Summary
Questo articolo descrive un protocollo dettagliato e altamente efficace di ibridazione in RNA in situ , in particolare per i geni espressi a basso livello del recettore dell'Odorant (OR), così come altri geni, nelle antenne degli insetti utilizzando digoxigenina (DIG) o sonde con biotina.
Abstract
Gli insetti hanno evoluto sofisticati sistemi di accoglienza olfattiva per sensibilizzare i segnali chimici esogeni. Questi segnali chimici sono trasdolati da Neuroni Receptor Olfattivi (ORNs) alloggiati in strutture di capelli, chiamate chemosensilla, delle antenne. Nelle membrane delle ORN, si ritiene che i recettori ordoranti (OR) siano coinvolti nella codifica degli odori. Quindi, essere in grado di identificare i geni localizzati alle ORN è necessario per riconoscere i geni OR e costituisce una base fondamentale per ulteriori studi funzionali in situ . I livelli di espressione di RNA di OR specifici nelle antenne insettici sono molto basse e la conservazione del tessuto degli insetti per l'istologia è impegnativa. Pertanto, è difficile localizzare un OR ad un tipo specifico di sensilla usando l'ibridazione RNA in situ . In questo articolo viene introdotto un protocollo dettagliato e altamente efficace di RNA in situ di ibridazione in particolare per i geni OR insoddisfatti di espressione debole. Inoltre, uno specifico OR Gene waS identificata condurre esperimenti di ibridazione in situ fluorescenti a doppio colore usando un gene recettore co-esprimente, Orco , come marker.
Introduction
Le antenne degli insetti, che sono gli organi chemo-senoriali più importanti, sono ricoperti da molte strutture del capello, chiamate sensilla, che sono innervate dai neuroni dell'orecchio olfattivo (ORN). Sulla membrana degli ORN insetti, i recettori ordoranti (OR), un tipo di proteina contenente sette domini transmembranti, vengono espressi con un coreceptore (ORco) per formare un eteromero che funge da canale ionico 1 , 2 , 3 . ORs differenti rispondono a diverse combinazioni di composti chimici 4 , 5 , 6 .
Le locuste ( Locusta migratoria ) si basano principalmente sulle indicazioni olfattive per attivare comportamenti importanti 7 . Gli OR Locust sono fattori chiave per comprendere i meccanismi olfattivi molecolari. Localizzare una specifica locusta OR gene al neurone di aTipo sensilismo morfologicamente specifico da RNA In Hybridization In Situ (RNA ISH) è il primo passo per esplorare la funzione OR.
RNA ISH utilizza una sonda RNA complementare etichettata per misurare e localizzare una sequenza specifica di RNA in sezione di tessuti, cellule o montanti interi in situ , fornendo approfondimenti nei processi fisiologici e nella patogenesi della malattia. Sono state ampiamente utilizzate sonde RNA con etichettatura digossigenina (DIG-etichettata) e biotina. L'etichettatura di RNA con digoxigenina-11-UTP o biotina-16-UTP può essere preparata mediante trascrizione in vitro con le polimerasi RNA di SP6 e T7. Le sonde RNA con DIG e biotina hanno i seguenti vantaggi: non radioattivi; sicuro; stabile; Altamente sensibile; Altamente specifiche; E facile da produrre usando PCR e trascrizione in vitro . Le sonde RNA con DIG e biotina possono essere rilevate in modo cromogeno e fluorescente. Le sonde RNA con etichetta DIG possono essere rilevate con anti-digoxigenin AlkaliNe anticorpi concomitanti con fosfatasi (AP) che possono essere visualizzati con substrati chemiluminescenti altamente sensibili nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato toluidina (NBT / BCIP) utilizzando un microscopio ottico o con 2 Acido-2-fenilanilide fosfato (HNPP) accoppiato con sale di cloruro di emiciclo 4-chloro-2-methylbenzenediazonium (Fast Red) utilizzando un microscopio confocale. Le sonde RNA con biotina possono essere rilevate con anticorpi coniugati con anti-biotina streptavidina per rade di rapa perossidasi (HRP) che possono essere visualizzati con tiramidi di fluoresceina usando un microscopio confocale. Così, l'ibridazione in situ fluorescente a doppio colore può essere eseguita per rilevare due geni bersaglio in una fetta usando sonde RNA etichette DIG e biotina.
RNA ISH con sonde DIG e / o biotina è stato utilizzato con successo per localizzare i geni correlati agli olfattivi, come OR , recettore ionotropico, proteina legante odoranteE proteine della membrana del neurone sensoriale, nelle antenne insettuali di, ma non solo, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria e la locusta di deserto Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Tuttavia, ci sono due sfide sostanziali quando si esegue RNA ISH per gli OR di insetti: (1) OR geni (ad eccezione di ORco ) sono espressi a bassi livelli e solo in poche cellule, rendendo molto rilevante il rilevamento del segnale e (2) Istologia, tale che la morfologia sia preservata e il rumore di fondo è basso, può essere impegnativo. In questo documento un protocollo dettagliato ed efficace che descrive RNA ISH per localizzare i geni OR in insettoVengono presentate antenne, tra cui sia la rilevazione cromatica e la tastatura del segnale di tiramide (TSA).
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Protocol
NOTA: per limitare il degrado del RNA, preparare le soluzioni utilizzando acqua distillata autoclavata a umido (a 121 ° C per 60 min) e anche materiali autoclave a umido.
1. Preparazione di RNA ISH Antisense e Sense Probes
- Amplificazione e purificazione del gene target
- Innanzitutto, produrre un frammento a doppio filamento di L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) dal plasmide contenente il cDNA di LmigOR1 a piena lunghezza con una polimerasi Taq DNA che aggiunge adenine a entrambe le estremità dei frammenti.
- Utilizzare un volume di reazione di 100 μL, contenente 50 μL di miscela di reazione 2x, 4 μl di ciascuno dei sensori di senso e antisenso ( Tabella 1 ), 1 μL di plasmide template e 41 μL di H 2 O senza RNasi. Utilizzare il seguente PCR Protocollo: 94 ° C per 5 minuti, seguito da 30 cicli di 94 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 s e 72 ° C per 1 min, Seguita da 72 ° C per 10 min.
- Ripetere questi passaggi per produrre il frammento a doppio filamento di 1,303 bp di LmigOR2 (GenBank: JQ766966) e 1,251 bp frammento a doppio filamento di LmigORco (GenBank: JN989549). I primer utilizzati in questi esperimenti sono presentati nella Tabella 1 .
- Eseguire i prodotti PCR su gel agarosio dell'1,2% in tampone 1x Tris-acetato-EDTA e visualizzare utilizzando la colorazione del bromuro di etidio.
- Estrarre questi prodotti PCR utilizzando un kit di estrazione del gel.
- Dopo l'elettroforesi, inserire le fasce di DNA di accisa dal gel e inserire le fette di gel in un tubo da 1,5 mL. Quindi aggiungere 100 μl di buffer di legame (Buffer PN) per 0,1 g di fetta di gel. Vorticali e incubare a 50 ° C fino a quando la fetta di gel è completamente sciolta.
- Inserire una colonna di adsorbimento CA2 nel tubo di raccolta e aggiungere 500 μL di buffer di bilanciamento (Buffer BL). Ciò migliora la capacità di assorbimento e la stabilità della membrana di silice. CentriSi muove a 12.400 xg per 1 min.
- Trasferire la miscela di gel dissolta al gruppo di colonna di adsorbimento e incubare a temperatura ambiente per 2 min. Poi, centrifuga i tubi a 12.400 xg per 1 min. Scartare il flusso e reinserire la colonna di adsorbimento nel tubo di raccolta.
- Aggiungere due volte 600 μL di soluzione di lavaggio (aggiunta di etanolo, Tampone PW). Centrifugare a 12.400 xg per 1 min. Eliminare il flusso e reinserire la colonna di adsorbimento nel tubo di raccolta.
- Svuotare il tubo di raccolta e recuperare nuovamente la colonna a 12.400 xg per 2 minuti per consentire l'evaporazione di qualsiasi etanolo residuo.
- Trasferire con cautela la colonna di adsorbimento in un tubo centrifugo da 1,5 ml. Asciugare a pellet il pellet per 5-10 min e ricollegare il DNA in un volume adatto ( ad esempio, 30 μL) di acqua priva di nucleasi.
- Incubare a RT per 2 min. Centrifugare a 12.400 xg per 2 min. Scartare la colonna di adsorbimento e memorizzare il DNA a 4 ° C o -20 ° C.
- Innanzitutto, produrre un frammento a doppio filamento di L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) dal plasmide contenente il cDNA di LmigOR1 a piena lunghezza con una polimerasi Taq DNA che aggiunge adenine a entrambe le estremità dei frammenti.
- Costruire i plasmidi ricombinanti
- Individualmente lega il frammento di 387 bp di LmigOR1 , frammento di 1,303 bp di LmigOR2 e 1,251 bp frammento di LmigORco in un vettore T che contiene promotori per polimerasi RNA a T7 (a monte) e SP6 (a valle) adiacenti al DNA inserito usando ligasi del DNA di T4. Preparare la seguente 10 μL di reazione: 5 μL di tampone di legatura 2x, 1 μL di T vettore, 3 μL (~100 ng) del DNA del gene inserito e 1 μl di T4 ligasi DNA e incubare O / N a 4 ° C.
- Aggiungere 5 μl di ciascun plasmide ricombinante contenente il frammento di 387 bp di LmigOR1 , 1,303 bp di LmigOR2 e 1,251 bp di LmigORco separatamente in 50 μl di competenti Escherichia coli DH5α in tubi sterili da 1,5 ml.
- Mescolare delicatamente e mettere i tubi in ghiaccio per 30 minuti e poi incubarli per 90 s a 42° C. Trasferirli nuovamente in ghiaccio per 3 minuti.
- Aggiungere a ciascun tubo 450 μl di mezzo liquido Luria-Bertani (LB) senza ampicillina e incubarli in un agitatore a 150 giri / min per 1 h a 37 ° C per ripristinare l' E. coli DH5α.
- Prendere un'aliquota di 100 μl di ciascun trasformante e utilizzarle per inoculare le lastre di substrato solido di LB contenenti ampicillina da 50 μg / ml, 24 μg / mL isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e 40 μg / ml 5-bromo-4 -chloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-gal).
- Incubare queste piastre in un incubatore costante a 37 ° C per 18 h. Schermate i plasmidi ricombinanti di destinazione utilizzando il metodo di screening blu-bianco. Sequenza dei plasmidi ricombinanti di destinazione utilizzando sequenziamento di Sanger e identificazione delle direzioni di inserto di tre geni OR.
- Selezionare endonucleasi di restrizione per linearizzare i plasmidi ricombinanti
- Usare endonucleasi di restrizione tIl cappello non solo digerisce nel sito di clonazione multiplo del vettore ma anche non taglia il DNA dell'inserto. In questo esperimento, tutti i 3 geni vengono inseriti nel vettore T nella direzione corrispondente a quella del vettore.
- Utilizzare l'endonucleasi di restrizione Nco I per linearizzare i plasmidi ricombinanti contenenti il frammento di 387 bp di LmigOR1 , 1,303 bp di LmigOR2 e 1,251 bp di LmigORco per produrre le sonde antisenso. Utilizzare l'endonucleasi di restrizione Sp e I per produrre le sonde di sensazione.
NOTA: Se la direzione dell'inserto corrisponde a quella del vettore, viene selezionato un sito di restrizione univoco dalla fine di T7 per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA di SP6 viene utilizzata per preparare la sonda antisenso. Un sito unico di restrizione dalla fine dello SP6 viene scelto per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA T7 viene utilizzata per preparare la sonda di sensazione. Altrimenti, se la direzione dell'inserto non corrisponde a tLa direzione del vettore, quindi un sito unico di restrizione dalla fine di SP6 viene scelto per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA T7 viene utilizzata per preparare la sonda antisenso. Il sito unico di restrizione dalla fine di T7 viene scelto per linearizzare il plasmide ricombinante e la polimerasi RNA di SP6 viene utilizzata per preparare la sonda di senso.
- Purificando i plasmidi ricombinanti linearizzati
- Digest 20 μg ciascuno dei tre plasmidi ricombinanti contenenti il 387 bp frammento di LmigOR1 , 1,303 bp frammento di LmigOR2 e 1,251 bp frammento di LmigORco utilizzando l'endonucleasi restriction Nco I in una reazione di 100 μl che contiene 10 μL di tampone 10x, 40 μL di 0,5 μg / μl di plasmide, 3 μL di Nco I e 47 μl di H 2 O senza RNasi, seguita da un'incubazione di 3 ore a 37 ° C.
- Allo stesso modo, digerire 20 μg di ciascuno di questi tre plasmidi ricombinanti uCantare l'endonucleasi di restrizione Spe I.
- Purificare questi plasmidi digeriti usando un kit di estrazione del gel come descritto in 1.1.2. Determinare le concentrazioni di questi plasmidi ricombinanti linearizzati estratti mediante spettrofotometria e regolare a 0,5 μg / μL.
- Preparare antisenso e sonde sensoriali
- Utilizzare il sistema di trascrizione RNA T7 / SP6 per generare sonde antisenso e sensori. La polimerasi RNA SP6 è usata per trascrivere RNA a doppio filamento per le sonde antisense DIG e biotina per questi tre geni OR utilizzando plasmidi ricombinanti linearizzati come modelli in vitro . La polimerasi RNA T7 viene utilizzata per produrre sonde di senso. Eseguire la reazione in un volume finale di 20 μl, contenente 2 μL di 10 volte NTP mix, 2 μL di 10X buffer di trascrizione, 1 μL di inibitore della RNasi, 2 μL di T7 o SP6 RNA polimerasi, 4 μL di 0,5 μg / μl di plasmidi linearizzati e 9 μL H 2 O senza RNasi, seguitiDa un incubo di 3 ore a 37 ° C.
- Incubare le sonde antisense e sensori con DIG e biotina per 30 min con 1 μl DNasi a 37 ° C. Aggiungere 2,5 μL di 5 M LiCl e 75 μl di etanolo assoluto, quindi incubare le reazioni per 30 minuti a -70 ° C.
- Centrifugare a 15.000 xg per 30 minuti a 4 ° C. Decanta con cautela il surnatante. Aggiungere 150 μl di etanolo al 70% per lavare il precipitante. Preparare l'etanolo al 70% (1 L) aggiungendo l'etanolo al 95% (736.8 mL) in acqua distillata sterile (263.2 mL).
- Centrifugare a 15.000 xg per 30 minuti a 4 ° C e asciugare in aria il pellet per 5-10 min a RT. Aggiungere 25 μL di H 2 O senza RNasi per sciogliere le sonde antisense e sensori RNA.
- Se la lunghezza del gene inserito è più lunga di 1 kb, successivamente frammenti di RNA antisenso e sensori a una lunghezza media di ~ 300 bp per incubazione in soluzioni di tampone bicarbonato-carbonato. Eseguire la reazione in un volume finale di 50 μL, cCon 25 μL di sonda RNA e 25 μL di soluzione tampone bicarbonato-carbonato (80 mM NaHCO 3 , 120 mM Na 2 CO 3 , pH 10,2) a 60 ° C. Il tempo di idrolisi richiesto è dato da una formula pubblicata in precedenza 17 .
- Aggiungere 5 μl di 10% di acido acetico per fermare la reazione. In questo esperimento, frammentare i LmigOR2 e LmigORco antisense e sonde di sensazione per 24 e 23 minuti, rispettivamente.
T = (L o -L f ) / kXL o XL f
L o = lunghezza iniziale del frammento in ca.
L f = lunghezza del frammento finale in ca.
K = la costante di velocità per l'idrolisi, circa 0,11 kb -1 min -1
T = tempo di idrolisi in min - Infine, aggiungere 250 μl di tampone di ibridazione e conservare a -80 ° C.
2. Preparazione delle Sezioni del Cryostat
- Precool il freeziNg del microtomo a -24 ° C.
- Selezionare le nuove locuste di adulazione adulta che sono attive e che hanno antenne intatte. Tagliare le antenne in pezzi da 2-3 mm utilizzando i rasoi sterili.
- Mettere il composto OCT su un supporto di microtomo congelante e mettere uno o due campioni sul composto orizzontalmente. Quindi, trasferire il supporto nel microtomo a congelamento a -24 ° C per equilibrare fino a quando il composto si blocca. Estrarre il supporto e coprire i campioni con un piccolo composto. Trasferire il titolare nel microtomo di congelamento a -24 ° C per almeno 10 minuti ( Figura 1 ).
NOTA: Evitare di ottenere bolle nel composto. - Fissare il supporto con i campioni nel microtomo di congelamento, quindi dividere i campioni congelati in fette di 12 μm a -24 ° C.
- Fissare le fette uno ad uno su diapositive (25 x 75 mm, senza nucleasi) e asciugare all'aria per 10 min.
3. Sezioni di fissaggio
- Dopo aver preparato il criostatoMettere le diapositive in un contenitore di plastica (~ 100 x 40 x 80 mm) e fissare i tessuti incubando le diapositive in soluzione 4% di paraformaldeide (PFA) per 30 minuti a 4 ° C.
- Lavare le diapositive in 1X saline fosfato-bufferizzato (PBS) per 1 minuto.
- Per eliminare le proteine alcaline, trasferire le diapositive a 0,2 M HCl per 10 minuti.
- Per eliminare la proteina superficiale dell'acido nucleico, trasferire le diapositive a 1XPBS con 1% di Triton X-100 per 2 min.
- Lavare le diapositive due volte per 30 s in 1x PBS.
- Infine, sciacquare le diapositive in soluzione formamide per 10 minuti a 4 ° C.
4. Ibridazione
- Preparare le sonde antisenso e sensore
- Utilizzare un tampone di ibridazione per diluire le sonde di antisense o sensori di RNA nei tubi da 1,5 mL senza nucleasi. In questo esperimento, per tutte le sonde antisense e sensori ( LmigOR1, LmigOR2 e LmigOrco ), aggiungere 1 μL di sonda a 99 μL buffer di ibridazione per diapositiva. Generalmente, l'uso di diluizioni 1: 100 di sonde antisenso produce significativi segnali positivi e bassi sfondi utilizzando questo protocollo.
- Per il rilevamento cromogenico, provvedere a diluire singolarmente le sonde DIG-etichettate.
- Per il rilevamento TSA, diluire DIG marcato LmigOR1 con sonde LmigOrco marcati con biotina o DIG marcato LmigOR2 con biotina marcata LmigOR1 sonde insieme nel tampone di ibridazione.
- Scaldare le diluizioni per 10 minuti a 65 ° C e metterle in ghiaccio per almeno 5 min.
- ibridazione
- Scolare le diapositive e aggiungere 100 μL di sonde antisense e sensori diluiti (fase 4.1) alle sezioni del tessuto. Quindi, posizionare le copertine (24 mm x 50 mm, senza nucleasi) sulle sezioni del tessuto.
- Posizionare i vetri coperti orizzontalmente in una scatola umida (~ 300 x 180 x 50 mm 3 ; figura 2 ) e incubare unaT 55 ° C per 22 ore. Aggiungere una soluzione di formamide o 1X PBS al fondo della scatola per mantenere l'ambiente umido, ma non immergere le diapositive nel liquido.
- Lavaggio e blocco.
- Dopo l'ibridazione, rimuovete con attenzione le copertine. Lavare le diapositive due volte per 30 minuti in 0,1 x Saline Sodio Citrato (SSC) a 60 ° C.
NOTA: Lavatrice significa mettere le diapositive in un supporto di scorrimento che viene poi posizionato in un contenitore di plastica e agitato leggermente su un bilanciere (~ 50 rpm; Figura 2 ). - Sciacquare le diapositive in 1x Tris-Buffered Saline (TBS) per 30 s.
- Aggiungere 1 ml di reagente di blocco dell'1% in TBS completato con 0,03% di Triton X-100 su ciascuna diapositiva e incubare per 30 min. Quindi, scartare la soluzione di blocco.
- Dopo l'ibridazione, rimuovete con attenzione le copertine. Lavare le diapositive due volte per 30 minuti in 0,1 x Saline Sodio Citrato (SSC) a 60 ° C.
- Immunoistochimica.
- Per il rilevamento cromogenico, utilizzare il reagente di bloccaggio in TBS per diluire 750 unità (U) / mL anti-digoxigenina AP-coniugato antiboDa due a 1,5 U / ml soluzione AP. Aggiungere 100 μL di soluzione AP per scivolo coperto (24 mm x 50 mm).
- Per la rilevazione di TSA, utilizzare il reagente bloccante in TBS per diluire 750 U / mL di anticorpi anti-digoxigenin AP coniugati e anti-biotina streptavidina HRP-coniugata contro la soluzione AP / HRP. Aggiungere 100 μL di soluzione AP / HRP per uno scivolo coperto (24 mm x 50 mm).
- Incubare le diapositive in una scatola umida ( Figura 2 ) per 60 minuti a 37 ° C. Utilizzare la soluzione formamide o 1X PBS per mantenere la scatola umida ma non soglia.
5. Colorazione
- Rimuovere con attenzione i coperchietti. Lavare le diapositive tre volte per 5 min in 1x TBS integrato con 0,05% di Tween-20. Sciacquare le diapositive in DAP-buffer (rilevazione cromogena: pH 9,5; rilevazione TSA: pH 8,0) per 5 min.
- Colorazione (rilevazione cromogena)
- Aggiungere 100 μL di soluzione NBT (375 μg / mL) / BCIP (188 μg / mL) di substrato (diluito in DAP;PH 9,5) a ogni diapositiva. Posizionare con attenzione i coperchi (24 x 50 mm) sulle diapositive.
- Incubare le diapositive in una scatola umida con soluzione di substrato per 10 min - O / N a 37 ° C.
NOTA: Controllare lo sviluppo guardando le diapositive di tanto in tanto sotto il microscopio. - Quando lo sviluppo è pronto, arrestare la reazione trasferendo le diapositive in acqua.
- Colorazione (rilevazione TSA)
- Utilizzare una siringa per spostare il substrato HNPP (100 μg / mL) / Fast Red (250 μg / mL) dal filtro della siringa (0,22 μm; Figura 2 ).
- Aggiungere 100 μL di substrato HNPP / Fast Red per diapositiva ricoperta da una copertura (24 x 50 mm). Incubare le diapositive per 30 min con substrato HNPP / Fast Red a RT.
- Rimuovere con cura i vetrini e lavare le diapositive tre volte per 5 minuti in 1X TBS integrato con 0,05% di Tween-20.
- Utilizzare 100 μl di substrato TSA / coperto (24 x 50 mm 2 ) scorrevole. Incubare le diapositive con substrato TSA per 10 minuti a RT.
- Rimuovere le copertine con cura e lavare le diapositive tre volte per 5 min in 1x TBS con 0,05% di Tween-20.
- Incorporare le diapositive in PBS / glicerolo (1: 3).
NOTA: Dopo aver terminato queste procedure, le diapositive devono essere osservate il più presto possibile perché il segnale fluorescente si spegnerà rapidamente.
6. Osservazione
- Rilevamento cromogeno
- Osservare le sezioni del tessuto utilizzando un microscopio ottico. Scegli le lenti obiettivo 10X, 20X e 40X per osservare i risultati del rilevamento cromogeno.
- Utilizzare il software DP-BSW per analizzare i risultati e acquisire le immagini.
- Rilevamento TSA
- Osservare le sezioni del tessuto utilizzando un microscopio confocale. I geni con etichetta DIG devono essere osservati sotto la luce di 543 nm, presentando un colore rosso e i geni biotinici devono essereOsservata sotto la luce di 488 nm, presentante un colore verde. Quando emergono, presentano il colore giallo.
- Scegli le lenti obiettivo 20X e 40X per osservare rispettivamente i risultati del rilevamento TSA.
- Utilizzare il software FV1000 per analizzare i risultati e acquisire le immagini.
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Representative Results
Con rilevazione cromogenica, un piccolo sottoinsieme delle cellule antenne in ogni sezione antenne adulta è stato indicato con le sonde antisense LmigOR1 e LmigOR2 ( Figura 3 ) con DIG. RNA ISH su sezioni consecutive per localizzare LmigOR1 e LmigOR2 ha mostrato che le cellule antennali che esprimono i due geni si trovavano nei cluster ORN che esprimevano LmigORco , indicando che il putativo LmigOR1 e LmigOR2 erano effettivamente espressi in ORN ( Figura 4a -4d ). A volte, sono state visualizzate strutture etichettate come dendritiche ( Figura 4e -4f ). LmigOR1 e LmigOR2 erano entrambi localizzati ai neuroni nella sensilla basiconica ( Figura 5a-5b ), ma non erano coespressi in sensilla individuale, indicando che erano presenti in diversi basico Nic sensillium sottotipi ( Figura 5c- 5d ).
Nel rilevamento TSA, l'ibridazione in situ in fluorescenza a doppio colore ha mostrato che le cellule esprimenti LmigOR1 (colore rosso) erano localizzate nei cluster ORN che esprimevano LmigORco (colore verde), indicando che il presunto LmigOR1 è stato espresso in ORN ( Figura 6a ). Una vista ravvicinata delle aree in scatola della figura 6a è mostrata nella figura 6b . I neuroni esprimenti LmigOR1 (colore verde, figura 7a ) e il neurone esprimente LmigOR2 (colore rosso, figura 7b ) si trovavano a diversi sottotipi di sensillium basico ( Figura 7c ).
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Figura 1: Preparazione delle sezioni dell'antenna di insetti per l'ibridazione in situ RNA. (A) Il microtomo di congelamento; ( Bc ) I campioni sono incorporati in un congelatore OCT Compound. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Elementi sperimentali per l' ibridazione RNA in situ . (A) Il portavetrini e il contenitore di plastica. B ) La scatola umida. ( C ) il rocker. D ) il filtro a membrana. E ) microscopio confocale. .jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Localizzazione cellulare di LmigOR1 e LmigOR2 negli organi olfattivi. (A) Sintesi di cellule esprimente LmigOR1 in un segmento antenne locusta. ( B ) Panoramica delle cellule esprimenti LmigOR2 in un segmento antenne di locuste. Le frecce indicano le cellule che esprimono LmigOR1 ( a ) e LmigOR2 ( b ). Barre di scala = 100 μm (a e b). Le figure sono state adattate da Xu et al. 12 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Identità neuronale delle cellule antenne esprimendo LmIGORs mediante rivelazioni cromogene. (Ab) Lo schema di etichettatura LmigOR1 (a) e LmigORco (b) sonda antisenso su sezioni consecutive di antenna locusta. ( Cd ) Il modello di etichettatura della sonda antisense LmigORco ( c ) e LmigOR2 ( d ) su sezioni consecutive di antenne locuste. ( Ef ) Illustrazione di strutture a volte danneggiate (indicata da frecce rosse). Barre di scala = 50 μm (ad); 20 μm (e e f). Le figure sono state adattate da Xu et al. 12 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Nt "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figura 5: LmigOR1 e LmigOR2 sono espressi in ORN alloggiati in sensazione Basiconic. (Ab) Basiconic sensillum ospitato ORNS esprimono LmigOR1 (a) e LmigOR2 (b). ( Cd ) L'espressione di LmigOR1 e LmigOR2 in sottoinsieme distinto di ORN antenne è stata verificata in sezioni consecutive (cd). Le frecce a freccia indicano le cellule antennali che esprimono LmigOR1 (a, c) e LmigOR2 (b, d). Ba: sensilio basicico. Barre di scala = 20 μm (a e b); 50 μm (c e d). Le figure sono state adattate da Xu et al. 12 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Identità neuronale della cella antenne esprimendo LmigOR1 mediante rilevamenti TSA. (A) bicolore ibridazione in situ è stata eseguita su sezione longitudinale antennale per illustrare l'espressione di LmigOR1 (rosso) e LmigORco (verde). Localizzazione di LmigOR1- espressione di cellule in cluster di cellule che esprimono LmigORco ha confermato la sua identità neurale. ( B ) Vista ravvicinata delle aree inscatolate in a. Di tanto in tanto le strutture a forma di dendritica sono state indicate con la freccia. Le aree circondate indicano il cluster di ORN che esprime LmigORco e condivide lo stesso sensilum. Barre di scala = 50 μm (a); 20 μm (b). Le figure sono state adattate da Xu et al. 12 CLeccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7: LmigOR1 e LmigOR2 sono stati localizzati a diversi ORAN di Basiconic Sensia da TSA Detection. I segnali fluorescenti sono stati visualizzati usando sistemi di rilevazione, indicando i neuroni LmigOR1 dalla fluorescenza verde ( a ) e le cellule positive di LmigOR2 mediante la fluorescenza rossa ( b ) sono state espresse in differenti sottotipi di sensoniali basilari ( c ). Le frecce a freccia indicano le cellule antennali che esprimono LmigOR1 e LmigOR2 . Barre di scala = 20 μm. Le figure sono state adattate da Xu et al. 12 Clicca qui per visualizzare unVersione più grande di questa figura.
| Nome | sequenze |
| Lmig OR1 -sonde | 5'-AAGGGGTGGGAGACGGCCTG-3' |
| Lmig OR1 -sonda-come | 5'-CAGCTCCTCCCCAACGACAGC-3' |
| Lmig OR2-sonde | 5'-ATGGGTGAGCGTGGAGAGGC-3' |
| Lmig OR2-sonda-as | 5'-GGTCATCGCTGTGGACGTGG-3' |
| Lmig Orco-sonde | 5'-CTCGTCTGACAGCGTAACTCAC-3' |
| Lmig Orco-sonda-as | 5'-AAGACGCAGAAGAGGAAGACCT-3' |
Tabella 1: Le sequenze dei primer PCR.
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Discussion
È difficile eseguire RNA ISH per localizzare i geni OR nelle antenne degli insetti perché i livelli di espressione di geni OR, ad eccezione di ORco , sono molto bassi e che preservano fette istologiche di antenne insettiche è molto difficile. Inoltre, il rilevamento di TSA è anche molto complicato. Per risolvere questi problemi, occorre prendere le seguenti misure. Le antenne sono scelte da locuzioni adulte di recente molting che presentano cuticole sottili e morbide di antenne, che mantengono la loro morfologia sullo scivolo. I campioni congelati vengono tagliati in fette di 12 μm. Sono utilizzate sonde altamente sensibili e specifiche di biotina e DIG. Detergenti, come Tween-20 e Triton X-100, vengono utilizzati per ridurre lo sfondo in molti passaggi. Nel rilevamento di TSA, un gene altamente espresso, rispetto ad un altro gene espressamente basso, dovrebbe essere etichettato con biotina-16-UTP. Le diapositive devono essere osservate il più presto possibile perché i segnali fluorescenti si spegneranno rapidamente.
DIG-aNd le sonde con biotina hanno i vantaggi di una durata più lunga, maggiori segnali di segnale e rumore e migliori risoluzioni cellulari rispetto alle sonde radioattive 18 , 19 . Il protocollo presentato in questo documento presenta alcuni vantaggi rispetto all'intera integrazione di ibridazione in situ . Questo protocollo identifica facilmente le localizzazioni dei geni a livello cellulare, ma non può essere facilmente utilizzato per indagare i modelli di distribuzione del gene, che è più facilmente eseguito con l'ibridazione in situ in situ .
Per identificare un gene OR, sono stati presi due approcci. Uno era il rilevamento cromogenico in sezioni consecutive e l'altro era rilevamento fluorescente in una sezione. ORco è coespresso con un determinato OR come marker ORN 10 , 20 , 21 . Le cellule che esprimevano LmigOR1 o LmigOR2 erano entrambe situateA raggruppamenti di cellule LmigORco- esprimenti che li hanno chiaramente identificati come OR ( Figura 4 e Figura 6 ). Usando gli stessi approcci, abbiamo scoperto che LmigOR1 e LmigOR2 non sono coespressi in un sensilio. I risultati di questi due approcci sono corroboranti.
Questo protocollo è stato anche utilizzato con successo per localizzare LmigORco, SgreORco, SgreIR8a e SgreIR25a nelle antenne di locusta 10 , 14 . Recentemente, LmigOR3 è stato localizzato nei neuroni trilogeno sensile in L. migratoria utilizzando lo stesso protocollo 15 . Questo protocollo è stato usato per localizzare due proteine della membrana neuronale sensoriale SgreSNMP1 e SgreSNMP2 nelle antenne di S. gregaria 16 . Pertanto, questo protocollo ha affidato in modo affidabile i geni correlati ai chemosensori nelle antenne della locusta, che non solo hanno verificato questiGeni candidati, ma anche localizzato questi geni a cellule specifiche alloggiate in diversi tipi di sensilla.
In conclusione, questo protocollo altamente efficace di RNA ISH è specificatamente descritto per localizzare i geni OR, così come altri geni espressi a bassi livelli, nelle antenne degli insetti.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da divulgare né altri conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato da una sovvenzione della National Natural Science Foundation della Cina (No.31472037). La menzione dei nomi commerciali o dei prodotti commerciali in questo articolo è esclusivamente ai fini di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazioni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04 mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12% acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15 g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5% NaCl |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14 mM KH2PO4 |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80 mM Na2HPO4 |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1 M Tris-Base |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5 M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100 mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100 mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50 mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3 M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3 M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| Sodium Carbonate Buffer | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1 M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80 mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120 mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH 10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH 10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in TBS | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in TBS | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in TBS | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/mL yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/mL herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
References
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