire le sonde di antisense o sensori di RNA nei tubi da 1,5 mL senza nucleasi. In questo esperimento, per tutte le sonde antisense e sensori ( LmigOR1, LmigOR2 e LmigOrco ), aggiungere 1 μL di sonda a 99 μL buffer di ibridazione per diapositiva. Generalmente, l'uso di diluizioni 1: 100 di sonde antisenso produce significativi segnali positivi e bassi sfondi utilizzando questo protocollo.
    2. Per il rilevamento cromogenico, provvedere a diluire singolarmente le sonde DIG-etichettate.
    3. Per il rilevamento TSA, diluire DIG marcato LmigOR1 con sonde LmigOrco marcati con biotina o DIG marcato LmigOR2 con biotina marcata LmigOR1 sonde insieme nel tampone di ibridazione.
    4. Scaldare le diluizioni per 10 minuti a 65 ° C e metterle in ghiaccio per almeno 5 min.
  2. ibridazione
    1. Scolare le diapositive e aggiungere 100 μL di sonde antisense e sensori diluiti (fase 4.1) alle sezioni del tessuto. Quindi, posizionare le copertine (24 mm x 50 mm, senza nucleasi) sulle sezioni del tessuto.
    2. Posizionare i vetri coperti orizzontalmente in una scatola umida (~ 300 x 180 x 50 mm 3 ; figura 2 ) e incubare unaT 55 ° C per 22 ore. Aggiungere una soluzione di formamide o 1X PBS al fondo della scatola per mantenere l'ambiente umido, ma non immergere le diapositive nel liquido.
  3. Lavaggio e blocco.
    1. Dopo l'ibridazione, rimuovete con attenzione le copertine. Lavare le diapositive due volte per 30 minuti in 0,1 x Saline Sodio Citrato (SSC) a 60 ° C.
      NOTA: Lavatrice significa mettere le diapositive in un supporto di scorrimento che viene poi posizionato in un contenitore di plastica e agitato leggermente su un bilanciere (~ 50 rpm; Figura 2 ).
    2. Sciacquare le diapositive in 1x Tris-Buffered Saline (TBS) per 30 s.
    3. Aggiungere 1 ml di reagente di blocco dell'1% in TBS completato con 0,03% di Triton X-100 su ciascuna diapositiva e incubare per 30 min. Quindi, scartare la soluzione di blocco.
  4. Immunoistochimica.
    1. Per il rilevamento cromogenico, utilizzare il reagente di bloccaggio in TBS per diluire 750 unità (U) / mL anti-digoxigenina AP-coniugato antiboDa due a 1,5 U / ml soluzione AP. Aggiungere 100 μL di soluzione AP per scivolo coperto (24 mm x 50 mm).
    2. Per la rilevazione di TSA, utilizzare il reagente bloccante in TBS per diluire 750 U / mL di anticorpi anti-digoxigenin AP coniugati e anti-biotina streptavidina HRP-coniugata contro la soluzione AP / HRP. Aggiungere 100 μL di soluzione AP / HRP per uno scivolo coperto (24 mm x 50 mm).
    3. Incubare le diapositive in una scatola umida ( Figura 2 ) per 60 minuti a 37 ° C. Utilizzare la soluzione formamide o 1X PBS per mantenere la scatola umida ma non soglia.

5. Colorazione

  1. Rimuovere con attenzione i coperchietti. Lavare le diapositive tre volte per 5 min in 1x TBS integrato con 0,05% di Tween-20. Sciacquare le diapositive in DAP-buffer (rilevazione cromogena: pH 9,5; rilevazione TSA: pH 8,0) per 5 min.
  2. Colorazione (rilevazione cromogena)
    1. Aggiungere 100 μL di soluzione NBT (375 μg / mL) / BCIP (188 μg / mL) di substrato (diluito in DAP;PH 9,5) a ogni diapositiva. Posizionare con attenzione i coperchi (24 x 50 mm) sulle diapositive.
    2. Incubare le diapositive in una scatola umida con soluzione di substrato per 10 min - O / N a 37 ° C.
      NOTA: Controllare lo sviluppo guardando le diapositive di tanto in tanto sotto il microscopio.
    3. Quando lo sviluppo è pronto, arrestare la reazione trasferendo le diapositive in acqua.
  3. Colorazione (rilevazione TSA)
    1. Utilizzare una siringa per spostare il substrato HNPP (100 μg / mL) / Fast Red (250 μg / mL) dal filtro della siringa (0,22 μm; Figura 2 ).
    2. Aggiungere 100 μL di substrato HNPP / Fast Red per diapositiva ricoperta da una copertura (24 x 50 mm). Incubare le diapositive per 30 min con substrato HNPP / Fast Red a RT.
    3. Rimuovere con cura i vetrini e lavare le diapositive tre volte per 5 minuti in 1X TBS integrato con 0,05% di Tween-20.
    4. Utilizzare 100 μl di substrato TSA / coperto (24 x 50 mm 2 ) scorrevole. Incubare le diapositive con substrato TSA per 10 minuti a RT.
    5. Rimuovere le copertine con cura e lavare le diapositive tre volte per 5 min in 1x TBS con 0,05% di Tween-20.
  4. Incorporare le diapositive in PBS / glicerolo (1: 3).
    NOTA: Dopo aver terminato queste procedure, le diapositive devono essere osservate il più presto possibile perché il segnale fluorescente si spegnerà rapidamente.

6. Osservazione

  1. Rilevamento cromogeno
    1. Osservare le sezioni del tessuto utilizzando un microscopio ottico. Scegli le lenti obiettivo 10X, 20X e 40X per osservare i risultati del rilevamento cromogeno.
    2. Utilizzare il software DP-BSW per analizzare i risultati e acquisire le immagini.
  2. Rilevamento TSA
    1. Osservare le sezioni del tessuto utilizzando un microscopio confocale. I geni con etichetta DIG devono essere osservati sotto la luce di 543 nm, presentando un colore rosso e i geni biotinici devono essereOsservata sotto la luce di 488 nm, presentante un colore verde. Quando emergono, presentano il colore giallo.
    2. Scegli le lenti obiettivo 20X e 40X per osservare rispettivamente i risultati del rilevamento TSA.
    3. Utilizzare il software FV1000 per analizzare i risultati e acquisire le immagini.

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Representative Results

Con rilevazione cromogenica, un piccolo sottoinsieme delle cellule antenne in ogni sezione antenne adulta è stato indicato con le sonde antisense LmigOR1 e LmigOR2 ( Figura 3 ) con DIG. RNA ISH su sezioni consecutive per localizzare LmigOR1 e LmigOR2 ha mostrato che le cellule antennali che esprimono i due geni si trovavano nei cluster ORN che esprimevano LmigORco , indicando che il putativo LmigOR1 e LmigOR2 erano effettivamente espressi in ORN ( Figura 4a -4d ). A volte, sono state visualizzate strutture etichettate come dendritiche ( Figura 4e -4f ). LmigOR1 e LmigOR2 erano entrambi localizzati ai neuroni nella sensilla basiconica ( Figura 5a-5b ), ma non erano coespressi in sensilla individuale, indicando che erano presenti in diversi basico Nic sensillium sottotipi ( Figura 5c- 5d ).

Nel rilevamento TSA, l'ibridazione in situ in fluorescenza a doppio colore ha mostrato che le cellule esprimenti LmigOR1 (colore rosso) erano localizzate nei cluster ORN che esprimevano LmigORco (colore verde), indicando che il presunto LmigOR1 è stato espresso in ORN ( Figura 6a ). Una vista ravvicinata delle aree in scatola della figura 6a è mostrata nella figura 6b . I neuroni esprimenti LmigOR1 (colore verde, figura 7a ) e il neurone esprimente LmigOR2 (colore rosso, figura 7b ) si trovavano a diversi sottotipi di sensillium basico ( Figura 7c ).

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Figura 1: Preparazione delle sezioni dell'antenna di insetti per l'ibridazione in situ RNA. (A) Il microtomo di congelamento; ( Bc ) I campioni sono incorporati in un congelatore OCT Compound. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Elementi sperimentali per l' ibridazione RNA in situ . (A) Il portavetrini e il contenitore di plastica. B ) La scatola umida. ( C ) il rocker. D ) il filtro a membrana. E ) microscopio confocale. .jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Localizzazione cellulare di LmigOR1 e LmigOR2 negli organi olfattivi. (A) Sintesi di cellule esprimente LmigOR1 in un segmento antenne locusta. ( B ) Panoramica delle cellule esprimenti LmigOR2 in un segmento antenne di locuste. Le frecce indicano le cellule che esprimono LmigOR1 ( a ) e LmigOR2 ( b ). Barre di scala = 100 μm (a e b). Le figure sono state adattate da Xu et al. 12 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

"> Figura 4
Figura 4: Identità neuronale delle cellule antenne esprimendo LmIGORs mediante rivelazioni cromogene. (Ab) Lo schema di etichettatura LmigOR1 (a) e LmigORco (b) sonda antisenso su sezioni consecutive di antenna locusta. ( Cd ) Il modello di etichettatura della sonda antisense LmigORco ( c ) e LmigOR2 ( d ) su sezioni consecutive di antenne locuste. ( Ef ) Illustrazione di strutture a volte danneggiate (indicata da frecce rosse). Barre di scala = 50 μm (ad); 20 μm (e e f). Le figure sono state adattate da Xu et al. 12 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 5
Figura 5: LmigOR1 e LmigOR2 sono espressi in ORN alloggiati in sensazione Basiconic. (Ab) Basiconic sensillum ospitato ORNS esprimono LmigOR1 (a) e LmigOR2 (b). ( Cd ) L'espressione di LmigOR1 e LmigOR2 in sottoinsieme distinto di ORN antenne è stata verificata in sezioni consecutive (cd). Le frecce a freccia indicano le cellule antennali che esprimono LmigOR1 (a, c) e LmigOR2 (b, d). Ba: sensilio basicico. Barre di scala = 20 μm (a e b); 50 μm (c e d). Le figure sono state adattate da Xu et al. 12 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.


Figura 6: Identità neuronale della cella antenne esprimendo LmigOR1 mediante rilevamenti TSA. (A) bicolore ibridazione in situ è stata eseguita su sezione longitudinale antennale per illustrare l'espressione di LmigOR1 (rosso) e LmigORco (verde). Localizzazione di LmigOR1- espressione di cellule in cluster di cellule che esprimono LmigORco ha confermato la sua identità neurale. ( B ) Vista ravvicinata delle aree inscatolate in a. Di tanto in tanto le strutture a forma di dendritica sono state indicate con la freccia. Le aree circondate indicano il cluster di ORN che esprime LmigORco e condivide lo stesso sensilum. Barre di scala = 50 μm (a); 20 μm (b). Le figure sono state adattate da Xu et al. 12 CLeccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7: LmigOR1 e LmigOR2 sono stati localizzati a diversi ORAN di Basiconic Sensia da TSA Detection. I segnali fluorescenti sono stati visualizzati usando sistemi di rilevazione, indicando i neuroni LmigOR1 dalla fluorescenza verde ( a ) e le cellule positive di LmigOR2 mediante la fluorescenza rossa ( b ) sono state espresse in differenti sottotipi di sensoniali basilari ( c ). Le frecce a freccia indicano le cellule antennali che esprimono LmigOR1 e LmigOR2 . Barre di scala = 20 μm. Le figure sono state adattate da Xu et al. 12 Clicca qui per visualizzare unVersione più grande di questa figura.

Nome sequenze
Lmig OR1 -sonde 5'-AAGGGGTGGGAGACGGCCTG-3'
Lmig OR1 -sonda-come 5'-CAGCTCCTCCCCAACGACAGC-3'
Lmig OR2-sonde 5'-ATGGGTGAGCGTGGAGAGGC-3'
Lmig OR2-sonda-as 5'-GGTCATCGCTGTGGACGTGG-3'
Lmig Orco-sonde 5'-CTCGTCTGACAGCGTAACTCAC-3'
Lmig Orco-sonda-as 5'-AAGACGCAGAAGAGGAAGACCT-3'

Tabella 1: Le sequenze dei primer PCR.

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Discussion

È difficile eseguire RNA ISH per localizzare i geni OR nelle antenne degli insetti perché i livelli di espressione di geni OR, ad eccezione di ORco , sono molto bassi e che preservano fette istologiche di antenne insettiche è molto difficile. Inoltre, il rilevamento di TSA è anche molto complicato. Per risolvere questi problemi, occorre prendere le seguenti misure. Le antenne sono scelte da locuzioni adulte di recente molting che presentano cuticole sottili e morbide di antenne, che mantengono la loro morfologia sullo scivolo. I campioni congelati vengono tagliati in fette di 12 μm. Sono utilizzate sonde altamente sensibili e specifiche di biotina e DIG. Detergenti, come Tween-20 e Triton X-100, vengono utilizzati per ridurre lo sfondo in molti passaggi. Nel rilevamento di TSA, un gene altamente espresso, rispetto ad un altro gene espressamente basso, dovrebbe essere etichettato con biotina-16-UTP. Le diapositive devono essere osservate il più presto possibile perché i segnali fluorescenti si spegneranno rapidamente.

DIG-aNd le sonde con biotina hanno i vantaggi di una durata più lunga, maggiori segnali di segnale e rumore e migliori risoluzioni cellulari rispetto alle sonde radioattive 18 , 19 . Il protocollo presentato in questo documento presenta alcuni vantaggi rispetto all'intera integrazione di ibridazione in situ . Questo protocollo identifica facilmente le localizzazioni dei geni a livello cellulare, ma non può essere facilmente utilizzato per indagare i modelli di distribuzione del gene, che è più facilmente eseguito con l'ibridazione in situ in situ .

Per identificare un gene OR, sono stati presi due approcci. Uno era il rilevamento cromogenico in sezioni consecutive e l'altro era rilevamento fluorescente in una sezione. ORco è coespresso con un determinato OR come marker ORN 10 , 20 , 21 . Le cellule che esprimevano LmigOR1 o LmigOR2 erano entrambe situateA raggruppamenti di cellule LmigORco- esprimenti che li hanno chiaramente identificati come OR ( Figura 4 e Figura 6 ). Usando gli stessi approcci, abbiamo scoperto che LmigOR1 e LmigOR2 non sono coespressi in un sensilio. I risultati di questi due approcci sono corroboranti.

Questo protocollo è stato anche utilizzato con successo per localizzare LmigORco, SgreORco, SgreIR8a e SgreIR25a nelle antenne di locusta 10 , 14 . Recentemente, LmigOR3 è stato localizzato nei neuroni trilogeno sensile in L. migratoria utilizzando lo stesso protocollo 15 . Questo protocollo è stato usato per localizzare due proteine ​​della membrana neuronale sensoriale SgreSNMP1 e SgreSNMP2 nelle antenne di S. gregaria 16 . Pertanto, questo protocollo ha affidato in modo affidabile i geni correlati ai chemosensori nelle antenne della locusta, che non solo hanno verificato questiGeni candidati, ma anche localizzato questi geni a cellule specifiche alloggiate in diversi tipi di sensilla.

In conclusione, questo protocollo altamente efficace di RNA ISH è specificatamente descritto per localizzare i geni OR, così come altri geni espressi a bassi livelli, nelle antenne degli insetti.

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Disclosures

Gli autori non hanno niente da divulgare né altri conflitti di interesse.

Acknowledgements

Questo lavoro è supportato da una sovvenzione della National Natural Science Foundation della Cina (No.31472037). La menzione dei nomi commerciali o dei prodotti commerciali in questo articolo è esclusivamente ai fini di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazioni.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
2×TSINGKETM Master Mix TSINGKE, China TSE004
RNase-free H2O TIANGEN, China RT121-02
REGULAR AGAROSE G-10 BIOWEST, SPAIN 91622
Binding buffer TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China DP209-02
Balance buffer TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China DP209-02
Wash solution TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China DP209-02
T Vector Promega, USA A362A
T4 DNA Ligase Promega, USA M180A
Escherichia coli DH5α TIANGEN, China CB101
Ampicillin Sigma, USA A-6140
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Inalco, USA 1758-1400
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside SBS Genetech, China GX1-500
Nco I BioLabs, New England R0193S
Spe I BioLabs, New England R0133M
DIG RNA Labeling Kit Roche, Switzerland 11175025910
Biotin RNA Labeling Kit Roche, Switzerland 11685597910
DNase DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland 11175025910
LiCl Sinopharm, China 10012718
Ethanol Sinopharm, China 10009257
Acetic acid BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China 10000292
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands 4583
Slides TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China FISH0010
HCl Sinopharm, China 80070591
Millex Millipore, USA SLGP033RS
Tween 20 AMRESCO, USA 0777-500ML
Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt Roche, Switzerland 11175041910
Glycerol Sinopharm, China 10010618
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
1×Tris-acetate-EDTA Sigma, USA V900483-1KG 0.04 mol/L Tris-Base
1×Tris-acetate-EDTA BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China 10000292 0.12% acetic acid
1×Tris-acetate-EDTA Sigma, USA 03677 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)
Luria-Bertani (LB) liquid medium Sinopharm, China 10019392 10 g/L NaCl
Luria-Bertani (LB) liquid medium MERCK, Germany VM335231 10 g/L Peptone from casein (Tryptone)
Luria-Bertani (LB) liquid medium MERCK, Germany VM361526 5 g/L Yeast extract
LB solid substrate plate Sinopharm, China 10019392 10 g/L NaCl
LB solid substrate plate MERCK, Germany VM335231 10 g/L Peptone from casein (Tryptone)
LB solid substrate plate MERCK, Germany VM361526 5 g/L Yeast extract
LB solid substrate plate WISENT ING, Canada 800-010-CG 15 g/L Agar Bacteriological Grade
10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) Sinopharm, China 10019392 8.5% NaCl
10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) Sigma, USA V900041-500G 14 mM KH2PO4
10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) Sigma, USA V900268-500G 80 mM Na2HPO4
10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) Sigma, USA V900483-1KG 1 M Tris-Base
10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) Sinopharm, China 10019392 1.5 M NaCl
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH 9.5       TSA detection pH 8.0 Sigma, USA V900483-1KG 100 mM Tris-Base
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH 9.5       TSA detection pH 8.0 Sinopharm, China 10019392 100 mM NaCl
Detection Buffer (DAP)       chromogenic detection pH 9.5       TSA detection pH 8.0 Sigma, USA V900020-500G 50 mM MgCl2·6H2O
20×saline-sodium citrate (pH 7.0) Sinopharm, China 10019392 3 M NaCl
20×saline-sodium citrate (pH 7.0) Sigma, USA V900095-500G 0.3 M Na-Citrate
4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5) Sigma, USA V900894-100G 4% paraformaldehyde
Sodium Carbonate Buffer Sigma, USA V900182-500G 0.1 M NaHCO3
Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) Sigma, USA V900182-500G 80 mM NaHCO3
Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) Sigma, USA S7795-500G 120 mM Na2CO3
Formamide Solution (pH 10.2) MPBIO, USA FORMD002 50% Deionized Formamide
Formamide Solution (pH 10.2) 5×saline-sodium citrate
Blocking Buffer in TBS Roche, Switzerland 11175041910 1% Blot
Blocking Buffer in TBS AMRESCO, USA 0694-500ML 0.03% Triton X-100
Blocking Buffer in TBS 1×Tris buffered saline
Alkaline phosphatase solution Roche, Switzerland 11175041910 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody
Alkaline phosphatase solution Blocking Buffer in TBS
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution Roche, Switzerland 11175041910 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution TSA kit, Perkin Elmer, USA NEL701A001KT 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody
Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution Blocking Buffer in TBS
Hybridization Buffer MPBIO, USA FORMD002 50% Deionized Formamide
Hybridization Buffer 2×saline-sodium citrate
Hybridization Buffer Sigma, USA D8906-50G 10% dextran sulphate
Hybridization Buffer invitrogen, USA AM7119 20 µg/mL yeast t-RNA
Hybridization Buffer Sigma, USA D3159-10G 0.2 mg/mL herring sperm DNA
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate Roche, Switzerland 11758888001 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10 mg/mL)
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate Roche, Switzerland 11758888001 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL)
2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate Detection Buffer
Tyramide signal amplification substrate TSA kit, Perkin Elmer, USA NEL701A001KT 2% fluorescein-tyramides
Tyramide signal amplification substrate TSA kit, Perkin Elmer, USA NEL701A001KT Amplification Diluent
Name Company Catalog Number Comments
Instrument
Freezing microtome Leica, Nussloch, Germany Jung CM300 cryostat
Spectrophotometer Thermo SCIENTIFIC, USA NANODROP 2000
Optical microscope Olympus, Tokyo, Japan Olympus IX71microscope
Confocal microscope Olympus, Tokyo, Japan Olympus BX45 confocal microscope

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References

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