Leben Sie Imaging, gefolgt von einzelligen Tracking Monitor Zellbiologie und die Linie Fortschreiten der mehrere neuronalen Populationen

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Summary

Ein robustes Protokoll zum neuronalen Populationen von Time-Lapse Video-Mikroskopie, gefolgt von Post-Processing Software-basierte Überwachung wird beschrieben. Diese Methode stellt ein leistungsfähiges Werkzeug zur biologischen Ereignisse in einer ausgewählten Population während live-imaging-Experimente zu identifizieren.

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Gómez-Villafuertes, R., Paniagua-Herranz, L., Gascon, S., de Agustín-Durán, D., Ferreras, M. d. l. O., Gil-Redondo, J. C., Queipo, M. J., Menendez-Mendez, A., Pérez-Sen, R., Delicado, E. G., Gualix, J., Costa, M. R., Schroeder, T., Miras-Portugal, M. T., Ortega, F. Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations. J. Vis. Exp. (130), e56291, doi:10.3791/56291 (2017).

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Abstract

Das Verständnis der Mechanismen, die wichtige biologische Gefahrenlagen neuronale Zellpopulationen wie Proliferation, Differenzierung oder Zelle Schicksal Entscheidungen steuern wird für therapeutische Designstrategien für viele Krankheiten, die das Nervensystem entscheidend sein. Aktuelle Methoden zur Zell-Populationen verfolgen verlassen sich auf ihre endgültigen Ergebnisse in Standbildern und sie in der Regel keine ausreichenden zeitlichen Auflösung, verhaltensbezogene Merkmale in einzelnen Zellen zu identifizieren. Darüber hinaus Abweichungen in Zelltod, Verhaltensstörungen Heterogenität innerhalb einer Zellpopulation, Verdünnung, Verbreitung oder die geringe Effizienz der Marker verwendet, um Zellen zu analysieren sind alle wichtigen Handicaps, die unvollständig oder nicht korrekt auslesen der Ergebnisse führen wird. Umgekehrt stellt die Durchführung live Imaging und einzelne Zelle Verfolgung unter geeigneten Bedingungen ein mächtiges Werkzeug für jedes dieser Ereignisse zu überwachen. Hier wird ein Time-Lapse Video-Mikroskopie-Protokoll, gefolgt von Post-Processing, beschrieben, um neuronale Populationen mit einer einzelnen Zelle Auflösung, Einsatz von spezifischen Software zu verfolgen. Die beschriebenen Methoden können Forscher zu wesentlichen Fragen der Zelle Biologie und Linie Fortschreiten der unterschiedlichen neuronalen Populationen richten.

Introduction

Um neue und effektivere therapeutische Strategien zur neuronalen Populationen regenerieren zu entwickeln, müssen wir zuerst die grundlegenden Mechanismen verstehen, die Zellen mit einem regenerativen neuronale Potenzial zu pflegen. Dieses Ziel zu verfolgen, erfordert ein umfassendes Wissen über die Faktoren, die die Balance zwischen Ruhe, Verbreitung/Differenzierung, der Modus und Zeitpunkt der Teilung, Zellzyklus Länge, wandernde Kapazitäten, Lebensfähigkeitzu regulieren. Obwohl es einen technischen Ansatz, der viele Jahre1beschäftigt war ist, Leben Bildgebung und direkter Beobachtung bleiben immer noch die beste Option, um den oben aufgeführten Ereignissen überwachen. Im Gegensatz zu vielen anderen Ansätzen zentriert auf Endpunkt Auslesen live imaging und Einzelzelle tracking liefern Informationen über die gesamte Länge von einem Experiment2,3,4,5, 6. damit, die Zugabe von zeitlicher Auflösung ermöglicht Zelltod, heterogene Zelle Verhalten oder Zelle Schicksal Entscheidungen, sowie viele andere kritische Ereignisse identifiziert werden, die sonst passieren könnte unbemerkt. Im Idealfall sollten diese Funktionen von Zellen am besten auf die einzelne Zelle Ebene in vivo überwacht werden wo beide intrinsische (Zelle autonome) und extrinsische (Zelle Nischen-) Hinweise berücksichtigt werden.

Jedoch obwohl in der in-vitro- Situation Ereignisse in einer Umgebung, die das natürliche Milieu nicht reproduziert auftreten, die Low-Density Kulturbedingungen, die in der Regel in diesen Protokollen verwendet eignen sich eher intrinsische Eigenschaften zeigen die Zellen. Darüber hinaus kann eine einfache Steuerung des umgebenden Milieus, indem Sie ändern einfach das Wachstumsmedium darstellen ein wertvolles Werkzeug, um die individuelle Rolle jedes extrinsischer Faktor, der die neuronale Nische definiert sowie Umweltfaktoren, die möglicherweise zu untersuchen in pathologischen Szenarien7,8,9,10,11,12,13induziert werden. Daher, wenn richtig konfiguriert, wie im Protokoll, die hier vorgeschlagenen, bietet live Imaging machbar in-vitro- Lösung um die meisten der zuvor aufgeführten Fragen befassen.

Dieses Protokoll beschreibt in Kürze die Hardware, Software, Kulturbedingungen und die wichtigsten Schritte erforderlich, um ein live-imaging Experiment gefolgt von einzelligen tracking erfolgreich auszuführen. Dieser Ansatz bietet wertvolle Informationen, die hilft, um wesentliche Aspekte der Biologie und der Abstammung Progression, mehrere neuronalen Populationen zu offenbaren.

Protocol

Die folgenden Abschnitte beschreiben die erforderlichen Schritte zum live Imaging gefolgt von einzelligen Verfolgung von mehreren neuronalen Populationen (Abbildung 1) durchführen. Die Verfahren, die mit Tieren, die in diesem Protokoll beschrieben werden müssen durchgeführt nach den Richtlinien des Internationalen Rates für Laboratory Animal Science (ICLAS).

Figure 1
Abbildung 1. Schema veranschaulicht die wichtigsten experimentellen Schritte des Verfahrens, d.h.: Zell-Kultur live Imaging, PICC und Datenerhebung, Einzelzelle, die Verfolgung und das Endergebnis. Die Schritte sind nach der Arbeitsablauf des Protokolls nummeriert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

(1) Zellkultur: Isolierung und Beschichtung des ausgewählten neuralen Bevölkerung oder Zelle Abstammung

Hinweis: In Verbindung mit diesem Protokoll, sind Beispiele für seine Anwendung auf unterschiedliche Zellpopulationen gegeben, um seine Nützlichkeit zu analysieren, die Biologie von neuronalen Zellen zu überprüfen. Dazu gehören: adulte neurale Stammzellen (aNSCs) abgeleitet von der Maus SubEpendymal Zone (SEZ) (für eine detaillierte Isolierung Protokoll s.14); Postnatale kortikalen Astrozyten zu studieren, neuronale Neuprogrammierung (für eine detaillierte Isolierung Protokoll siehe15); Postnatale zerebelläre Astrozyten (für eine detaillierte Isolierung Methode s.16); und Maus Neuro-2a Neuroblastom Zelllinie (N2a).

  1. Samen der Zellen direkt beschichtet auf Poly-D-Lysin 24-Well-Platten. Verwenden Sie 1 mL Kulturmedium pro Bohrloch. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C und 8 % CO2 für aNSCs oder bei 37 ° C und 5 % CO2 für die Astrozyten/Zell-Linie für 2 h vor live Imaging. Vermeiden Sie die Verwendung von Deckgläsern, unerwünschte Bewegung zu verhindern, da die motorisierten Mikroskoptisch verdrängt wird die einzelne Zelle tracking undurchführbar macht.
    Hinweis: Zelldichten und Kulturmedien in den Experimenten beschäftigt sind: 30-40.000 Zellen/gut für aNSCs in Dulbecco modifizierten Adlers Medium (DMEM:F12 Nährstoff-Mischung Mittel); 20.000 Zellen/gut für N2a Zellen in DMEM hohe Glukose Medium, Zellen/gut 80.000 für zerebelläre Astrozyten in DMEM hohe Glukose Medium; und 55-65.000 Zellen/gut für postnatale Astrozyten in DMEM:F12 Nährstoff-Mischung Medium.
  2. Standardisieren Sie die Kultur-Protokoll durch Anpassen der Zelldichte der Kultur auf die niedrigste Zahl der Zellen möglich. Dennoch muss die Zelldichte hoch genug, um die Lebensfähigkeit der Kultur zu erhalten.
    Hinweis: Wenn die Zelldichte zu hoch ist, kann die überschüssigen Schmutz oder schlechte Dissoziation (Klumpen) Tracking einzelner Zellen zu verhindern.

2. live-Imaging von Time-Lapse Video-Mikroskopie

  1. Schalten Sie die Inkubation, Mikroskop, Kamera und Hardware-Systeme. Stellen Sie die Temperatur und der Luftdruck auf 37 ° C und 8 % CO2 für aNSCs oder auf 37 ° C und 5 % CO2 für die Astrozyten/Zell-Linie. Lassen Sie die Temperatur und CO2 -Konzentration, für 1-2 h zu stabilisieren.
    Hinweis: Spezielle Ausrüstung ist erforderlich, um Zeitraffer video Analyse, einschließlich: helle Feldphase/Kontrast/Fluoreszenz Mikroskope mit motorisierten Komponenten; Inkubation-Geräte, die Kontrolle von Temperatur, CO2 und Feuchtigkeit; und zu guter Letzt zuverlässig und ausreichend leistungsfähige Hard- und Software in der Lage, Erwerb und Umgang mit Volumen von Bildern während live imaging-Experimente (Bitte überprüfen Sie die Tabelle der Materialien).
  2. Sobald die Zellen fest an die Platte (2 h nach Beschichtung) befestigt sind, verwenden Sie einen permanent-Marker-Stift, um einen kleinen Fleck auf der Unterseite von einem deutlich zu machen, die nicht verwendet werden für die Verfolgung, d. h., ein Brunnen, der keine Zellen enthält.
    Hinweis: Dieses Zeichen wird als Referenz auf die Xyz-Koordinaten NULL verwendet werden, und es kann jederzeit während oder nach dem Experiment oder zwischen den Veränderungen des Mediums, die Null-Position wieder verwendet werden.
  3. Die Platte im Inneren des Mikroskops Inkubation Kammer und legen Sie fest die Platte auf die Bühne, um jede unerwünschte Bewegung während der Verschiebung des motorisierten Mikroskoptisch zu vermeiden.
  4. Lassen Sie die Temperatur des Zellkulturmedium, im Saal für ca. 20 min equilibrate. Dieser Schritt wird einen Verlust des Fokus während der Aufnahme durch die Dilatation der Komponenten vermeiden.
  5. Starten Sie die live-Imaging-Software und wählen Sie die Time-Lapse Modul einrichten das Experiment.
  6. Die Gesamtdauer des Experiments und der Erwerb Bildzyklen im Menü"Registerkarte" Zeitplan"" eingestellt. Aufgrund der inhärenten Phototoxizität des übertragenen oder Fluoreszenzlicht verwendet definieren Sie eine angemessene Intervall Balanceakt zwischen der zeitlichen Auflösung der Analyse und den potenziellen Zelltod.
    Hinweis: zum Beispiel wurde insgesamt 120 h ausgewählt für aNSC Kulturen, erfassen von Hellfeld Bildern alle 5 min. beachten Sie, dass der Erwerb von 120 h von einem einzigen Film in dieser Konfiguration 120-150 Gigabyte freien Speicherplatz auf dem Computergerät benötigen.
  7. Wählen Sie die Image-Positionen durch die x- und y-Koordinaten und die Brennweite (die Z-Koordinate) in der "Xyz Punkte-tab-Menü" definiert. Umfassen Sie den Referenzpunkt (null Xyz-Koordinate) als Anfangsposition um die Koordinaten jederzeit abrufen.
  8. Wählen Sie die Art des Erwerbs im "Wellenlänge Registerkarte"Auswahlmenü", Hellfeld, allein oder in Kombination mit Epifluoreszenz Erregung bei Bedarf. Wählen Sie die Belichtungszeit. Denken Sie daran, dass Überbelichtung zu übertragen, und vor allem fluoreszierendes Licht beeinträchtigen Zellviabilität (wie oben angegeben).
    1. Wählen Sie für aNSCs, zerebelläre Astrozyten und N2a Zellen Hellfeld (10-50 ms Belichtungszeit).
    2. Für ausgestrahlt kortikale Astrozyten Hellfeld (10-50 ms Belichtungszeit) in Kombination mit rot/grünen Fluoreszenz wählen, abhängig von der Reporter für das Experiment verwendet (rote Erregung Wellenlänge: 550 nm und 400 ms Belichtungszeit; grüne Erregung Wellenlänge: 460-500 nm und 100 ms Belichtungszeit).
  9. Definieren Sie den Namen des Experiments und der Ordner, in dem die Bilder gespeichert werden sollen. Speichern Sie die Liste der Positionen das Experiment jederzeit neu zu laden, und sobald alle Bedingungen festgelegt wurden, führen Sie das Experiment, indem Sie auf die Schaltfläche "jetzt ausführen".
  10. Halten Sie das Experiment und neu einstellen Sie klicken "überschreiben Z-Taste" Fokus-Bedingungen einmal pro Tag, bis das Experiment abgeschlossen ist. Wenn Änderungen des Mediums während der live Bildgebung erforderlich sind, unterbrechen Sie das Experiment und rufen Sie die Platte aus der Zeit verfallen Kammer ab.
Ändern Sie das Medium unter sterilen Bedingungen und die Platte wieder auf die Bühne (siehe Punkt 2.3). Die Fokus-Bedingungen neu zu justieren und das Experiment fortgesetzt.
Hinweis: Die Änderungen im pH-Wert des Mediums durch Zelltod oder übermäßige Vermehrung sowie Schwankungen der Raumtemperatur, beeinträchtigen die richtige Fokussierung des Mikroskops auf die Zellen. Für empfindliche Kulturen (z. B. aNSCs) empfehlen wir die Verwendung des Mediums mit 4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES) ergänzt (Endkonzentration: 1 mM).

3. Post-imaging Immunocytochemistry (PICC), Datenerfassung und Verarbeitung

  1. Nach Abschluss des Experiments pausieren Sie die Software und rufen Sie die Platte zur Fixierung und PICC, ab, wie in den folgenden Schritten beschrieben.
  2. Führen Sie Zelle Fixierung: Waschen Sie die Zellen einmal mit 1 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie 500 µL Paraformaldehyd (PFA) (4 % mit PBS-Puffer), Inkubation 10 min bei Raumtemperatur (RT).
    Achtung: Paraformaldehyd ist ein starkes Fixiermittel und sollte vorsichtig behandelt werden, um Kontakt mit Haut oder Augen zu vermeiden. Es muss nur innerhalb einer Dampfhaube manipuliert werden.
  3. Die Zellen dreimal mit 1 mL PBS waschen und 500 µL der blockierenden Lösung (PBS mit 2 % (wt/Vol) des Rinderserumalbumin (BSA) und 0,2 % (Vol/Vol) des nichtionischen Tensids) hinzufügen. 1 h bei RT inkubieren
  4. Die blockierende Lösung entfernen und Hinzufügen von 250-400 µL Primärantikörper Lösung. 2 h bei RT inkubieren Die primären Antikörper-Lösung enthält Primärantikörper in PBS mit 2 % (wt/Vol) des BSA und 0,2 % (Vol/Vol) des nichtionischen Tensids verdünnt. In den hier beschriebenen Experimenten verwendeten Antikörper: GFAP (1: 500), βIII-Tubulin (1:1 000) und α-Tubulin (1:1 000). Da dies direkt in den Brunnen durchgeführt, größere Volumina der Lösungen sind notwendig (250-400 µL) um alle Zellen zu decken.
  5. Dreimal mit 1 mL PBS waschen und Hinzufügen von 250-400 µL der Sekundärantikörper Lösung (verdünnt wie unter Punkt 3.4 beschrieben). Sekundäre Antikörper in die hier beschriebenen Experimente verwendet: Anti-Maus Fluorescein (FITC) (1:800), Anti-Kaninchen-Cy3 (1: 500). Inkubieren Sie 1 h bei RT im Dunkeln.
  6. Drei Mal in 1 mL PBS gewaschen Sie werden. Halten Sie die Zellen in 1 mL PBS für die weiteren Schritte des Protokolls.
  7. Die Platte wieder auf den Mikroskoptisch und legen Sie fest es auf die Bühne, um unerwünschte Bewegungen während der Verschiebung des motorisierten Mikroskoptisch zu vermeiden.
  8. Abrufen der Xyz Nullstellung, die Benutzung der Markus im Schritt 2.2 gemacht und wieder die Positionen mit diesem Referenzpunkt durch Drücken der Taste "Offset alle X, Y, Z". Neu einstellen der Brennweite für jede Position.
  9. Eine letzte Runde der Bilder, die notwendigen Voraussetzungen für Fluoreszenz-Emission in die "Wellenlänge-Auswahl-Tab-Menü" Konfiguration zu erwerben um die Antigene, die zuvor in der PICC gezielt zu erkennen.
    1. Kurz, neben Hellfeld, aktivieren FITC (Anregung: 495 nm) und Cy3 (Anregung: 550 nm) Erwerb Optionen in der Software. Verwenden Sie 10-50 ms für Hellfeld 400 ms Exposition zu erkennen die Fluorophore und drücken die Taste "1 Zeitschleife", eine letzte Runde der Bilder zu erwerben.
      Hinweis: Die Intensität der Fluoreszenz kann abweichen Je nach PICC. Passen Sie die Expositionszeit um die optimale Bildqualität zu erzielen.
  10. Wählen Sie Datei/Export-Option, die Software und exportieren Sie die Bilder im Tagged Image File Format (Tiff) oder Joint Photographic Experts Group-Format (Jpeg) zu einem vordefinierten Ziel-Ordner zu.
  11. Die Bilder exportiert, das von der Tracking-Software benötigte Format zu konvertieren: die Tracking-Tool17 (tTt). Um dies zu erreichen, definieren die Eingabe und Ausgabe Ordner im "tTt-Konverter-Tool" Fenster, sowie die Markierungen für die Positionen (Xy), Kanäle (c) und Zeitpunkte (t) verwendet, und drücken Sie die Taste "Bilder konvertieren".
    Hinweis: Die Bilder müssen im Einklang mit den spezifischen Einstellungen umbenannt werden und sie müssen in einzelne Ordner für jede Position in das Experiment verwendet gespeichert werden. Anweisungen für die Installation, Anforderungen, Umbenennen von Positionen/Bilder und die Verwendung von Tracking-Tool zum Download zur Verfügung stehen: https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/tTt-and-qtfy.html.

4. einzelne Zelle Tracking

  1. Führen Sie nach der Umbenennung der Daten die tTt-Software aus. Wählen Sie einen Namen und tTt Arbeit Benutzerordner.
    Hinweis: Das Tracking Tool Arbeitsordner hält die analysierten Daten und die exportierten Ergebnisse. Der Arbeitsordner muss tTtexport, enthält Unterordner namens "AVIexport", "Configs", "TreeExport" und "tTtfiles" benannt werden.
  2. Wählen Sie das Experiment geladen werden im Fenster"select Experiment Ordner" unter Angabe den Ordnerpfad, wo das Experiment gespeichert ist, und klicken Sie dann auf "Load Experiment".
  3. Führen Sie die Log-Datei-Konverter um die geladenen Bilder in ein Format umwandeln, das von der Tracking-Software gelesen werden kann (für Experimente zum ersten Mal geladen, dies wird angefordert werden automatisch von der Software).
  4. Wählen Sie eine Position für das Tracking durch Klicken auf das Symbol (nach der Konvertierung, einen Überblick über die Positionen aufgezeichnet während der Experimente in der "Position-Layout-Fenster" angezeigt wird). Jede Position wird durch ein Symbol, das darin besteht, ein Bild von der Position und die entsprechende Nummer dargestellt werden (siehe Abbildung 1).
  5. Sobald die Position ausgewählt wurde und eine Liste der verfügbaren Bilder auf der rechten Seite der "Position-Layout-Fenster" angezeigt wird, wählen sie und klicken Sie auf "Bilder laden".
  6. Laden abgeschlossen und das "Cell Editor-Fenster" angezeigt wird, wählen Sie die Wellenlängen und Bild Intervall in der "Zelle-Editor-Fenster" verfolgt werden. Wellenlänge 0 entspricht Hellfeld, 1 entspricht FITC, Cy3, 2 und 3, DAPI. In den hier beschriebenen Experimenten Intervall 1 verwendet wurde, d.h.alle Bilder geladen. Um zu klären, bedeutet Intervall 2 Laden von jedem zweiten Bild.
  7. Nachdem die Bilder geladen haben, gehen Sie zurück zu der "Layout-Fenster Position" und doppelklicken Sie auf das Symbol für die zuvor geladene Position. Der "Film-Fenster" erscheint, die die einzelne Zelle-Tracking durchgeführt werden können.
  8. Fahren Sie nach den Anweisungen des Tracking-Tool mit Tracking. Wählen Sie die 0 Kanal (entsprechend Hellfeld), und passen Sie die Helligkeit und den Kontrast ("Schaltfläche" Gamma "anpassen"). Starten Sie das Tracking durch Drücken der F2-Taste.
    Hinweis: Bei der Nachverfolgung, die nachverfolgte Zelle folgt man den Mauszeiger darauf und drücken die Taste "0". Die Zellteilung, Zellapoptose und verlorenen Handy Tasten stehen diese bestimmte Zelle Ereignisse zu überwachen.
Wie das Experiment verfolgt wird, wird jede dieser Optionen automatisch angezeigt werden, in der Linie Struktur in der "Zelle-Editor-Fenster" gezogen, wie das Experiment verfolgt wird.
  • Sobald der Klon verfolgt wird, entsprechen Sie die Hellfeld-Bilder die Immunfluoreszenz Bilder von PICC, die Art der Zelle Nachkommen festzustellen. Jeden Kanal Epifluoreszenz vertreten sein, im Fenster"Film" (Kanal 1, 2, etc.).
  • (5) Endergebnis

    1. Sobald einzelne Zelle tracking abgeschlossen wurde und die Nachkommen identifiziert, speichern das Experiment (Registerkarte Cell Editor Fenster/Datei / speichern aktueller Baum als) und fahren Sie mit die Ergebnissen zu exportieren.
    2. Exportieren Sie die Linie Bäume und Zellendaten in den "Export-Menü" befindet sich im Fenster"Cell Editor". Ebenso exportieren die Zelle Bilder und Filme über die "Export-Menü" Fenster"Film" über. Bilder, Linie Bäume, Daten und Filme werden in den tTt-Arbeit-Ordner exportiert werden.

    Representative Results

    Die beschriebene Methode ermöglicht kritische Fragen hinsichtlich der Zellbiologie mehrere neuronalen Populationen gelöst werden. Zum Beispiel wurde es möglich, das Fortschreiten der neurogenen und Oligodendrogliogenic Linie des aNSCs7,8,14,18zu überwachen. Durch die Verfolgung einzelner aNSCs und deren Nachkommen (Abb. 2A, B), war es möglich, nachzuweisen, dass aNSCs isoliert in-vitro- pflegen neurogenen naturgemäß meist generieren Neuroblasten, und dass sie eine Sequenz folgen vorgeschlagen in Vivo19 aber bisher nicht auf der Ebene der einzelnen Zelle gezeigt. Darüber hinaus erlaubt diese Kultursystem asymmetrische Zellteilungen zum ersten Mal in der aNSC-Linie von der SEZ (Abb. 2 b) visualisiert werden, bietet ein einzigartiges Modell zur Untersuchung der NSC Selbsterneuerung8,14. Ebenso, und unabhängig von der Linie analysiert, war es möglich, wertvolle Daten über die Zellwachstum, die Runde der Division, Zellviabilität oder Zellzyklus Länge zu erhalten.

    Figure 2
    Abbildung 2. Beispiel für aNSCs von der SEZ isoliert und von live Imaging und einzelne Zelle tracking analysiert. Phase Kontrast Bilder zeigen den Verlauf des Klons zu verschiedenen Zeitpunkten (Tag-h: min). Das endgültige Bild entspricht der Post-Bildgebung Immunocytochemistry (PICC) für Glial fibrillary sauren Protein (GFAP, rot), βIII-Tubulin (grün) und 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, blau). (A) Analyse der symmetrischen neurogenen Bäume durch verschiedene Runden der Verstärkung Divisionen, Post-mitotische Neuroblasten zu generieren. Rote Pfeile zeigen auf die Zellen in der symmetrischen Bäume enthalten. Auf der rechten Seite werden die Bäume Linie entspricht der Klone und erzeugt durch die tTt-Software angezeigt. (B) Beispiel für einen Stammvater erzeugen einen asymmetrische neurogenen Baum mit einem Zweig unterziehen verstärkende Divisionen um Neuroblasten während der andere wirft Ruhestrom GFAP positive Zellen durch eine mögliche Selbsterneuerung Veranstaltung zu produzieren. Auf der rechten Seite erscheint die Linie Baum durch die tTt-Software erzeugt. In die Linie Bäume: "N" zeigt nach dem mitotische Neuroblasten; "G", Ruhestrom GFAP-positiven Zellen; "X", Zelltod; und "?" eine verlorene Zelle. Maßstabsleiste stellt 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Live Imaging und Einzelzelle tracking-Analyse auch bietet eine genaue Anzeige der wandernden Kapazitäten einer neuronalen Population. Diese Informationen wurden postnatale zerebelläre Astrozyten unterbreitet ein Rubbellos Wunde Assay20, Generierung von Informationen über die durchschnittliche Entfernung von den Astrozyten gereist, beim Schließen der Wunde (Abbildung 3) entnommen. Darüber hinaus war es möglich zu sehen, dass einige von den Astrozyten während des Heilungsprozesses geteilt, während andere während des Experiments unverändert bleiben. Auffällig ist, scheinen diejenigen, die unterteilt fruchtbarer wandernden Verhalten als Pendants nicht geteilt (Reisen doppelt so viel im Durchschnitt). Dieses Phänomen zeigt eine sehr interessante Heterogenität in den Astrozyten Kapazität eine Narbe auf Verletzungen, zu bilden, die sich in das Auslesen von einem klassischen Endpunkt Analyse Experiment verdünnt worden wäre.

    Figure 3
    Abbildung 3. Analyse der das Wanderungsverhalten der postnatalen zerebelläre Astrozyten in einen Kratzer Wunde Assay. Phase Kontrast Bilder zeigen die Wunde zu verschiedenen Zeitpunkten (Tag-h: min). Linie Bäume, tTt Software erzeugte illustrieren das repräsentative Verhalten in Bezug auf die Zellteilung der Astrozyten beim Schließen der Wunde. Histogramm zeigt die durchschnittliche zurückgelegte Strecke durch die Astrozyten analysiert, indem einzelne Zelle tracking (Mittelwert ± SEM). Maßstabsleiste stellt 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Ein weiteres interessantes Merkmal von Time-Lapse Video-Mikroskopie-Experimenten ist die Fähigkeit zur Proliferation und Differenzierung in einer Zellpopulation zu vergleichen. Wir testeten N2a Zellen unter Bedingungen, die Förderung der Verbreitung (in Anwesenheit von 10 % fetalen bovine Serum (FBS)) oder Differenzierung (in Anwesenheit von 0,5 % FBS + 10 µM Arachidonsäure) überzogen. Es war möglich, das Fortschreiten der Abstammung dieser Zellen proliferative Bedingungen (Abbildung 4A), zu folgen, während differenzierende Zellen nicht vermehren und sie Neuriten (Abbildung 4 b bilden). Bemerkenswert ist, erlaubt einzelne Zelle tracking Kolonien mit verschiedenen Verbreitung Kapazitäten zu unterscheiden und Neurit Dehnung (und Retraktion) ausgewertet werden, präzise und quantitative Daten, die später exportiert werden können.

    Figure 4
    Abbildung 4. Die Überwachung der N2a Zellbiologie in Proliferation (A) oder Differenzierung Bedingungen (B). Phasenbilder Kontrast Darstellung das Fortschreiten des Klons zu verschiedenen Zeitpunkten (Tag-h: min). Das endgültige Bild entspricht der Post-Bildgebung Immunocytochemistry (PICC) für α-Tubulin (grün). (A) einzelne Zelle tracking ermöglicht die Runde der Division überwacht werden, sowie die Heterogenität in der proliferative Reaktion der verschiedenen Zellen. Auf der rechten Seite zeigt die Linie Baum durch die tTt-Software erzeugt das proliferative Verhalten von N2a Zellen. (B) Zellen unter Differenzierung Bedingungen verlassen den Zellzyklus und generieren Neuriten, ein Prozess, der Post-Bildgebung Analyse effektiv gemessen werden kann. Einzelne Zelle Tracking, vertreten durch die Linie Baum auf der rechten Seite, zeigt, wie N2a Zellen verlassen Zellzyklus und Zellteilung unter Differenzierung Bedingungen zu stoppen. Maßstabsleiste stellt 50 µm.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.

    Schließlich Leben Bildgebung und einzelne Zelle tracking ist äußerst nützlich, morphologische und molekulare Veränderungen zu überwachen, wenn Zellen zur Reprogrammierung eingereicht werden. Live Bildgebung der postnatalen Astrozyten ausgestrahlt mit Achaete Scute Homolog 1 (Ascl1) liefert wertvolle Daten über die morphologischen Veränderungen, die auftreten während der Re-Programmierung oder die Blockierung der Zellteilung bei Astrozyten umprogrammiert (siehe Abbildung 5). Wenn Ascl1 Transduktion mit die Signalweiterleitung ein Konstrukt Codierung für grüne Fluoreszenz Protein (GFP) unter der Kontrolle des Veranstalters doppelte Cortin (DCX) kombiniert wird, ist es übrigens möglich, den genaue Zeitpunkt wenn neuronale definieren spezifische Marker beginnen Sie, in die umprogrammierten Zellen (Abbildung 5) ausgedrückt werden. Time-Lapse Video-Mikroskopie ermöglicht auch die Anzahl der Zellen, die erfolgreich Umprogrammierung abgeschlossen zu quantifizieren und im Vergleich zu den Zellen, die während dieses Vorgangs sterben. Überwachung von solchen Ereignissen führten zur Identifizierung kritischer "Checkpoints" in die Zellen, die erfolgreich reprogrammierten9waren.

    Figure 5
    Abbildung 5. Analyse der postnatalen kortikalen Astrozyten neuronalen Umprogrammierung unterzogen. Umprogrammierung wurde durch Transduktion mit Pro-neurogenen Ascl1-rote Fluoreszenz Protein (RFP) Vektoren induziert. Neuronalen Umbau wurde mit einem Vektor Codierung GFP unter der Kontrolle eines DCX-Promotors durch Co Transduktion überwacht. Phase kontrastreiche Bilder zeigen den Verlauf der Umprogrammierung zu verschiedenen Zeitpunkten (Tag-h: min). Fluoreszenzbilder RFP und GFP Meinungsäußerung bzw.. Live Imaging und Einzelzelle tracking erlaubt wichtige Ereignisse wie morphologische Veränderungen, das Fehlen der Zellteilung während Neuprogrammierung, Zelltod, einzuhalten und die genaue Uhrzeit reprogrammierte Zellen wann neuronalen Marker zum Ausdruck bringen kann definiert werden . Maßstabsleiste repräsentiert 80 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

    Discussion

    Einer der wichtigsten Werte der live Bildgebung ist die Möglichkeit, genaue Abstammung Ablaufverfolgung, verdeutlichend kritische Aspekte der Linie Fortschreiten in einer neuronalen Population durchzuführen. Linie die Ablaufverfolgung ist definiert als die Identifizierung und Überwachung der Nachkommen von einem einzigen Stammvater, des Gründers des Klons auf die anschließende Klon gebildet21. Bemerkenswert ist, haben alternative Methoden für Linie verfolgen (z.B., virale Transduktion oder multicolor Reporter Konstrukte21) einen kritischeren Nachteil, wobei das Endergebnis basiert auf unbewegten Bildern und es muss nicht zwangsläufig die gesamte Sequenz dar. Dies bedeutet, dass Zelltod, Heterogenität im Verhalten der Zellpopulation, Verdünnung, Verbreitung oder schlechte Effizienz der Marker, zusammen mit anderen wichtigen Nachteilen, unvollständig oder nicht korrekt auslesen der Ergebnisse2führen. Darüber hinaus ermöglicht live Bildgebung den Forscher zu analysieren, wichtige Merkmale der Biologie der neuronalen Populationen, z. B. den Modus und den Zeitpunkt der Zellteilung, Zellwachstum, Migration, Verbreitung versus Differenzierung, Zellzyklus Länge, Neurit Bildung, Komplexität und Länge, Zelle Schicksal Auswahl (Differenzierung) oder Umwandlung (Umprogrammierung).

    Darüber hinaus live Imaging kann leicht mit anderen Analyse sollen Daten aus einzelnen Zellen wie z. B. ergänzt werden RNA-Sequenzierung. Um die Vorteile von live Imaging und andere Techniken zu erreichen erfordert jedoch, dass jene Zellen, die bisher in den Filmen überwacht sind später wieder erkannt und individuell für die Sekundäranalyse gesammelt. Dies kann erreicht werden durch den Einsatz von Mikroskopen, die positionale-Koordinaten enthalten, durch die Anwendung von fluoreszierenden Reporter für bestimmte Zellen oder Analyse der Verteilung der Gruppen von Zellen als Referenzen. In der Tat können die Kombination aus das Transkriptom-Profil und Verhalten der einzelnen Zellen eine leistungsstarke Route, neue molekulare Signale an die Biologie der Zellen beteiligt aufzuklären darstellen.

    Eines der wichtigsten Probleme, die eine live-Image Experiment gefährden können ist eine unzureichende Zelldichte Kultur. Wie bereits erwähnt, am high-Density beeinträchtigen der Überschuss an Schutt oder schlechte Dissoziation (Büschel-Formation) die Qualität und die räumliche Auflösung der Bilder, einzelne Zelle tracking undurchführbar machen. Daher sollte die niedrigste Zahl der Zellen möglich die Bedingungen für die unterschiedlichen Zellpopulationen unter Studie angepasst werden, ohne die Lebensfähigkeit der Zellkultur.

    Die Häufigkeit der Bildaufnahme ist auch entscheidend und sollte sorgfältig eingestellt werden, besonders wenn Fluoreszenz Beleuchtung verwendet wird. Überbelichtung zu übertragen und vor allem Fluoreszenzlicht Zellviabilität beeinträchtigen. Alternativ kann eine übermäßige Verzögerung zwischen der Aufnahme der Bilder die zeitliche Auflösung der Analyse beeinträchtigen.

    Ein weiterer wichtiger Schritt während der live-imaging Experiment ist die regelmäßige Anpassung der Fokussierung. Fehler in der korrekten Einstellung/re-einstellen von der Brennweite kann einzelne Zelle Tracking behindern. Darüber hinaus ist es notwendig, sorgfältig zu prüfen, dass die Inkubationszeit Kammer bewahrt die angemessene Temperatur, Feuchtigkeit und CO2 -Konzentration, Änderung der unerwünschte Veränderungen, die Zelltod induzieren können.

    Schließlich, nachdem die PICC durchgeführt worden ist, ist es wichtig, richtig Xyz Null-Position vor der letzten Runde der Bildaufnahme abrufen. Nicht korrekt re-Einstellung des Xyz Nullstellung wird entsprechend der Phasenkontrast- und Immunfluoreszenz Bilder, behindern die Identifizierung der Zelle Nachkommen erschweren.

    Obwohl dieser Ansatz viele positive Facetten hat, bestehen einige Einschränkungen für die live Bildgebung der neuronalen Populationen noch. Zum Beispiel macht die geringe Zelldichte erforderlich, um erfolgreiche Einzelzelle Verfolgung von aNSCs durchführen es unmöglich, biochemische Tests wie Western Blot-14zu beschäftigen. Darüber hinaus Überwachung Populationen schnell teilen wie zerebelläre Astrozyten oder N2a Zellen ist zeitlich beschränkt, wie es oft zu schwer für die Verfolgung von Zellen als die Kulturen in der Nähe von Confluence. Darüber hinaus beeinträchtigen viele Kulturmethoden sowie die inhärenten biologische Einschränkungen mit der Isolierung von Zellen, oft Zellviabilität über lange Zeiträume, Begrenzung der Dauer der live-imaging-Experimente. Schließlich hat die Zellen aus ihrer natürlichen Umgebung zu isolieren, sowohl positive als auch negative Auswirkungen. Zellen, die isoliert von ihren physiologischen Nische können fehlschlagen, wichtige Signale zu empfangen, die ihr Verhalten modulieren während gleichzeitig stellt es ein mächtiges Mittel, um die Wirkung der diese Signale einzeln in die Linie Fortschreiten der spezifischen neuronalen testen Populationen.

    Angesichts der oben beschriebenen Einschränkungen, ist es klar, dass das perfekte methodische Szenario wäre live imaging und einzelne Zelle Tracking unter normalen physiologischen Bedingungen in VivoExperimente. Aktuelle Techniken sind jedoch nicht in der Lage, einzelne Zellen für längere Zeit in tiefen Regionen des Gehirns2folgen. Daher sollten die Zukunft von live Imaging konzentrieren überwinden diese Einschränkung, mit dem Ziel, die Zellbiologie der einzelnen Zellen in Vivo mit den meisten kleineren Störungen der physiologischen Umwelt3vollständig zu analysieren.

    Disclosures

    Die Autoren haben nichts preisgeben.

    Acknowledgments

    Wir danken für ihre Unterstützung und Werk in Abbildung 1Beatriz Gascon. Wir danken Dr. C. Norris für seine Hilfe. Die hier vorgestellte Arbeit wurde unterstützt von Forschungsstipendien, "Red de Shmeissani Consolider Ingenio Spanisch Ionenkanal-Initiative" (BFU2015-70067REDC), MEC (BFU2014-53654-P), BRADE-CM (S2013/ICE-2958), UCM-Santander (PR26/16-18 b-3) und Fundación Ramon Areces Grant Program (PR2018/16-02). Felipe Ortega erkennt Ramon y Cajal Programm des spanischen Ministeriums für Wirtschaft und die Wettbewerbsfähigkeit (MEC: RYC-2013-13290).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Poly-D-lysine Sigma P0899 Working solution 0.02 mg mL-1
    24 wells plate Falcon 352047
    Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM): F12 Nutrient Mixture medium (-L Glutamine) Invitrogen 21331-020
    DMEM High Glucose medium Sigma D6546
    Bovine Serum Albumin Sigma A6003
    Triton X-100 Merck 11869 non-ionic surfactant
    Mouse anti-β III Tubulin Sigma T8660
    Rabbit anti-GFAP DakoCytomation Z0334
    Mouse anti-α Tubulin Sigma T5168
    Anti-Mouse FITC Jackson Laboratories 715-095-150
    Anti-Rabbit Cy3 Jackson Laboratories 711-165-152
    Brightfield/Phase contrast/fluoresence microscope Nikon TE-2000-E
    CFI PLAN FLUOR DLLL 10X objetives Nikon Ref 280MRH10101
    CFI SUPER PLAN FLUOR ELWD AMD 20X objetives Nikon Ref 280MRH48230
    pE-300 LED fluorescence Cool LED Ref Number 1981
    310M-201 Incubation system (temperature) OKO-Lab Serial Nº VOF007307
    Pro-ScanII  Motorized stage system Prior Serial Nº 60018
    High precision microscope camera version 4.2 ANDOR Zyla VSC-03650
    Specifc software for live imaging with timelapse module: NIS-Elements AR4.5 Nikon NIS-Elements AR4.5 -Hasp ID: 13CE819E
    OKO touch Incubation system (CO2) OKO-lab Serial number 1716
    Murine Neuro-2a Neuroblastoma Cell line ATCC ATCCCCL131
    HEPES buffer solution 1 M Invitrogen 15630-056

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    References

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