Användning av kapslar för negativ färgning av virala prov inom biokonstruktion

Published 7/19/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Detta protokoll ger instruktioner för negativa färgprov som enkelt kan användas i BSL-2, -3 eller -4-laboratorier. Det innefattar användningen av en innovativ processkapsel som skyddar transmissionselektronmikroskopi gallret och ger användaren enklare hantering i de mer turbulenta miljöerna inom biokonstruktion.

Cite this Article

Copy Citation

Blancett, C. D., Monninger, M. K., Nguessan, C. A., Kuehl, K. A., Rossi, C. A., Olschner, S. P., et al. Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment. J. Vis. Exp. (125), e56122, doi:10.3791/56122 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Transmissionselektronmikroskopi (TEM) används för att observera ultrastruktur av virus och andra mikrobiella patogener med nanometerupplösning. De flesta biologiska materialen innehåller inte täta element som kan sprida elektroner för att skapa en bild. Därför krävs en negativ fläck, som ställer täta tungmetallsalter runt provet. För att visualisera virus i suspension under TEM måste de appliceras på små galler som är belagda med en genomskinlig yta, endast nanometer tjocka. På grund av sin lilla storlek och sårbarhet är dessa nät svåra att hantera och lätt flyttas av luftströmmar. Den tunna ytan är lätt skadad, vilket gör provet svårt eller omöjligt att bilda. Infektionsvirus måste hanteras i ett biosäkerhetsskåp (BSC) och vissa kräver en biokonduktiv laboratoriemiljö. Staining-virus i biosäkerhetsnivåer (BSL) -3 och -4 är särskilt utmanande eftersom dessa miljöer är mer turbulenta och tekniker krävs tO Använd personlig skyddsutrustning (PPE), vilket minskar fingerfärdigheten.

I den här studien utvärderade vi en ny apparat för att hjälpa till med negativa färgningsvirus i biokonstruktion. Enheten är en kapsel som fungerar som en special pipettspets. När gridar laddas in i kapseln, aspirerar användaren helt enkelt reagens i kapseln för att leverera viruset och fläckar till det inkapslade gallret, vilket eliminerar användarhantering av galler. Fastän denna teknik konstruerades speciellt för användning i BSL-3 eller -4 biokonstruktion, kan det underlätta provberedningen i vilken laboratoriemiljö som helst genom att möjliggöra lätt negativ färgning av virus. Samma metod kan också tillämpas för att framställa negativa färgade TEM-prover av nanopartiklar, makromolekyler och liknande prover.

Introduction

Transmissionselektronmikroskopi (TEM) är ett effektivt verktyg för att betrakta morfologin och ultrastrukturen hos biologiska prover som är för små för att ses med ett traditionellt ljusmikroskop 1 , 2 , 3 , 4 . TEMs skjuter elektroner genom ett mycket tunt prov som producerar en högre upplösningsbild, eftersom elektroner har en mycket kortare våglängd än ljus. Regioner av provet som böjer eller blockerar elektroner verkar mörka, medan områden som är elektronlucenta framträder vita.

Brist på elektronens täta materia gör att virus är svåra att se under en TEM eftersom de inte kan sprida elektroner. Negativ färgning är den vanligaste metoden för att skapa kontrast och visa virus med en TEM. Den första negativa färgproceduren föreslogs av Brenner och Horne 1959, baserat på ett experiment där Hall (1955) och Huxley (1957) observeradeVid utseendet av biologiska strukturer i omvänd kontrast när nedsänkt i ett elektrontät ämne 5 . Processen med negativ färgning har varit i stort sett oförändrad under det senaste halvan. Negativ färgning innebär kort applicering av en tungmetallsaltlösning på ett prov på ett TEM-nät i ett försök att omge viruset med tätt material utan att infiltrera viruset 6 . Detta skapar en mörk gräns och avslöjar partikelns form 5 . Denna studie använder två reagens för negativ färgning, uranylacetat (UA) och kaliumfosphotungsticsyra (PTA). Båda dessa fläckar brukar användas för att fläcka små biologiska prover negativt, såsom virus, proteinkomplex och nanopartiklar 7 , 8 , 9 .

Den konventionella negativa färgningstekniken är den manuella dropp-negativa färgteknikenNique 7 . Denna metod kräver exakt hantering av små, ömtåliga TEM-nät med tång för att applicera små mängder virusprov, fläck och sköljningar. Det typiska beredningsprotokollet innefattar applicering av en dropp av provsuspension på ytan av ett filmbelagt TEM-galler ( Figur 1A ). Efter anslutning av provet till filmytan sköljs gallret för att avlägsna icke vidhäftande virus och färgas med antingen UA eller PTA i några sekunder till en minut beroende på typ av prov. Överskottsvätska är borta från gallret genom att röra ett stycke filterpapper till kanten av gallret.

Den manuella droppmetoden kräver att varje galler ska tillverkas individuellt. Om de inte hanteras noggrant, kan de belagda TEM-rutorna enkelt punkteras, böjas eller förorenas. Bearbetning av flera prover kan leda till svårigheter att spåra nätet och säkerställa konsekvent färgning för varje prov. Denna manuell färgprocess är mycket mer dEffektiv vid genomförandet av biosäkerhetsnivå (BSL) -3 och -4 biokonstruktionslaboratorier, på grund av personlig skyddsutrustning (PPE) som krävs för dessa miljöer. PPE är besvärlig och biokontainerns miljö är mycket mer turbulent jämfört med ett vanligt laboratorium. Personal som arbetar i BSL-3 biokonstruktionslaboratorier måste ha 2 par handskar och arbeta i ett biosäkerhetsskåp (BSC). Detta dubbla lager av handskar minskar taktil känslighet och begränsar fina motorrörelser. Luftflödet av BSC som skyddar användaren och hjälper till att förhindra provförorening kan orsaka att prov och fläckar torkar för snabbt vilket på så sätt påverkar fläckkvaliteten. Den starka turbulenta luftflödet i BSC kan också snabbt blåsa bort ett nät som inte är väl säkrad. I BSL-4 biokonstruktionslaboratorier finns ytterligare säkerhetskrav. Personalen är skyldig att bära en positiv tryckdräkt, vilket ytterligare begränsar fysisk rörelse och förmågan att tydligt se och hanteraUlate grids. Teknikern som arbetar i BSL-4 har också minst två par handskar, varvid ytterparet är en tjock handske som kraftigt minskar fingerfärdighet och taktil känsla. Slutligen är de tångar som används för att hantera TEM-galleren skarpa, vilket därmed utgöra en risk för tekniker på grund av deras förmåga att punktera handskar. Med kapslar innehållande galler är inte tångar nödvändiga, vilket ger ett säkert, tångfritt alternativ för att manipulera galler i biokonstruktion. Slutligen tillhandahåller kapslarna också ett effektivt sätt att lagra galler under bearbetning, osmiumdampdekontaminering och under lagring; Därigenom håller nätet organiserat och säkert från skador.

I denna rapport introducerar vi en ny metod för negativa färgning av TEM-gridar i biokonstruktionslaboratorier som använder mPrep / g-kapslar, en kapselbaserad anordning för gridhantering och färgning 10 , 11 , 12 . Kapseln accomModifierar två TEM-nät, minimerar direkt hantering och minskar risken för nätskador. Kapseln fästs direkt på en en- eller flerkanalig pipett på samma sätt som en pipettspets, vilket möjliggör applicering av olika vätskor till galler som ingår i. Detta möjliggör simultan förberedelse av flera prov med dubbletter ( figur 1B ). Till negativ fläck med kapslar aspireras virusprovet i kapseln och hålls i 10 minuter för att låta virusen adsorberas på gallerytorna. Risterna med adsorberat virus tvättas därefter med avjoniserat (dl) vatten och färgas med antingen UA eller PTA i några sekunder till 1 min. Denna process använder samma protokollsteg och reagens som manuell droppmetod; Skillnaden är att allt arbete inträffar inuti kapseln utan fysisk hantering av gallret. ( Figurerna 1C , 1D ).

Syftet med denna studie var att utvärdera kapslar somEn ny metod för negativ färgning av virusprover i bio-miljöer. Denna studie undersökte också kvaliteten på TEM-bilder som framställts av två olika virusinaktiveringsprocedurer: 1) snabb inaktivering med 1% osmiumtetroxidånga och 2) 24 timmars inaktivering med 2% glutaraldehyd. Båda dessa utfördes med användning av kapslarna. Slutligen utvärderade vi två vanligen använda negativa fläckar, UA och PTA, för användning i kapseln. 13

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Experimentberedning i en BSL-2 miljö före arbetet med virusproverna

  1. Förbered eller köp Formvar och kolbelagda TEM koppar galler, vanligtvis 200-400 mesh.
  2. Sätt in de belagda TEM-rutorna i kapslar.
    1. Använd en förstorad lins för att göra denna process enkel att utföra. Ett eller två galler kan sättas in i varje kapsel. Förladda kapslar kan köpas för att eliminera detta steg om så önskas.
  3. Överför kapslarna med insatta TEM-belagda galler, tillsammans med andra förnödenheter och reagenser, till biokonfiguration där virusen kommer att färgas negativt.

2. Kapselmetoden för negativ färgning i biokonfiguration med användning av vattenhaltig glutaraldehyd och 1% osmiumtetraxidånginaktivering

  1. Inuti biocontainment BSC, aspirera 40 μl virus suspension i kapseln fäst vid en pipett.
    OBS: Pipetten förblir fäst till thE kapsel tills processen är klar. Viruspreparat är enligt vår tidigare publikation 14 .
  2. Placera pipetten på sin sida i 10 minuter med galler orienterade horisontellt. Detta är att främja en jämn fördelning av viruspartiklar på de belagda galleren.
  3. Inaktivera virus i kapseln inuti biocontainment-BSC.
    1. Plocka upp pipetten och tryck in kolven för att avge viruslösningen i en spillbehållare.
    2. Aspirera 40 μL 2% glutaraldehydfixeringsmedel i kapslarna.
      Varning: Glutaraldehyd är en farlig kemikalie och kräver lämpligt skydd. Glutaraldehyd kan användas i korta perioder i ett normalt BSC, men utökat öppet reagens kräver arbete i en ledad BSC eller kemisk avloppshuvud.
    3. Placera pipetten på sin sida i 20 minuter. Detta är för att säkerställa att proverna är väl fixade.
    4. Expel fixativet och aspirera 40 μl dl vatten i kapslarna till wAska bort fixativet. Upprepa detta tvättsteg för totalt 3 sköljcykler.
  4. Aspirera 40 μL av antingen 1% uranylacetat (UA) eller 1% kaliumfosfotungstensyra (PTA) i kapslarna och låt sitta i 30 s.
    OBS: Färgtid kan variera från 10 s till 1 min baserat på virusprov.
    Varning: UA är en alfasemitter och ett kumulativt toxin. Hantera det med lämpligt skydd.
  5. Ta bort kapseln från pipetten och torka gallret genom att röra ett stycke filterpapper i kanten av gallret medan gallret ligger kvar i kapseln.
  6. Osmium tetroxidånga inaktiveringsprocedur.
    1. Placera kapseln, med locket öppet, i ett 50 ml centrifugrör innehållande filterpapper blöt i en 1% osmiumtetroxidlösning.
      OBS: Osmiumtetroxid är extremt giftigt med lågt ångtryck. Den måste användas i en ledad BSC eller kemisk avloppsugn. Hantera det med lämpligt skydd. Skicka varningInformation inom arbetsområdet.
    2. Försegla 50 ml-centrifugröret under 1 h för att tillåta fullständig permeation av osmiumtetroxidångan. Därefter dekontaminerar och överför sedan röret från biokonstruktionen till BSL-2 EM-anläggningen.
  7. Ta bort EM-gallret från kapseln.
    1. I BSL-2 EM-anläggningen tar du bort kapseln från centrifugröret och placerar den på en pipett.
    2. Aspirera 40 μl dl vatten i kapseln och disponera vattnet i en avfallsbehållare tre gånger.
    3. Ta bort kapseln från pipetten och torka gallret med hjälp av filterpapper för att röra kanten på gallret.
    4. Efter lufttorkning, lagra gallret för efterföljande TEM-bildbehandling.

3. Kapselmetoden för inaktivering i biokonstruktion med 2% glutaraldehyd följt av negativ färgning i ett BSL-2-laboratorium

  1. Virusinaktiveringsprocedur.
      Varning: Glutaraldehyd är en farlig kemikalie och kräver lämpligt skydd. Glutaraldehyd kan användas i korta perioder i ett normalt BSC, men utökat öppet reagens kräver arbete i en ledad BSC eller kemisk avloppshuvud.
    1. Inaktivera virus med fixativ i minst 24 timmar före förpackning, dekontaminering och överföra den till BSL-2 EM-anläggningen.
  2. I BSL-2 EM-anläggningen, aspirera viruset och fixativblandningen i kapseln, innehållande två TEM-galler, fästa vid en pipett.
  3. Placera pipetten horisontellt i 10 minuter med gallret orienterat horisontellt.
    OBS! Det här är att främja en jämn fördelning av viruspartiklar på TEM-rutorna.
  4. Plocka upp pipetten och tryck in kolven för att utvisa viruset till en avfallsbehållare. Aspirera 40 μl dlVatten in i kapslarna och exponera det i avfallsbehållaren under 3 sköljcykler.
  5. Aspirera 40 μL av antingen 1% UA eller 1% PTA i kapslarna under 30 s.
    OBS: Färgtid varierar från 10 s till 1 min baserat på virusprov.
    Varning: UA är en alfasemitter och ett kumulativt toxin. Hantera det med lämpligt skydd.
  6. Ta bort kapseln från pipetten och torka gallret genom att röra kanten på gallret på en bit av filterpapper. Lufttorka gallret och lagra dem för efterföljande TEM-bildbehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kapselmetoden ger god kvalitet negativ färgning för TEM-bildbehandling:

Först utvärderade vi kvaliteten på bilder som genererades genom att använda både manuell droppmetod och kapselmetoderna för negativ färgning Zaire ebolavirus. Ebolaviruses är medlemmar av Filoviridae- familjen, tillsammans med Marburg-virus. Ebolavirus är typiskt 80 till 100 nm i diameter och kan vara över 1 000 nm i längd. Ebolavirus måste hanteras i en biokonstruktionsmiljö BSL-4. Figur 2 visar bilder genererade med hjälp av manuell droppmetod och kapselmetoden för negativ färgning. Figur 2A (manuell droppmetod) och Figur 2B (kapselmetod) visar ebolavirusprover som har tydligt definierade detaljer med nukleokapsidstrukturer i centrum av virionen och synligt ebolavirus glykoproteinS på ytan. Således har både kapsel- och droppmetoderna förmågan att framställa liknande TEM-bilder av hög kvalitet.

Jämför och utvärdera EM-bildkvalitet efter snabb inaktivering med vattenhaltig glutaraldehyd och 1% osmiumtetroxidånga mot 24 timmars inaktivering med 2% vattenhaltig glutaraldehyd, med kapslingsmetoden:

Vi utvärderade kvaliteten på TEM-bilder genererade av två olika metoder för provinaktivering med Chikungunya-virus. Chikungunya-viruset är en medlem av familjen Alphavirus i familjen Togaviridae . Den är sfärisk med en diameter av 60-70 nm. Virionen innehåller ett kuvert rik på glykoproteiner som bildar trimera spikar på viralytan. Chikungunya-viruset måste hanteras i BSL-3. Snabb inaktivering uppnås med användning av 2% glutaraldehyd under 20 minuter följt av en 1 h exponering för 1% osmiumtetroxidånga, med hela negAtivfärgningsprocessen som inträffar i en kapsel inom ett BSC i biokonstruktionslaboratoriet ( Figur 1C ). När man använder 2% glutaraldehyd i 24 timmar för att inaktivera viruset inträffar inaktiveringen i en biokonduktiv miljö, men 1% UA-negativ fläckproceduren utförs med användning av kapselmetoden i ett BSL-2-laboratorium ( Figur 1D ). Dessa inaktiveringsprocedurer producerar inte samma kvalitetsbilder ( Figur 3 ). Det framgår av figur 3 att fixering i glutaraldehyd utan närvaro av osmiumtetroxid ( Figur 3A , 3B ) visar mer ultrastrukturell detalj än prover framställda med glutaraldehyd och osmiumtetroxid ( Figur 3C , 3D ).

Kapselmetoden fungerar bra med användning av uranylacetat (UA) och fosfonOtungstic syra (PTA) som negativa fläckar för aldehydfasta prover.

Exempel på UA- och PTA-negativ färgning med användning av kapselmetoden visas i figur 4 på aldehydfixerade virusliknande partiklar (VLP). VLP: erna är sammansatta i virusliknande strukturer, men innehåller inga virusgenetiska material. De används vanligtvis vid vaccinutveckling och grundläggande viral forskning. Negativ färgning är ett värdefullt verktyg för att utvärdera VLP-montering och morfologi. Vi använde både UA och PTA för negativ färgning av VLP med kapselmetoden. Båda fläckarna visar högkvalitativa resultat med glykoproteins synliga och tydligt definierade gränser för Ebola nano-VLPs 15 ( Figur 4A , 4B ) och Murine Leukemia VLPs 16 ( Figur 4C , 4D ).


Figur 1: Negativ färgning Metoder Översikt. ( A ) Manuell droppmetod utförs genom sekventiellt rörliga TEM-rutor från dropp till dropp av prov, sköljningar och fläckar. ( B ) Inställning av kapselmetoden med galler och applicering av provupphängning. ( C ) Typiskt förfarande med användning av kapselmetoden vid biokonstruktion med kortvarig inaktivering med 1% osmiumtetroxidånga. ( D ) Rekommenderat förfarande med kapselmetoden vid biokontainering med långvarig inaktivering med 2% glutaraldehyd. Figur publicerades tidigare och återanvänds med tillstånd från referens 13 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.


Figur 2: Jämförelse av 1% PTA negativa färgade ebolaviruspartiklar. ( A ) Negativ färgad med manuell droppmetod. ( B ) Negativ färgad med användning av kapselmetoden. Figur publicerades tidigare och återanvänds med tillstånd från referens 13 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3: 1% UA-negativ färgning med kapselmetoden för Chikungunya-virus med användning av olika inaktiveringsförfaranden. ( A , B ) inaktivering under minst 24 timmar med endast 2% glutaraldehyd. ( C ,D) Snabb inaktivering med 2% glutaraldehyd och 1% osmiumtetroxidånga. Figur publicerades tidigare och återanvänds med tillstånd från referens 13 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4
Figur 4: Exempel på fosfotungstensyra (PTA) och uranylacetat (UA) negativt färgade virusliknande partiklar (VLP) med användning av kapselmetoden. ( A ) Översikt över låg förstoring av 1% PTA-färgad ebola nano-VLP. ( B ) TEM-bild med stor förstoring som visar strukturella detaljer av PTA-färgade ebola-nano-VLP. ( C ) Låg förstoringsöversikt av 1% UA-färgade Murine Leukemia VLPs. ( D ) TEM-bild med stor förstoring som visar strukturell detAils av UA färgade Murine Leukemia VLPs med ebolavirus glykoprotein på deras yta. Figur publicerades tidigare och återanvänds med tillstånd från referens 13 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Negativ färgning är en värdefull TEM-teknik för att utvärdera och dimensionera virus, proteinkomplex och nanopartiklar. Droppberedning av dessa prover genom manuell flyttning av galler från reagens till negativa fläckar har varit det klassiska protokollet i mer än ett halvt sekel. Det är en enkel process, men kräver expertis som uppnåtts genom träning för framgångsrik avslutning. Utmärkt negativ färgning betraktas fortfarande som en toppmoderna färdighetssats och mycket önskad i många TEM-laboratorier. Kapselmetoden har flera olika fördelar jämfört med manuell droppmetod, speciellt i biokonstruktionslaboratorier. För det första kräver manuell droppmetod väsentlig träning och erfarenhet innan den kan utföras framgångsrikt, medan den enkla användningen av kapslingsmetoden kan utföras av ingående tekniker genom enkel pipettering. Den största utmaningen med den manuella droppmetoden är den framgångsrika hanteringen av TEM-raderna med tang i BSL-3 och BSL-4 PPE på grund av tO den starkt reducerade taktila sensationen och fingerfärdigheten Bräckliga belagda TEM-galler kan lätt skadas eller punkteras med tångar. Skador på det belagda TEM-nätet avslöjas ofta inte förrän det ses med en TEM. En andra fördel med kapslar är att TEM-galler endast hanteras direkt när de sätts i kapslar och när de avlägsnas för införande i elektronmikroskopet. Oavsett om man arbetar inom biokonstruktionslaboratoriet eller i BSL-2 EM-anläggningen, finns det ingen direkt näthantering. En tredje fördel med kapselmetoden är att båda sidorna av gallret är täckta av virus och fläckar. Detta kan vara användbart när provkoncentrationen är låg; Detta kan dock orsaka för mycket prov om koncentrationen är hög eller resultera i utspädning av provet före användning.

Negativa färgning av flera nät som använder manuell droppteknik är tidskrävande eftersom varje prov måste vara individuellt förberett och färgat. Detta leder till svårigheter obtaiNing konsekvent, reproducerbar färgning. Dessutom är det alltid en utmaning att hålla reda på många enskilda nät. Varje kapsel innehåller två rutor och flera kapslar kan fästas på en flerkanalspipett och effektiviserar processen. Därför säkerställer kapslar att gallret färgas med en mycket liknande process, under konsekventa provbetingelser och samtidigt. Kapslarna kan märkas för att hjälpa till med organisationen, vilket reducerar potentialen för blandning eller felidentifiering av nät. Ett annat vanligt problem som uppstår vid användning av manuell droppmetod är gridförorening. Detta kan inträffa när gallret lämnas utomhus i alltför lång tid eller tappas. Kapseln skyddar TEM-rutorna från friluft och håller dem säkert så att de aldrig släpps. Kapslar ger större experimentell kontroll och repeterbarhet vid beredning och negativ färgning eftersom kapseln är en mer kontrollerad miljö.

Kapslarna kan köpas förbelastad om desired. Manuell laddning av gallret i kapslarna kräver viss övning för att säkerställa att gallret inte skadas. Kapselmetoden kräver också något mer prov och fläck än manuell droppmetod. Kapselmetoden kräver minst 40 μL prov, jämfört med manuell droppmetod, som kan utföras med så lite som 8 μL.

Virusinaktivering är en viktig del av negativ färgning i BSL-3 och BSL-4, eftersom det tillåter att det inaktiverade viruset tas ut från biokonstruktionslaboratorierna för bildbehandling i EM-anläggningen. Inaktivering med hjälp av fixativ har den extra fördelen att fästa viruset, vilket förhindrar nedbrytning. Det finns två olika sätt att inaktivera virusprovet, vilka båda undersöktes i denna studie. Den första adherer viruset till belagda TEM-gridar, fixar virusen i 20 minuter i en 2% glutaraldehydlösning följt av 1 timmars exponering av gallret till osmiumtetroxidånga ( Figur 1C ). Detta inaktiverarJonmetod är fördelaktig eftersom det sparar tid genom att möjliggöra att provet tas ur biokonstruktionslaboratoriet efter 1 timme och 20 minuter. Det förhindrar också spädning av virus före applicering på det belagda TEM-nätet, så det kan vara nödvändigt för prover som misstänks vara nära TEM-detektionsgränsen. Imidlertid minskar 1% osmiumtetroxidånga kvaliteten på TEM-bilder, eftersom osminet kan ytterligare fläcka provet ( Figur 3 ). Tidigare rapporter visar en 5 min exponering för osmiumtetroxidånga ger bra resultat vid negativ färgning. Emellertid alstrade längre exponering för absolut viral deaktivering en blandning av positiv och negativ färgning 17 . Den andra inaktiveringsmetoden innefattar minst 24 h i en 2% glutaraldehydlösning och kräver inte osmiumtetroxidångbehandling ( Figur 1D ). Denna andra metod tar längre tid att slutföra eftersom provet inte avlägsnas från biokonstruktionslaboratorietRatory i 24 h, men kan vara fördelaktigt eftersom det medger att negativ färgning görs utanför biokonstruktion i en BSL-2-miljö och eliminerar behovet av farlig osmitetroxid. Våra resultat visar att 24 h av glutaraldehyd-inaktivering ger TEM-bilder av högre kvalitet än när prov behandlas med osmiumtetroxidånga ( Figur 3 ).

Två negativa fläckar användes i detta experiment: UA och PTA. Båda fläckarna används som 1% lösning. UA, acetatsaltet av uran, fungerar bra som en negativ fläck eftersom täta uranatomer sprider elektroner 5 . PTA, en heteropoly-syra, fungerar på samma sätt som en negativ fläck på grund av täta volframatomer 5 . PTA föredras ibland över UA eftersom det är mycket mindre giftigt och endast mildt irriterande vid inandning eller kontakt. Vid negativ färgning av fästa prover måste det lägre pH-värdet av UA beaktas eftersom det kan orsaka skada tO provet Virusen som används i detta experiment kräver fixering för inaktivering, så både UA och PTA uppnådde liknande resultat och ingen särskild fördel kunde detekteras för antingen fläck. Båda fläckar är lätta att arbeta med, och de båda producerar liknande TEM-bilder av hög kvalitet ( Figur 4 ).

Sammantaget är kapselmetoden lättare att använda i en biokonduktiv miljö och kan användas som ett alternativ till manuell droppmetod. Användning av kapslar underlättar provmanipuleringsfel och ger TEM-bilder av god kvalitet. Bilderna som produceras med kapselmetoden är jämförbara med bilder som produceras med manuell droppmetod. Kort virusinaktivering med osmiumtetroxid förbättrar hastigheten, men bör endast användas om reducerad bildkvalitet är acceptabel, eller det misstänks att utspädningen kommer att sätta det under TEM-detektionsgränsen för proceduren. Både UA och PTA ger liknande resultat med de fasta virusprover som används i denna studie; hoWever, resultat kan vara annorlunda vid färgning av obearbetade virus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Åsikter, tolkningar, slutsatser och rekommendationer som anges i artikeln är författarnas och inte nödvändigtvis godkändes av den amerikanska armén eller försvarsdepartementet.

Acknowledgements

Vi vill erkänna och tacka Dr John Carra och Rowena Schokman för att tillhandahålla renade Ebola nano-VLP, Dr. Rajini Mudhasani för att tillhandahålla Chikungunya-virus och Dr Charles (Jason) Shoemaker för att tillhandahålla murin leukemi VLP som uttrycker Ebolavirus glykoproteiner. Vi vill också tacka MAJ Carl Soffler för att underlätta Summer Internship Programmet (SIP) och Science and Engineering Apprenticeship Programme (SEAP) och Dr. Catherine Wilhelmsen för labsäkerhetsutbildningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formvar/carbon coated TEM grids SPI 3420C-MB 200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules EMS 85010-01 box
mPrep/f couplers EMS 85010-11 standard 16/Pk
glutaraldehdyde EMS 16320 50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide EMS 19190 4% aqueous solution
Uranyl Acetate EMS 22400 powder
Potassium phosphotungstic acid EMS 19500 powder
filter paper Whatman 1450-090 size 50
Tranmission Electron Microscope JEOL JEM-1011 TEM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37, (4), 403-422 (2014).
  2. Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355, (9216), 1713-1717 (2000).
  3. Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37, (2), 91-106 (2006).
  4. Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22, (4), 552-563 (2009).
  5. Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. Negative staining of proteins. Electron Microsc Rev. 3, (1), 43-72 (1990).
  6. Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
  7. Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
  8. Bradley, D. E. Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins. Bacteriol Rev. 31, (4), 230-314 (1967).
  9. Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94, (3-4), 305-308 (1987).
  10. Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, Suppl 3. 721 (2015).
  11. Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23, (5), 30-37 (2015).
  12. Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, Suppl 2. 174-175 (2011).
  13. Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
  14. Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7, (3), 857-872 (2015).
  15. Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228 (2015).
  16. Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. 403419 (2011).
  17. Barland,, Rojkind, M. Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212, (5057), 84-85 (1966).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats