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Sagittalebene kinematische Ganganalyse bei C57BL/6 Mäusen unterworfen MOG35-55 induzierte experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis

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Neuroscience

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Summary

Kinematische Ganganalyse in der Sagittalebene liefert präzise Informationen über wie Bewegung ausgeführt wird. Wir beschreiben die Anwendung dieser Techniken, Gang Defizite für Mäuse ausgesetzt Autoimmun-vermittelter Demyelinisierung zu identifizieren. Diese Methoden können auch verwendet werden, Gang Defizite für andere Maus-Modellen mit eingeschränkter Fortbewegung zu charakterisieren.

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Fiander, M. D., Chedrawe, M. A., Lamport, A. C., Akay, T., Robertson, G. S. Sagittal Plane Kinematic Gait Analysis in C57BL/6 Mice Subjected to MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (129), e56032, doi:10.3791/56032 (2017).

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Abstract

Kinematische Ganganalyse in der Sagittalebene wurde häufig verwendet, um motorische Defizite bei Multipler Sklerose (MS) zu charakterisieren. Wir beschreiben die Anwendung dieser Techniken, Gang Defizite in einem Mausmodell der MS, bekannt als experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) zu identifizieren. Lähmung und Motor Defizite bei Mäusen EAE ausgesetzt sind in der Regel anhand einer klinischen Bewertungen Skala. Dieser Größenordnung führt jedoch nur ordinale Daten wenig Informationen über die genaue Art der motorischen Defizite. EAE Krankheitschwierigkeit wurde auch durch Rotarod Leistung bewertet stellt ein Maß für die allgemeine motorische Koordination. Im Gegensatz dazu erzeugt kinematische Ganganalyse der hinteren Extremität in der Sagittalebene höchst präzise Informationen darüber, wie die Bewegung beeinträchtigt ist. Um dieses Verfahren ausführen zu können, sind reflektierende Markierungen auf Hind Gliedmaßen, Beweglichkeit der Gelenke zu erkennen, während eine Maus auf einem Laufband Fuß gelegt. Bewegungsanalyse Software wird verwendet, um die Bewegung der Marker während des Gehens zu messen. Kinematische Gangartparameter werden dann aus den daraus resultierenden Daten abgeleitet. Wir zeigen, wie diese Gangartparameter verwendet werden können, beeinträchtigte Bewegungen der Hüfte, Knie und Knöchel Gelenke in EAE zu quantifizieren. Diese Techniken können verwendet werden, zum besseren Verständnis der Krankheitsmechanismen und identifizieren mögliche Behandlungen für MS und anderen neurodegenerativen Erkrankungen, die Mobilität zu beeinträchtigen.

Introduction

Gang ist eine Reihe von sich wiederholenden Bewegungen der Gliedmaßen zur Fortbewegung zu erreichen. Gang besteht aus Schritt Zyklen, die in zwei Phasen unterteilt werden: die Standphase, was ist, wenn der Fuß auf dem Boden nach hinten bewegt, um treiben den Körper nach vorne; und die Schwungphase, wo der Fuß aus den Boden und bewegen nach vorne ist. Störungen des Gehens sind die typischen Merkmale der vielen neurodegenerativen Erkrankungen, wie z. B. Verletzungen des Rückenmarks (SCI), Multiple Sklerose (MS), Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Parkinson-Krankheit (PD) und Schlaganfall; präklinischen Nager-Modelle dieser Störungen rekapitulieren oft ihre jeweiligen Gangart Beeinträchtigungen1. Die grundlegende Kontrollmechanismen der Fortbewegung bei Mäusen wurden intensiv studiert2,3. Darüber hinaus gibt es Maus-Modellen von vielen menschlichen neurologische Störungen4. Ganganalyse bei Mäusen ist daher ein attraktiver Ansatz, mehrere Aspekte der motorischen Defizite zu messen, die anatomische Korrelate bekannt haben. Die Studie des Gehens in Mausmodellen kann Einblicke in die neuropathologische Grundlagen der motorischen Defizite bei neurodegenerativen Erkrankungen und ermöglicht die Identifizierung von möglichen Behandlungen.

Einige Techniken, die zur Messung der Gangart bei Nagetieren gehören Sichtprüfung (z.B., Basso Maus Maßstab5 und Freiland Test6) und Analyse der Gang von der ventralen Flugzeug-7. Methoden zur Sagittalebene Kinematik der Megalosauridae Bewegungen Messen haben vor kurzem Popularität gewonnen, weil sie mehr über die Ausführung der Bewegung Informationen und sind daher empfindlicher auf subtile Veränderungen in Gang8, 9 , 10 , 11. kinematische Techniken entwickelt, um die Megalosauridae Bewegung in der Sagittalebene studieren beim gehen auf einem Laufband-9,-12 wurden im Rahmen des SCI, ALS, kortikale traumatische Verletzungen, Schlaganfall, ausgiebig untersucht und Chorea Huntington8,9,10,11,13,14,15,16. Im Gegensatz dazu haben diese Techniken eingeschränkte Nutzung in der Studie der motorischen Defizite für Maus-Modellen von Multipler Sklerose17gesehen.

Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist die am häufigsten verwendeten Mausmodell der MS18. Die zwei wichtigsten Methoden des Verursachens EAE erfolgt über aktive oder passive Impfung. In aktive EAE sind Mäuse mit Myelin Antigene, verursachen autoreaktiven T-Zell-vermittelten Neuroinflammation und Demyelinisierung im Rückenmark und Kleinhirn immunisiert. Passive EAE, wird auf der anderen Seite durch Übertragung von autoreaktiven T-Zellen von einer Maus mit aktive EAE auf einen naiven Maus19induziert. Wie an anderer Stelle beschrieben, den Krankheitsverlauf und Neuropathologie sind beeinflusst durch das zentrale Nervensystem (ZNS) Antigen und Maus belasten20,21,22,23,24 ,25. Bei der EAE Experimente sind Kontrollmäusen komplette Freund des Adjuvans (CFA) ohne das Myelin-Antigen gespritzt. EAE zeichnet sich durch aufsteigende Lähmungen, die beginnt mit Schweif Schwäche und kann potentiell die Vorderbeine mit Ataxie und Lähmung20führt. Wir haben vor kurzem Gang Änderungen bei C57Bl/6 Mäusen unterworfen Myelin Oligodendrozyt Glykoprotein 35-55 (MOG35-55) gekennzeichnet-induzierte EAE. Diese Studien haben gezeigt, dass Ganganalyse als klassische Verhaltensanalyse überlegen sein, denn Abweichungen vom normalen Knöchel Bewegung mit dem Grad der weißen Substanz-Verlust in der Lendenwirbelsäule Rückenmark von EAE Mäusen26stark korreliert sind. Im Gegensatz dazu war die Stärke der Korrelation zwischen weißen Substanz-Verlust und zwei andere traditionelle Verhaltensmaßnahmen (klinische scoring und Rotarod) viel schwächeren26.

Wir beschreiben hier die Verwendung von kinematischen Ganganalyse, Bewegung Defizite in der Sagittalebene von EAE Mäusen gehen auf einem Laufband zu erkennen. Fünf reflektierende Markierungen wurden auf eine Megalosauridae Bewegung der Hüfte, Knie und Sprunggelenke in High-Speed-Videoaufnahmen identifizieren gesetzt. Bewegungsanalyse Software wurde verwendet, um kinematische Daten über gemeinsame Ausflüge zu extrahieren. Das Dienstprogramm dieser Techniken zu quantifizieren, Bewegung Defizite für das MOG-35-55 -Modell der EAE werden diskutiert. Diese Techniken sind auch für das Studium der Gangart Defizite in anderen Maus-Modellen von neurodegenerativen Erkrankungen.

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Protocol

dieses Protokoll des Canadian Council on Animal Care Richtlinien entspricht und von der Dalhousie University Ausschuss an Labortieren genehmigt wurde.

1. konstruieren reflektierenden Markierungen:

  1. mit einem handgeführten Locher, die gewünschte Anzahl von kleinen Kreisen von reflektierenden Papier Stanzen. Jedes Tier benötigt 5 Marker für eine einzelne Aufnahme; zwei große und drei kleine Markierungen.
  2. Mit einer feinen Schere, einen geraden Schnitt erstreckt sich von den Rand in die Mitte des Kreises stellen.
  3. Entfernen Sie das Schutzpapier des Markers, die Klebefläche zu offenbaren. Mit feinen Pinzette, halten Sie den Marker fest und curl es in sich selbst mit dem Finger in form eines Kegels. Um eine kleine Markierung machen, kräuseln des Kegels fest. Um eine große Markierung machen, kräuseln den Kegel locker.
  4. Mit handgeführten Klebepistole, füllen Sie das Innere des kegelförmigen Markers mit Leim während die Spitze des Kegels mit einer Pinzette greifen und halten die Markierung auf einem flachen Stück Karton. Der Kleber wird verhindert, dass den Marker aus zusammenbricht und biegen bei der Aufnahme um optimale Reflexion des Lichtes zu gewährleisten. Wenn der Leim ist trocken (ca. 10 min), entfernen Sie die Markierung aus den Karton mit einem Skalpell ( Abbildung 1A).

2. Bereiten Sie das Tier für die Aufnahme

  1. Anesthetize die Maus mit Isofluran Gas (2,5 %; 2 Liter/min O 2) indem man die Maus in eine Induktion-Kammer. Sobald die Maus bewusstlos ist, legen Sie sie in einen Nase Kegel auf einem umlaufenden Warmwasserbereitung Decke positioniert. Der Zweck des Anesthetization ist, die Maus für die Platzierung von Marker zu immobilisieren; der Eingriff ist nicht schmerzhaft. Tiefe der Narkose muss daher nicht bewertet werden.
  2. Aktuelle Auge Schmiermittel für beide Augen gelten.
  3. Rasieren die gewünschte Megalosauridae mit elektrischen Haarschneider. Am Knöchel beginnen Sie und erstrecken Sie sich auf die Wirbelsäule und den unteren Rand der Rippen; sicher kein Fell bleibt wie dies Marker Haftung beeinträchtigen wird.
    Hinweis: Hier wurde die richtige Megalosauridae verzeichnet; jedoch entweder Megalosauridae verwendet werden kann.
  4. Mit einem permanent-Marker, geben den Standort der Beckenkamm und das Hüftgelenk. Der Beckenkamm ist nur unter dem unteren Rand der Rippen und leicht spürbar ist, indem Sie die Knie zusammen unter der Maus ' Körper s.
    Hinweis: Das Hüftgelenk finden Sie durch Biegen und verlängern das Bein um den Punkt der Artikulation zwischen Becken und Oberschenkelknochen zu finden.
  5. Mit feinere Pinzetten, fassen Sie das Spitze Ende eine kleine Markierung und tauchen die Basis in flinke Klebstoff Leim oder eine gleichwertige Alternative. Positionieren Sie die Markierung an der Spitze der vierten Stelle und halten Sie für 2-3 s, um den Kleber trocknen lassen. Legen Sie die anderen zwei kleinen Markierungen auf die MTP-Gelenk- und Sprunggelenk in der gleichen Weise ( Abbildung 1 b).
  6. Setzen große Markierungen auf den Beckenkamm und Hüftgelenk ( Abb. 1 b) in der gleichen Weise wie die kleinen Markierungen.
  7. Entfernen Sie die Maus aus die Bugnase und sofort übertragen auf den Aufnahmeraum mit einem Transfer-Käfig. Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem stationären Laufband und lassen für die vollständige Wiederherstellung aus der Narkose.

3. Gang der Aufnahme

  1. vor der Aufnahme der Maus ' s Gang, nehmen Sie ein Bild von einem Kalibrierblock mit bekannten Dimensionen auf dem Laufband.
    Hinweis: Dies ermöglicht die Pixel in dem Video in reale Messungen konvertiert werden. Die Kamera sollte ca. 120 cm vom Laufband platziert werden.
    1. Position der Kamera in der gleichen Höhe und Ebene als das Laufband. Die Position der gleichen Kamera für die Aufnahmen nach der Kalibrierung Bild zu erhalten.
  2. Sobald die Maus aus der Narkose vollständig erholt hat, schalten Sie das Laufband auf eine niedrige Drehzahl (5 cm/s), die Maus zu Fuß beginnen zu lassen. Sicherzustellen, dass die Laufband Gürtel Richtung ist so, dass die Markierungen auf der Maus in Richtung der Kamera stehen.
  3. Erhöhen das Laufband Geschwindigkeit schrittweise bis zu 20 cm/s; das ist die ideale Geschwindigkeit für eine konsequente Gangart bei den meisten gesunden Mäusen.
    Hinweis: Obwohl es ideal, um alle Mäuse, die mit der gleichen Geschwindigkeit zu Fuß ist, möglicherweise einige nicht in der Lage, konsequent diese Geschwindigkeit zu erreichen.
    1. , Wenn die Maus nicht mehr laufen können bei 20 cm/s, reduzieren Sie die Geschwindigkeit nach Bedarf und achten Sie darauf, dies zu notieren. Reduzieren Sie die Geschwindigkeit des Laufbandes bis konsequenter Schritt Zyklen erreicht sind.
      Hinweis: Später Datenanalyse kann für unterschiedliche Geschwindigkeiten anpassen.
  4. Beginnen die Videoaufnahme, sobald die Maus stetig geht (d.h., zu Fuß in einem konsistenten Tempo, nicht Aufzucht oder Weben seitlich). Weiter aufzeichnen bis 8 bis 12 aufeinander folgenden Schritt Zyklen aufgezeichnet wurden. Für jedes Video aufzeichnen die Geschwindigkeit des Laufbandes und der Seite der Maus aufgenommen.
  5. Sobald die Aufnahme abgeschlossen ist, ist schalten Sie das Laufband und die Maus in ihren Käfig zurück. Reinigen Sie das Laufband gründlich zwischen Aufnahmen, wie Düfte von anderen Mäusen zurückgelassen wurde das Verhalten von eingehenden Mäusen verändern können. Um Stress abzubauen und Hautschäden, entfernen Sie die Markierungen nicht; ermöglichen die Mäuse, sie auf eigene Faust zu entfernen.

4. Analyse

  1. Bearbeiten der Videos mit Bewegungsanalyse Software.
    Hinweis: In unseren Experimenten verwendet wir benutzerdefinierte Skripts für Bildgebung und statistische Software entwickelt (siehe Tabelle der Materialien), die von Dr. Nicolas Stifani geschrieben wurden. Die folgenden Schritte werden mit der ausgewählten Bewegungsanalyse Software durchgeführt.
    1. Die Pixelkoordinaten der Marker aus Videos extrahieren, und die Kalibrierung Video, verwandeln die Pixelwerte in Zentimeter und Berechnung der Gelenkwinkel bei jedem Frame.
    2. Identifizieren, die Anfang und Ende eines jeden Schritt, damit Informationen über Schritt Dauer und Länge zu erhalten.
    3. Normalisieren den Schritt Zyklusdauer zu 200 normalisierte Frames, so dass Schwung- und Standphase 100 Frames bzw. vertreten sind.
  2. Mit den normalisierten Frames kinematischen Parameter für die Datenanalyse mit Tabellenkalkulations-Software zu berechnen (siehe Tabelle der Materialien).
    1. , Den durchschnittliche Winkel eines bestimmten Gelenks zu etablieren, nehmen den Mittelwert aus allen Winkeln in einem normierten Rahmen als:

      Hinweis: X steht hier für den Winkelwert am eine normalisierte gegeben Rahmen und n steht für die normalisierte Rahmennummer.
    2. Herstellen der Bewegungsumfang eines bestimmten Gelenks für eine gegebene Maus subtrahieren den kleinsten Winkel aus den größten Winkel in einen Satz von normalisierten Frames wie folgt:
      Beweglichkeit = Winkel maximale - Winkel mindestens.
      Hinweis: Hier maximale Winkel und Winkel mindestens sind die größten und kleinsten Winkel erreicht innerhalb des Zyklus normalisiert Schritt bzw..
    3. RMS Unterschied zu etablieren, zuerst subtrahieren den durchschnittliche Winkel jedes experimentelle Zeit-Punkt aus der Baseline-Aufzeichnung. Als nächstes quadratisch jeden Unterschied, den Mittelwert aller quadrierten Werte und Quadratwurzel der Mittelwert zu nehmen. Die Gleichung lautet wie folgt:

      Hinweis: hier stellt den durchschnittlichen Winkel von der Grundlinie aufzeichnen; y steht für den durchschnittlichen Winkel von jedem experimentellen Zeit-Punkt; n und steht für die Anzahl der normalisierten Frames. Root bedeutet quadrierte Differenz (RMS) ist ein Maß zur Beurteilung der Abweichung im Gangbild von Ausgangsmessungen aufgezeichnet haben.
  3. Wissenschaftliche Grafik und Statistik-Software zu verwenden, zu analysieren und präsentieren der Daten (siehe Tabelle der Materialien).

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des Verfahrens für kinematische Ganganalyse verwendet. Erste, reflektierende Markierungen gemacht und auf eine Maus an 5 anatomischen Punkten platziert. Gang wird dann aufgezeichnet, während die Maus auf einem Laufband Fuß ist. Bewegungsanalyse Software wird verwendet, um kinematische Daten für spätere Analysen zu extrahieren.

Abbildung 2A -C repräsentieren die Schritt-Zyklus einer Kontrolle CFA Maus für Hüfte, Knie und Sprunggelenk Gelenkwinkel aufgenommen in drei aufeinander folgenden Aufnahmen, die Abstand von einer Woche auseinander. Die Überlappung zwischen den Wellenformen zeigt minimale Abweichung in den Schritt-Zyklen von 1-3 Sitzungen. Abb. 2D -F repräsentieren den Schritt Zyklus einer zweiten Kontrolle CFA-Maus, die größere zu Fuß Variabilität von Aufnahme-Sessions 1-3 angezeigt. Obwohl die Zyklen Schritt entlang der y-Achse verschoben werden, bleibt die Form der Wellenformen konsistent zwischen Aufnahmen. Dieses Maß an Variabilität ist typisch für die Maus zu Fuß.

Abbildung 3A -C repräsentieren die Schritt-Zyklus einer Maus mit EAE auf drei aufeinander folgenden Aufnahmen aufgezeichnet. Gibt es nur minimale Änderungen in Gang von der ersten auf die zweite Aufnahme-Session, sondern von der dritten Sitzung, Gang wurde tiefgreifend veränderten an allen drei Gelenke. Für die Hüfte eine deutliche Abflachung über den Schritt Zyklus aufgetreten zeigt einen erheblichen Verlust der Bewegung. Das Knie ist mehr gebeugt und weniger in der Lage, zu erweitern und unterstützen das Tier Körper Gewicht geworden. Bewegungen am Sprunggelenk waren auch wesentlich verändert. Dorsalflexion des Fußes und plantar Flexion werden während der Schaukel (weiße Platte) und Haltung (grüne Tafel) Phase, verzögert. Diese Defizite sind Richtwerte der Muskelschwäche bei diesem Gelenk, da das Tier in seiner Fähigkeit, heben Sie den Fuß während der Schwungphase, sowohl den Körper nach vorne zu treiben, während der Standphase beeinträchtigt wird.

Die folgenden Daten in Abbildung 4 dargestellt wurden von Fiander Et Al. veröffentlicht. (2017) 26 mit Erlaubnis. Die Daten wurden analysiert mit One-Way Messwiederholungen ANOVA mit Holm-Sidak multiple Vergleiche-Test um zu allen Zeitpunkten zur Grundlinie26zu vergleichen. Der durchschnittliche Winkel (Abb. 4A und Abbildung 4), Bewegung (Abbildung 4 b und Abbildung 4E) und RMS Differenz (Abbildung 4 und Abbildung 4F) wurden berechnet zu jedem Zeitpunkt Gangart zu quantifizieren Defizite (n = 8 pro Gruppe). In der vorliegenden EAE-Experiment war das Auftreten von klinischen Resultate DPI 14, die nach der zweiten Woche der Aufnahme ist. CFA Mäuse zeigten keine Veränderung im durchschnittlichen Kniewinkel (Abb. 4A) oder Knie RMS Unterschied (Abbildung 4), aber eine kleine Erhöhung in Knie Bewegungsbereich aufweisen [F(2,7) = 5.871, p = 0.0083], DPI 16 und 30 relativ zur Grundlinie ( Abbildung 4 b). Diese kleine Änderung kann infolge der CFA-Injektion Schmerzen widerspiegeln. Im Gegensatz zu den CFA-Tieren, gab es große Veränderungen am Knie Gelenk für EAE Tiere für den durchschnittlichen Winkel [F(6,7) = 11,08, p < 0,0001] (Abbildung 4), Bewegungsumfang [F(6,7) = 14.42, p < 0,0001] (Abb. 4E) und RMS Unterschied (Abb. 4F). Der durchschnittliche Winkel wurde deutlich reduziert, darauf hinweist, dass EAE Mäusen die Knie während des Gehens mehr gebeugt hatte. Dies kann Muskelschwäche, hindeuten, wie die Tiere nicht in der Lage waren, ihre Kniegelenke zur Unterstützung ihres Körpergewichts zu verlängern. Die Bewegungsfreiheit war auch abgenommen, wieder wahrscheinlich aufgrund einer Unfähigkeit der Tiere, das Kniegelenk zu erweitern. Der deutliche Anstieg der Knie RMS Unterschied zeigt, dass die Bewegungen des Kniegelenks bei EAE Mäusen wesentlich von ihrer Grundlinie Aufnahme waren.

In Abbildung 5 wurden mit One-Way Messwiederholungen ANOVA mit Holm-Sidak mehrere Vergleiche-Test, der Gang Parameterwerte an klinischen Resultate von 0,5 - gegenüber 3,5 bis diejenigen erkannt an einem klinischen Score von 0 ausgewertet. Korrelative Analyse erfolgte mittels Spearman Rho (ρ) auch. Die durchschnittliche Kniewinkel (Abb. 5A), Beweglichkeit (Abb. 5 b) und RMS Unterschied (Abbildung 5) wurden stark korreliert mit klinischen Scores (p < 0,001). Diese Korrelationen zwischen Gelenkbewegungen und klassische klinische Wertung belegen die Gültigkeit der kinematischen Ganganalyse motorische Defizite für EAE Mäusen zu beurteilen. Knie-Palette von Bewegung (Abb. 5A) und RMS Unterschied (Abbildung 5) waren deutlich zurückgegangen, Beginn um eine klinische Bewertung von 2.0 (p< 0,05). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Sehbehinderte Knie Bewegungen nicht zu motorischen Defizite erkannt durch klinische Scores niedriger als 2.0 beitragen. Durchschnittliche Kniewinkel (Abb. 5 b) war verringerte sich jedoch Beginn um eine klinische Bewertung von 1.0 (p< 0,05). Dies legt nahe, dass für die Kniebewegung, durchschnittliche Winkel das empfindlichste der drei Maßnahmen.

Figure 1
Abbildung 1 : Schaltplan für kinematische Gangart mit Mäusen Aufnahme. Nachdem reflektierende Markierungen vorgenommen haben, werden sie am Beckenkamm, Hüftgelenk, Sprunggelenk, MTP-Gelenk und die Spitze der vierten Stelle platziert. Gang ist von einer Highspeed-Kamera aufgenommen, während die Maus auf einem Laufband Fuß ist. Bewegungsanalyse Software wird verwendet, um Gangartparameter für spätere Analysen zu extrahieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Beispiel für Schritt Zyklus Wellenformen in zwei Kontroll-Mäusen, die CFA erhalten
Die weißen und grünen Hintergrund repräsentieren die Schwung- und Standphase Phase. Für Maus 1 überschneiden sich die Hüfte (A), (B) Knie und Knöchel (C) Schritt Zyklus Wellenformen in 3 aufeinander folgenden Aufnahmesessions, die Abstand von einer Woche auseinander. Für Maus 2 Zyklus der Hüfte (D), Knie (E) und Knöchel (F) Schritt Wellenformen weichen leicht voneinander aufgrund der inhärenten Variabilität in unmittelbarer Verhalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Schritt Zyklus Wellenformen bei Mäusen mit EAE. Die weißen und grünen Hintergrund repräsentieren Schwung- und Standphase Phase, für drei aufeinander folgende Aufnahmen Abstand von einer Woche auseinander. Durch die 3rd Aufnahmesession, Hüfte (A), (B) Knie und Knöchel sind (C) Wellenformen durch Fortschreiten der Erkrankung EAE stark verändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Durchschnittliche Winkel, der Beweglichkeit und Root Mean squared werden verwendet, um kinematische Daten analysieren. Durchschnittlichen Winkel, der Beweglichkeit und RMS Unterschiede wurden berechnet, um motorische Defizite bei EAE Mäusen zu quantifizieren. Die durchschnittliche Kniewinkel (A) Bereich der Bewegung (B) und (C) RMS für CFA Mäuse relativ konstant geblieben. Mäuse mit EAE zeigte beeinträchtigt durchschnittliche Kniewinkel (D), Beweglichkeit (E) und RMS (F). Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt; p< 0,05, ** p< 0,01, *** p< 0,001, Differenz von Tag Post Immunisierung (DPI)-2; # p < 0,05, Differenz von Peak Defizit. Nachdruck aus Referenz 26 mit freundlicher Genehmigung von ursprünglichen Verleger. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 . Durchschnittliche Kniewinkel, Beweglichkeit und RMS Unterschied korrelieren mit klinischen Score
Korrelationsanalyse erfolgte zwischen drei kinematische Maßnahmen der Knie Bewegungen und klinische Resultate die beiden Methoden zu vergleichen. Die durchschnittliche Kniewinkel (A), Beweglichkeit (B) und RMS Unterschied (C) wurden stark korreliert mit der klinischen Resultate. Die Knie-Palette von Bewegung und RMS Unterschied verringerte Beginn eine klinische Bewertung von 2.0, während durchschnittliche Kniewinkel war früher eine klinische Bewertung von 1,0 reduziert. Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt; p< 0,05 Unterschied von klinischen Ergebnis 0.0. Für Spearman Rho (ρ) *** p< 0,001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Bei Mäusen mit EAE die zwei am häufigsten verwendeten Methoden zur Messung der motorischen Defizite sind klinische Bewertung und Latenz von einer Rotarod27,28fallen. Diese Techniken haben einige Einschränkungen. Obwohl praktisch und weit verbreitet, beschränkt klinische Bewertung durch nachgeben nur ordinale Daten, was bedeutet, dass das Ausmaß der Unterschiede zwischen klinischen Resultate sind nicht bekannt. Klinische Bewertung leidet auch nicht in der Lage, genaue Informationen über die Art der motorischen Defizite zu bieten. Rotarod Test verbessert auf einige Einschränkungen der klinischen Bewertung, sondern nur allgemeine motorische Koordination misst und misst nicht spezifische Aspekte des Gehens.

Im Vergleich dazu bietet kinematische Ganganalyse sensiblen Maßnahmen über bestimmte Aspekte der Fortbewegung, einschließlich der Bereich der Bewegung und die durchschnittliche Winkel an verschiedenen Gelenken. Subtile Defizite in der Hüft- und Kniegelenke Gelenkbewegungen für MOG35-55 EAE Mäusen wurden bei DPI9, etwa 5 bis 9 Tage vor dem Beginn der klinischen Symptome oder Rotarod Defizite26nachgewiesen. Diese Defizite blieb trotz einer kompletten Remission der klinischen Symptome und der mangelnden Rotarod Defizite26beobachtet wurden. Wichtig ist, beeinträchtigt Knöchel Bewegungen RMS Unterschied korreliert sehr gut mit Verlust der weißen Substanz im Rückenmark26gemessen.

Einige methodologische Punkte verdienen besondere Erwähnung: 1) präzise und konsistente Platzierung der gemeinsamen Marker ist entscheidend - das Hüftgelenk und Beckenkamm müssen sorgfältig anhand Herzklopfen; (2) Es ist notwendig, um Aufnahmen von 8-12 Schritt Zyklen zu erhalten. Im Durchschnitt dieser Schritt Zyklen erzeugt einen repräsentativen Durchschnitt Schritt-Zyklus, der weiter analysiert werden kann; (3) optimale Lichtverhältnisse müssen geschaffen werden, um sicherzustellen, dass die Markierungen deutlich sichtbar in den Aufnahmen sind. Wenn Markierungen nicht richtig beleuchtet werden, machen dies die Videos digitalisieren einen langwieriger Prozess, wie viele Bewegung Analyse-Programme nicht in der Lage werden, die Markierungen erfordern manuelle Tracking verfolgen.

Eine zusätzliche Einschränkung dieser Technik ist, dass es arbeitsintensiv. Z. B. zu erfassen und analysieren von Daten aus einer Gruppe von 10 Mäuse, schätzen wir, dass der gesamte Prozess dauert ca. 7,0-9,0 Stunden (h). Machen 50 Marker (5 pro Maus) nimmt etwa 2,0 h. kann Aufnahme Maus Wandern Verhalten allein oder zu zweit erfolgen. Alleinarbeit, dauert es etwa 25 min per Mausklick, während arbeiten in ein paar rund 10 Minuten per Mausklick dauert; Daher kann Aufnahme 10 Mäuse vom 1,5 h (paar) bis 4,0 h (Solo) statt. Zu guter Letzt nehmen Datenanalyse und grafische Darstellung ca. 3,5 h. Obwohl diese Technik arbeitsintensiv ist, fühlen wir uns, dass die potenziellen Einblicke in Krankheitsmechanismen von kinematischen Ganganalyse angeboten rechtfertigt diese Investition. Mit guten Verhaltens Korrelate des Krankheit-Pathologie ist nützlich, da Reihenmessungen live Maus nicht-invasiv entnommen werden können. Aufgrund der in der Nähe von perfekte Korrelation zwischen Knöchel Kinematik und lumbalen Rückenmarks weißen Substanz Verlust26, diese Methode kann verwendet werden, zu prüfen, dem zeitlichen Verlauf der Demyelinisierung und Remyelinisierung bei EAE Mäusen im Laufe eines Experiments, so dass Erholung zu bewerten.

Ganganalyse wird durch schwere Lähmungen erschwert, die Bewegung der Hintergliedmaßen beschränkt. Jedoch sogar stark gelähmt Mäuse (klinische Score > 3.0) können oft zu einem gewissen Grad ambulate. In diesen Fällen die Vorderbeine werden verwendet, um das Tier nach vorne ziehen und einige Megalosauridae Bewegung tritt die kinematische Ganganalyse gemessen werden können. Auch in diesen schweren Fällen ist es noch möglich, Wiederherstellung der Megalosauridae Funktion im Laufe der Zeit zu messen. Nur in sehr schweren Fällen (20 % von Tieren mit klinischen Resultate > 3.5 am Gipfel Krankheit, DPI 16-23) waren wir nicht in der Lage, nützliche Aufnahmen der Megalosauridae Bewegung zu erhalten. Dennoch wiedergewinnen diese Tiere in der Regel einige Megalosauridae Funktion von 30 DPI, so dass aussagekräftige Aufnahmen zu diesem Zeitpunkt bezogen werden.

Eine künftige Anwendung dieser Technik ist kinematische Daten mit gleichzeitiger elektromyographische Aufnahmen von den Megalosauridae bei Fortbewegung Kupplung. Diese Technik in Mausmodellen ALS und SCI geleistet und kann verwendet werden, um die Beziehung zwischen Muskelaktivität, Innervation und Gang zu erhellen. Diese Technik könnte auch mit mehr gekoppelt werden gezielt Modelle von MS und Demyelinisierung, die mehr diskreten Gang Defizite, einschließlich fokale EAE Modelle29,30 oder Cuprizone-induzierten Entmarkung31erzeugen können.

Die Techniken, die wir für die Messung von Gelenkbewegungen bei EAE Mäusen beschrieben haben können auch auf andere Erkrankungen angewendet werden, die Gangart zu beeinträchtigen. Deutliche Änderungen in Gang wurden für Maus-Modellen der PD, SCI und ALS Strich8,9,10,11,13,14berichtet. Z. B. Nager-Modelle von PD reduzierte Schrittlänge und Geschwindigkeit, was zu erhöhten Trittfrequenz zu Fuß Geschwindigkeit32weiterhin prägen. Kinematische Ganganalyse bietet daher starke Verhaltensstörungen Werkzeuge zum Krankheitsmechanismen aufzuklären und mögliche Behandlungen mit diesen Modellen zu identifizieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir würden gerne Sid Chedrawe für seine technische Unterstützung bei Dreharbeiten zu bestätigen. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Finanzierung von der MS Society of Canada (EGID 2983).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Camera Nikon Nikon D750 Used to film the video
Reflective tape B&L Engineering MKR-Tape-2
Fine scissors Fine Science Tools 15023-10
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Glue gun Craftsmart E231647
scalpel handle #4 Roboz R5-9884
Scalpel Blade No.10 Feather 2020-12
C57BL/6 mice Charles River Laboratories
Anesthetic machine EZ Anesthesia EZ-AF9000 Auto Flow System
Recirculating water heating blanket Androit HTP-1500
topical eye lubricant Refresh DIN00210889
Shaver Oster 78997-010
High speed camera Fastec Fastec IL3-100
High power light Smith Victor Corporation Model 700 SG (600 Watt quartz light, 120 Volts)
Light Stand Promaster LS1
Treadmill Custom built at the Zoological Institute, University of Cologne
Microsoft Excel 2016 Microsoft Version 2016
KinemaJ Nicolas Stifani This is a script generated for use with ImageJ
KinemaR Nicolas Stifani This is a script generated for use with Rstudio
Vicon Motus Vicon Motus Version 9.00
GraphPad Prism GraphPad Version 6.00

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References

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