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Basado en el dendrímero nanopatrones desigual para adherencia de superficie de Control local: un método para dirigir la diferenciación condrogénica

Bioengineering

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Summary

Un método para obtener nanopatrones desigual basado en el dendrímero que permiten el control de escala nanométrica de local arginina-glicina-aspártico (RGD) superficie densidad del ácido es descrito y aplicado para el estudio de la diferenciación celular de adherencia y condrogénica.

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Casanellas, I., Lagunas, A., Tsintzou, I., Vida, Y., Collado, D., Pérez-Inestrosa, E., Rodríguez-Pereira, C., Magalhaes, J., Gorostiza, P., Andrades, J. A., Becerra, J., Samitier, J. Dendrimer-based Uneven Nanopatterns to Locally Control Surface Adhesiveness: A Method to Direct Chondrogenic Differentiation. J. Vis. Exp. (131), e56347, doi:10.3791/56347 (2018).

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Abstract

Diferenciación y adhesión celular está condicionada por la disposición de escala nanométrica de los componentes de la matriz extracelular (MEC), con concentraciones locales tener un efecto importante. Aquí presentamos un método para obtener a gran escala nanopatrones desigual de ácido arginina-glicina-aspártico (RGD)-densidad superficial de dendrímeros funcionalizados que permiten el control de escala nanométrica de servicios locales. Nanopatrones se forman por adsorción superficial de dendrímeros de soluciones a diferentes concentraciones iniciales y se caracterizaron por ángulo de contacto de agua (CA), espectroscopía de fotoelectrones de rayos x (XPS), y análisis de sonda tales como técnicas de microscopía Microscopía de efecto túnel (STM) y microscopía de fuerza atómica (AFM). La densidad superficial local de RGD se mide utilizando imágenes AFM mediante mapas de contorno de probabilidad de las distancias entre partículas mínimas y luego correlacionados con la diferenciación y la respuesta de la adherencia de la célula. El método nanomotivos presentado aquí es un procedimiento simple que puede ampliarse de forma sencilla a grandes superficies. Por lo tanto es totalmente compatible con protocolos de cultivo celular y se puede aplicar a otros ligandos que ejercen efectos dependiente de la concentración en las células.

Introduction

Aquí describimos un procedimiento sencillo y versátil basada en el dendrímero nanomotivos para obtener superficies de cultivo celular que permiten el control de adherencia local a escala nanométrica. Se han divulgado detalles de nanoescala de la organización de ECM,1,2,3 y nanomotivos de las superficies de adherencia de célula ha proporcionado penetraciones profundas en los requisitos celulares relacionados con la adherencia4, 5. Experimentos con micelar nanopatrones basado en litografía revelaron un valor umbral de alrededor de 70 nm de nanospacing de péptido RGD, adhesión celular se retrasará por encima de este valor6,7,8 ,9. Estos estudios también destacan la mayor influencia de locales de densidad global ligando el cell adhesión9,10,11.

Durante la morfogénesis, interacciones de la célula con el entorno activan los primeros eventos de la diferenciación, que continúan hasta que se han formado estructuras de tejido complejo final. Dentro de este marco, se han utilizado superficies nanopatterned para hacer frente a la influencia de las interacciones de superficie de la célula iniciales en la morfogénesis. Basado en litografía nanopatrones RGD con una separación lateral de 68 nm en β-tipo Ti-40Nb aleaciones ayudan a mantener el fenotipo indiferenciado de las células madre no comprometida12, mientras que nanospacings RGD de entre 95 y 150 nm mejorar la diferenciación de células madre mesenquimales (MSCs) hacia adipogenic/osteogénico13,14,15 y condrogénica sinos16. También, uno mismo-montaje macromoléculas modificados con componentes de señalización han demostrado directa de adhesión celular y la diferenciación proporcionando regulación arquitectónica a nanoescala de señalización señales17. En este sentido, la deposición de dendrímeros con partes de células interactuando en su esfera externa18,19,20 sobre superficies se ha utilizado para estudiar células adherencia21,22, morfología23,24y de25,de eventos de migración26. Sin embargo, la falta de caracterización superficial en estos estudios hace difícil establecer ninguna correlación entre la configuración superficial del dendrímero y respuesta de la célula.

Dendrímero nanopatrones con líquido-como orden y espaciamiento definido pueden obtenerse cuando dendrímeros por adsorción a las superficies de carga baja de soluciones con baja fuerza iónica. 27 sobre la base de esta propiedad, aquí presentamos un método para obtener a gran escala nanopatrones desigual de dendrímeros funcionalizados de RGD en superficies de baja carga que permiten el control de escala nanométrica de densidad superficial local de RGD. Ángulo de contacto de agua (CA), espectroscopía de fotoelectrones de rayos x (XPS) y exploración sonda microscopia técnicas (nanopatrones STM y AFM) mostrar que las densidades locales ligando pueden ajustarse modificando el dendrímero inicial concentración en solución. La densidad superficial local de RGD es cuantificada de imágenes AFM de mapas de contorno de probabilidad de las distancias entre partículas mínimas y luego correlacionada con experimentos de la célula. En comparación con otras técnicas de nanomotivos4, nanomotivos basado en el dendrímero es sencilla y pueden fácilmente ampliarse a grandes superficies, siendo totalmente compatible con aplicaciones de la cultura de célula. Nanopatrones se utilizan como substratos bioactivos para evaluar el efecto de la densidad superficial local de RGD en células adherencia28 y en la inducción condrogénica de adultos de MSCs humanos29. Nuestros resultados muestran que RGD basados en el dendrímero nanopatrones mantienen el crecimiento de la célula y que adhesión celular se ve reforzada por la alta densidad superficial local de RGD. En los experimentos de diferenciación, intermedio adherencia de células a los sustratos favoreció la condensación de MSC y temprana diferenciación condrogénica. Debido a la facilidad con que dendrímero grupos periféricos pueden ser modificados, el método descrito aquí puede ser ampliado a otros ligandos de ECM que ejercen efectos dependiente de la concentración en las células.

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Protocol

1. preparación del sustrato

  1. Recocido Au(111) 1.4 x 1.1 cm en sustratos de Mica.
    1. Coloque el sustrato Au(111) en una vitrocerámica y templar con una llama de butano para 3 minutos deje que el sustrato se enfríe bajo atmósfera de argón. Repita este paso para cada sustrato de Au(111).
      Nota: Au(111) sustratos deben utilizarse inmediatamente después del recocido.
  2. Preparación de poli (ácido L-láctico) (PLLA)-cubierto de substratos de vidrio.
    1. Cortar y lavar el portaobjetos de vidrio.
      1. Corte el portaobjetos de microscopía en 18 diapositivas de 1,25 x 1,25 cm con un cortador de punta de diamante. Hacer una pequeña hendidura en la parte inferior de cada diapositiva, de modo que los lados superiores e inferiores pueden distinguirse más tarde.
      2. Lavar bien los portaobjetos con agua desionizada seguida de etanol al 96%. Permita que seque al aire.
    2. Preparar la solución al 2% PLLA.
      1. Agregar 200 mg de PLLA a 10 mL de 1, 4-dioxano en un tubo de presión. Agregar una barra de agitación y cierre el tubo herméticamente.
      2. Coloque el tubo de presión en baño de glicerina sobre una placa caliente a 60 ° C con agitación suave durante 24 h y luego transferir la solución a un frasco de vidrio de 15 mL.
    3. Capa el portaobjetos con la solución PLLA.
      1. Coloque el portaobjetos y el frasco con la solución PLLA en un plato limpio caliente a 60 ° C. Asegúrese de colocar las diapositivas hacia arriba y que puedan permanecer durante al menos 10 minutos llegar a la temperatura necesaria.
      2. Preparar la máquina de pintar del giro y establecer el programa especificado en la tabla 1.
      3. Coloque uno de lo toboganes boca arriba en el recubridor spin, utilizando un sistema de vacío. Con una pipeta Pasteur, se aplican 0.25 mL de la solución PLLA a la diapositiva, asegurándose de que toda la superficie está cubierta. Ejecute el programa de la capa. Repita este paso para cada diapositiva.

2. dendrímero nanomotivos

  1. Preparación de soluciones de 28 dendrímero RGD-funcionalizados (RGD-Cys-D1).
    1. Disolver 5 mg del dendrímero en 6,494 mL de agua desionizada. Esta es la solución A.
      Nota: Use solución dendrímero dentro de 6 meses de preparación.
    2. Someter a ultrasonidos solución A durante 10 minutos y preparar soluciones B y C siguiendo la tabla 2.
    3. Someter a ultrasonidos solución C por 10 min y preparar soluciones D, E y F siguiendo la tabla 2.
    4. Almacene las soluciones B, C, D, E y F a 4 ° C hasta su uso. Solución A puede almacenarse a-20 ° C para su uso posterior.
  2. Nanomotivos de dendrímeros RGD-Cys-D1 en los sustratos
    1. En una campana de cultivo de tejidos, esterilizar los sustratos por irradiación con luz UV para 13 minutos.
      Nota: Este paso sólo es necesario cuando sustratos de nanopatterned van a ser utilizados como sustratos de cultivo celular. En este caso, mantener las condiciones estériles (campana de cultivo de tejidos, materiales estériles, soluciones y técnicas) para los siguientes pasos.
    2. Coloque cada sustrato cara arriba en los pocillos de una placa, manipularlos cuidadosamente con las pinzas.
    3. Someter a ultrasonidos soluciones B, C, D, E y F por 10 min.
    4. Pasar las soluciones del dendrímero de RGD-Cys-D1 a través de un filtro de 0,22 μm de diámetro utilizando una jeringa directamente en los pocillos que contienen el sustrato (2 mL/pocillo). Se recomiendan al menos tres réplicas por concentración del dendrímero. Cerrar y sellar la placa y dejarla a temperatura ambiente (RT) de 16 h.
    5. Retire y deseche las soluciones. Lavar el sustrato con agua desionizada estéril y seco. Almacenar sustratos a 4 ° C.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí.

3. preparación de substratos de Control

Nota: Todas las medidas se realizaron en una campana de cultivo estériles para tejidos y sólo material estéril, soluciones y técnicas fueron utilizadas. Al menos, seis de control de sustratos fueron usadas (tres réplicas del control positivo) y tres réplicas del control negativo.

  1. En una campana de cultivo de tejidos, esterilizar los sustratos por irradiación con luz UV para 13 minutos.
  2. Sustratos de control para el experimento de adhesión de fibroblastos.
    1. Utilizar sustratos de Au(111) llama recocido como control negativo. Oro tiene un efecto bien conocido de desnaturalización de la proteína que confiere propiedades adhesivas de la célula contra28. Someter a ultrasonidos todas las soluciones y filtrar antes de la incubación del sustrato.
    2. Para los controles positivos, sumerja llama recocido Au(111) sustratos en una solución de PEG modificado con RGD tiol, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene glicol mono-11-mercaptoundecanamide (RGD-PEG-SH)30 y glicol del trietileno mono-11-mercaptoundecyl éter (PEG-SH) en una proporción molar de 1: 100 en etanol al 96% durante 16 horas a TA.
    3. Lave bien los sustratos en etanol y secar con argón. Almacenar sustratos a 4 ° C.
  3. Control de sustratos para la condrogénesis.
    1. Utilizar sustratos PLLA prístinos como control negativo. Sin ningún tratamiento superficial, PLLA muestra pobre interconexión con células vivas. 31
    2. Para los controles positivos, preparar 5 mL de fibronectina de 0,1 mg/mL en tampón fosfato salino (PBS) e incubar cada sustrato PLLA con 1.6 mL de la solución de fibronectina por 1 h a TA.
    3. Retire y deseche la solución de fibronectina y lavar el sustrato con PBS. Almacenar sustratos a 4 ° C.

4. Caracterización superficial

  1. Proyección de imagen de AFM
    1. Realizar proyección de imagen de AFM de sustratos PLLA para un análisis de la rugosidad. Puesto que los dendrímeros tienen un diámetro de 4-5 nm, los valores de rugosidad de 1 nm debe obtenerse para la correcta visualización de la nanopatrones. También, realizar proyección de imagen de AFM de la nanopatrones. En ambos casos, realizar AFM en modo aire.
    2. Seleccione un voladizo de silicio con un resorte de constante k = 40 N/m y una frecuencia resonante ν = 300 kHz y móntelo en el equipo de AFM.
    3. Montar la muestra en la etapa del microscopio de fuerza atómica. Dependiendo de la configuración del aparato, afinación y proyección de imagen especificaciones pueden variar. Consulte el manual del fabricante.
    4. Enfoque la muestra con la punta del microscopio hasta el contacto.
    5. Para imagen de PLLA para análisis de rugosidad, seleccione al menos cuatro áreas representativas de 20 x 20 μm por sustrato en tres sustratos independientes. Dendrímero nanopatrones la imagen, elegir al menos tres imágenes representativas de 5 × 5 μm por sustrato de tres sustratos independientes por condición (dendrímero inicial concentración en solución). Para evitar dañar la capa del dendrímero mientras la proyección de imagen, ajustar el punto fijo para mantener la fuerza en un mínimo.
      Nota: La elección de la zona de proyección de imagen también depende del rango de trabajo del escáner piezoeléctrico. Consulte el manual del instrumento en este sentido.
    6. Proceso la altura AFM imágenes ajustando cada scan línea al polinomio funciones utilizando el software propietario del fabricante de los aparatos AFM de nivelación y analizarlos de PLLA para calcular la rugosidad de la superficie. Significa raíz cuadrada (RMS) análisis pueden proveer una opción adecuada.
  2. Medida de la densidad superficial de RGD local.
    1. Obtener el umbral de la imagen de las imágenes procesadas de la altura AFM para seleccionar los dendrímeros en la superficie.
    2. Determinar las posiciones de la partícula usando un software de procesamiento de imágenes y utilizarlas para obtener las distancias entre partículas mínimas (8Dmin).
    3. Representar valores demin den z para las posiciones de partículas correspondientes para obtener los mapas de contorno de probabilidad para 8Dmin. Ajustar la escala de color de la trama para visualizar las regiones de densidad más alta local RGD superficial (dmin < 70 nm).
    4. Cuantificar el área de las regiones con la densidad más alta local RGD superficial utilizando un software de procesamiento de imágenes. Incluyen las áreas del dendrímero agregados en el cálculo.
  3. Proyección de imagen de STM.
    Nota: Proyección de imagen de STM se puede realizar sólo para nanopatrones sobre sustratos de Au(111) conductoras. Las mediciones se realizan en el aire.
    1. Coloque el sustrato de nanopatterned muestra el equipo de STM. Compruebe la conexión eléctrica entre la muestra y titular con un tester.
    2. Grabado a punta del material de la sonda seleccionada (es decir. PT 0.8: Ir 0.2) con un diámetro que garantice el adecuado ajuste en la cabeza del equipo de STM. Grabado se puede realizar mediante corte manual o grabado electroquímico. 32
      Nota: Grabado electroquímico hace más puntas simétricas.
    3. Montar la punta en la cabeza del equipo de STM y conectar la muestra.
    4. Sistema "actual" en el canal de retroalimentación (en este tipo de medición, actual será constante por feedback tuning). Ajuste el voltaje de bias y punto fijo actual y tamaño de exploración para obtener una imagen bien resuelta una vez que la punta se dedica.
      Nota: La elección de la zona de proyección de imagen también depende del rango de trabajo del escáner piezoeléctrico. Consulte el manual del instrumento en este sentido.
    5. Proceso de las imágenes topográficas de STM ajustando cada línea de exploración para nivelación polinomio funciones utilizando el software propietario del fabricante del aparato del STM.
  4. Mediciones de CA.
    1. Medida de CA en los sustratos de nanopatterned por el método de la gota sésil en tres posiciones diferentes en tres sustratos independientes por condición (dendrímero inicial concentración en solución) con un sistema óptico de CA.
    2. Llene la microjeringa con agua desionizada y ajustar los parámetros en el software de CA para producir gotas de 1 μl.
    3. Coloque la muestra en el escenario para que la superficie de la muestra es claramente visible en el equipo para la proyección de imagen.
    4. Mueva la jeringa con el micromanipulador hasta llegar cerca de la superficie y colocar la gota sobre la superficie. Grabar la imagen inmediatamente después de la estabilización de la gota.
      Nota: En las mediciones de CA, es muy importante controlar la humedad para lograr resultados reproducibles.
    5. Analizar el CAs con el software propietario del fabricante de los aparatos de CA. El método de ajuste se puede ajustar a las necesidades del usuario. El método de ajuste elíptica puede ser una opción.

5. cultivo celular

Nota: Todas las medidas se realizaron en una campana de cultivo de tejidos y sólo material estéril, soluciones y técnicas fueron utilizadas.

  1. Experimento de la adhesión de fibroblastos.
    1. Cultura NIH 3T3 ratón embrionario los fibroblastos de pasajes tempranas (< 10) a 37 ° C y 4.6% CO2 ambiente en medio basal con alta glucosa suplementada con 10% suero bovino fetal (FBS), 1% glutamina, 1% penicilina-estreptomicina y 1% piruvato de sodio (medio de cultivo). T75 frascos de una siembra total de 500.000 células por frasco en 10 mL de medio de cultivo se recomiendan.
    2. Quitar medio viejo con una pipeta de 10 mL cada 2 días y reemplazar con 10 mL de medio de cultivo recién preparada.
    3. Células en cultivo en el medio de crecimiento hasta llegar a alrededor de 80% de confluencia, a continuación, quite el medio y añadir 5 mL de tripsina por frasco. Para asegurar el desprendimiento celular adecuado desde la parte inferior del frasco, mantener la solución de tripsina en contacto con las células durante 5 min a 37 ° C.
    4. Añadir 5 mL de medio de cultivo cada frasco y recoger las células en un tubo de centrífuga. Centrifugar las células a 470 x g por 5 min retirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio de cultivo. Determinar la concentración de células usando un hemocitómetro.
    5. La transferencia de los sustratos bien placas no tratadas para cultivo de tejidos (no adherente).
    6. Las células en los sustratos con una densidad de 4.000 células/cm2 en medio del crecimiento de la semilla e incúbelos durante 4,5 h a 37 ° C y 10% CO2 ambiente.
  2. Inducción condrogénica de MSCs.
    1. Cultura humanas MSCs de primeros pasos (< 5) a 37 ° C y 4.6% CO2 ambiente en un medio de MSC. T75 frascos de una siembra total de 500.000 células por frasco en 10 mL de medio de cultivo se recomiendan.
    2. Cambiar el medio cada 3 días (como se describe en 5.1.2).
    3. Trypsinize las células antes de confluencia del 80% se alcanza y centrifugar y les resuspender en medio de cultivo de MSC (como descrito en 5.1.3). Determinar la concentración de células usando un hemocitómetro.
    4. Centrifugar las células otra vez y resuspender en 10 mL de medio de inducción de condrogénesis.
    5. Transferencia de los sustratos de las placas para nuevas placas bien no tratadas para cultivo de tejidos (no adherente). Las células en los sustratos con una densidad de 3.000 células/cm2de la semilla.
    6. Cambiar el medio condrogénica cada 3 días (como se describe en 5.1.2).

6. la fijación y el Immunostaining de la célula

Nota: Los pasos siguientes pueden realizarse en condiciones no estériles.

  1. Quitar los medios de comunicación y lavar las células con PBS. Fijar mediante la adición de una solución de formol al 10% durante 20 min a TA.
  2. Eliminar el formol y lavan las células con PBS.
  3. Bloquean los grupos aldehídos libres mediante la adición de una solución de 50 mM de cloruro de amonio (NH4Cl) en PBS. Salir de las células durante 20 min en solución de NH4Cl Retire RT. y lavan las células con PBS.
    Nota: El protocolo se puede detener aquí. Almacenar las muestras en PBS a 4 ° C.
  4. Quitar PBS y permeabilizar las células mediante la adición de una solución al 0.1% de la saponina en la solución de bloqueo (albúmina 1% en PBS) durante 10 min en Wash RT. las células con PBS y transferir las muestras a una placa muy nueva.
  5. Incubar las células con una solución de anticuerpos primarios en la solución de bloqueo (tabla 3) durante 1 h a TA. Luego, retirar la solución de anticuerpo primario y lavan las células con PBS.
  6. Incubar las células con anticuerpos secundarios en la solución de bloqueo (tabla 3) durante 1 h a TA.
    Nota: Evite la luz exposición.
  7. Retirar la solución de anticuerpo secundario y lavan las células con PBS y seco.
    Nota: El protocolo se puede detener aquí. Almacenar las muestras en PBS a 4 ° C en la oscuridad.
  8. Montaje de la muestra para la observación del microscopio: usando un cortador de punta de diamante, corte cubreobjetos en 1,25 cm x 1,25 cm. Añada 50 μl de medio en las muestras de montaje microscopia y cubrirlas ligeramente con el cubre-objetos corte.
  9. Transferir las muestras a un receptor conveniente, cubrirla con papel de aluminio y guardar en la oscuridad a 4 ° C hasta observación.

7. la célula de proyección de imagen y análisis de datos

Nota: Para Au(111) opaco y gruesos sustratos a base de microslide, debe usarse un microscopio vertical.

  1. Experimento de la adhesión de fibroblastos.
    1. Uso un microscopio de epifluorescencia había equipado con una cámara digital y aumento de alta (es decir, 40 X) y baja (es decir, 10 X) objetivos. Realizar mediciones en aire.
    2. Coloque la muestra en los núcleos de la célula de la etapa y la imagen con el objetivo de X 10 con una excitación ULTRAVIOLETA, filtro de emisión longpass a visualizar la tinción de Hoechst/DAPI.
    3. Imagen de la célula citoesqueleto y adherencias focales (FAs) con el objetivo 40 X, seleccionando el filtro de microscopio que coincida con las especificaciones correspondientes del fluorocromo de anticuerpo.
    4. Para la cuantificación de FA, utilice un software de procesamiento de imágenes para convertir imágenes a archivos de 8 bits. Quitar las imágenes de fondo y convertir a binario mediante el establecimiento de un umbral. Calcular por lo menos 30 imágenes por muestra y considerar FAs desde 1 μm2 para el cálculo.
  2. Inducción condrogénica de MSCs.
    1. Condensados de la célula de la imagen en las etapas iniciales de inducción condrogénica (< 5 días) con un microscopio de epifluorescencia vertical equipado con una cámara digital y una baja (es decir, 10 X) objetivo de la ampliación. Utilizar filtro de emisión ultravioleta de la excitación y longpass a visualizar la tinción de Hoechst/DAPI.
    2. Para la medición de la zona de condensación, utilizar un software de procesamiento de imágenes, convertir imágenes a archivos de 8 bits, eliminar el fondo y seleccionar un umbral que pone de relieve el contorno total. Calcular el área de las partículas.
    3. Muestras de imagen immunostained para FAs, fibras de actina del citoesqueleto y específicas del cartílago colágeno tipo II alfa 1 (COL2A1) con un microscopio confocal vertical a alta magnificación (es decir, 40-60 X). Recoge secciones en un intervalo representativo (es decir, 0.5-1 μm).
    4. Para procesar la pila, use un software de procesamiento de imágenes. Convertir imágenes a archivos de 8 bits, eliminar el fondo y hacerlos binario mediante el establecimiento de un umbral. Tratar un mínimo de tres condensados de célula por condición de tres muestras independientes.
    5. Cuantificar la proteína FA manchada de las áreas de la zona basal de condensados de la célula y expresa como el porcentaje correspondiente de área dividido por el número de núcleos de células en la imagen.
    6. Para medir la coloración COL2A1, utilizar proyecciones de z confocales y cuantificar la suma de la proyectada (área máxima COL2A1 por muestra). Normalizar el valor del área obtenido contra la zona del condensado correspondiente.

8. cuantitativa análisis de reacción en cadena (qRT-PCR) de la transcripción-polimerasa inversa

Nota: Para evitar contaminación con ARNasas, utilizar artículos de plástico desechables, estériles y desechables guantes durante la manipulación de reactivos y el ARN. Siempre utilice técnicas asépticas microbiológicas adecuadas y utilizar una solución de descontaminación apropiada para eliminar la contaminación de la Rnasa de superficies y artículos no desechables tales como centrifugadoras y pipetas.

  1. Aislar ARN total y pulverizar en un disruptor de RNA. Tratar las muestras de RNA con DNasa y convertirlos en cDNA usando un cDNA síntesis kit.
  2. Conducta de qRT-PCR usando las cartillas para el factor de transcripción SOX9. Beta-2-microglobulina (B2M) y la proteína ribosomal L13a (RPL13a) puede ser utilizado como genes housekeeping.
  3. Calcular los niveles de expresión y normalizar contra el control negativo (PLLA).

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Representative Results

Presentamos un método nanomotivos que permite una adherencia superficial que se abordarán en la nanoescala (figura 1). La estructura química de RGD-Cys-D1 se muestra en la figura 1A. Dendrímeros fueron estampadas sobre superficies conductoras eléctricas del Au(111) para caracterización de STM de alta resolución. Dendrímero bajas concentraciones en la solución (hasta 10-5% w/w) prestados dendrímeros aislado de 4-5 nm de diámetro (figura 1B), mientras que muy lleno dendrímero agregados formados en concentraciones más altas (figura 1). Caracterización superficial de AFM (Figuras 1D-G, fila superior) reveló que la distribución superficial de dendrímeros RGD-Cys-D1 puede ajustarse en función de la concentración inicial del dendrímero en solución. En los mapas de contorno de probabilidad para 8Dmin, esto resulta en diferentes densidades de Nanoescala RGD locales en la superficie (Figuras 1D-G, fila inferior).

En experimentos de cultura celular, las membrana de la célula receptores integrinas de alrededor de 10 nm de diámetro reconoce la secuencia RGD en la periferia de dendrímeros. Aunque ocho copias de esta secuencia fueron proporcionados por dendrímero, solamente un dendrímero interactuó por integrina debido a su tamaño (4-5 nm medidos por STM; Figura 1B). Es decir, cada dendrímero previstas un solo sitio enlace de integrina, así permitiendo una correlación directa del dendrímero distribución (como se ve en las imágenes AFM) y la distribución de servicios disponible para la adhesión celular. Por otra parte, no hay variaciones significativas fueron encontradas en los valores de CA obtenidos para las configuraciones de nanopattern diferentes que pueden influir en la célula adhesión29. Estas características hacen dendrímero nanopatrones sobre sustratos adecuados las superficies biocompatibles que modulan y estudian el comportamiento de la célula.

Adhesión celular a nanopatterned Au(111) fue probado con fibroblastos dentro de las primeras 24 h de cultivo (figura 2A) y con MSCs en nanopatterned PLLA (figura 2B). En ambos casos, el porcentaje de área teñidos para la FA proteína paxillin (pax) aumentado progresivamente con la concentración del dendrímero, igual densidad superficial local RGD (el porcentaje de área de nanopatterned con 8Dmin por debajo del umbral de 70 nm para la adherencia de la célula eficiente; Tabla 4). Para una concentración inicial del dendrímero de 10-2% w/w y los controles positivos, el porcentaje de área mancharon para pax por disminución de la célula y la correlación con el porcentaje de área de nanopatterned con dmin < 70 nm se perdió.

El porcentaje de superficie ocupada por 8Dmin < 70 nm (fila inferior-G de lafigura 1y tabla 4) es un buen indicador de la densidad superficial local de RGD para nanopatrones hasta 10-5% w/w inicial dendrímero concentración, pero no de ésos hasta 10-2% w/w, debido a la agregación del dendrímero. La agregación había producido muestras altamente heterogéneas en términos de distribución de ligando, con sólo un pequeño porcentaje de la superficie con valores de dmin por debajo del umbral de 70 nm (fila inferior de lafigura 1 y tabla 4). XPS los resultados mostraron que estas superficies presentan una densidad global de RGD comparable al 10-5% w/w-derivados nanopatrones28. Esta observación indica que densidad RGD máxima fue alcanzada en las regiones que contiene dendrímero agregados y que el porcentaje de superficie ocupada por 8Dmin < 70 nm no es representativa de la densidad superficial local de RGD en este caso.

La observación de que los controles positivos (revestimientos homogéneos) con máxima densidad superficial local de RGD no mostró el aumento esperado en adhesión celular puede atribuirse a un efecto de impedimento estérico. Estos resultados indican que, comparado con las superficies homogéneas correspondientes utilizadas en cultivo celular, RGD nanopatrones mantienen adhesión celular más eficientemente. Este hallazgo destaca así la importancia de la densidad local de ligando.

Interacciones con el entorno en morfogénesis desencadenan los primeros eventos de la diferenciación celular y propagan hasta el establecimiento de las estructuras del tejido complejo final. Para evaluar los efectos del dendrímero nanopatrones sobre la adhesión celular y la diferenciación, se utilizó la inducción condrogénica de MSCs como modelo. Durante la condrogénesis, hay remodelación de matriz activa, que desempeña un papel instructivo en la dirección de las células a través de las diferentes etapas de la formación de cartílago.

MSCs experimentaron la condrogénesis en el nanopatrones (figura 3). Diferenciación condrogénica comienza con un paso de condensación de la célula, que implica el reclutamiento de células para formar condensados densos, el establecimiento de la comunicación de célula a célula y los cambios concomitantes en la célula morfología33. Figura 3A muestra que condensación celular ocurrió en todos los sustratos y los condensados aumentaron en área con aumento de las concentraciones de dendrímero hasta 2.5 x 10-8% w/w la zona de condensado entonces disminuyó otra vez para un dendrímero concentración de 10-2% w/w y para el control positivo. El paso de condensación celular en la condrogénesis se produce a través del movimiento de la celda activa en lugar de a través de un aumento de proliferación celular34. Este movimiento celular es favorecido por la adhesión flexible con el sustrato: adherencias estables deben ser formadas para permitir que las fuerzas de tracción hacia el cuerpo celular, y al mismo tiempo, estas adherencias deben ser lo suficientemente débiles para permitir la liberación celular del sustrato durante la movimiento. Condensación celular es favorecido por un aumento en densidad superficial local de RGD hasta 2.5x10-8% w/w-derivados nanopatrones, con un buen equilibrio entre adherencia celular y movimiento celular. Para 10-2 y el control positivo, la densidad superficial de lectura local era demasiado alta, así que el evento de condensación.

Diferenciación condrogénica procede de condensados prechondrogenic: células en condensados se convierten más redondeadas y comenzar la síntesis de marcadores específicos de cartílago como la proteína COL2A1 del ECM y la transcripción del factor SOX933, 34 , 35. por consiguiente, los sustratos con una adherencia intermedio, favoreciendo la formación de condensados de la célula, demostraron mayor COL2A1 tinción (figura 3B) y mayores niveles de expresión de mRNA de SOX9 (figura 3).

Nuestros resultados destacan la influencia de interacciones de célula matriz durante las primeras etapas de la diferenciación condrogénica. Tales interacciones pueden dirigirse fácilmente a través de nanopatrones dendrímero-basado.

Paso Tiempo (s) Velocidad (rpm) Aceleración (rpm/s)
1 5 500 300
2 30 3.000 1.500

Tabla 1: pasos de programa cono utilizados para cubrir el portaobjetos con la solución preparada de PLLA. Un primer paso de homogeneización se utilizó a 500 rpm con una aceleración de 300 rpm/s durante 5 s. seguido por un último paso a 3.000 rpm con una aceleración de 1.500 rpm/s a 30 s.

Solución RGD-Cys-D1 (mg/mL) RGD-Cys-D1 (mg) Agua MQ (μL)
A 0.77 5 6.494
RGD-Cys-D1 (% w/w) Solución (μL)
B 10-2 37½ 5.220
C 10-5 0,78 6.000
Solución C (μL)
D 2,5 x 10-8 15.0 5.985
E 10-8 6.0 5.994
F 4 x 10-9 2.4 5.998

Tabla 2: Detalles de la preparación de las soluciones de RGD-Cys-D1 usada. Solución madre de dendrímeros RGD-Cys-D1 fue preparada a una concentración final de 0,77 mg/mL (solución A), de la cual se prepararon las soluciones B y C en el 10-2 y 10-5% w/w concentraciones. Solución C con una concentración de 10-5% w/w de RGD-Cys-D1 dendrímero se utilizó para preparar soluciones D, E y F en concentraciones finales de 2.5 x 10-8, 10-8 y 4 x 10-9%w/w, respectivamente.

Nombre Volumen (μL) Solución amortiguadora de bloqueo (mL)
Mix primaria MAb de conejo a pax 65 12.870
MAb de ratón a COL2A1 32.5
Mezcla secundaria Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón 13 12.961
Alexa Fluor 568 anti-conejo de cabra 13
Solución de Hoechst 13

Tabla 3: preparación de solución anticuerpo. Anticuerpo monoclonal anticuerpo primario mezcla contenida contra pax producido en conejo diluido 1: 200 en la solución de bloqueo con anticuerpo monoclonal contra COL2A1 producidas en ratón diluido 1: 400 en la solución de bloqueo. La mezcla de anticuerpo secundario contiene la mancha de núcleos de célula Hoechst y los anticuerpos secundarios producción en cabra contra ratón y conejo respectivamente (marcada con Alexa Fluor 488 y 568 fluoróforos, respectivamente).

Figure 1
Figura 1 : Nanomotivos del dendrímero de RGD-Cys-D1 para el control de escala nanométrica de densidad superficial local de RGD. (A) RGD-Cys-D1 dendrímero estructura que contiene hasta ocho copias del péptido RGD adhesivo de la célula. Imágenes de STM representante (sesgo = 200 mV, punto de consigna = 0,5 nA) de RGD-Cys-D1 nanopatrones sobre Au(111) de una solución acuosa inicial de 10-8% w/w (barra de escala = 3 nm, B) y el correspondiente Perfil de altura-distancia obtenida en los puntos región indicada en (B)y (C) de 10-2% w/w muestra agregación dendrímero (barra de escala = 20 nm). (D-G) Imágenes de AFM representante de nanopatrones RGD-Cys-D1 en PLLA obtienen de las correspondientes soluciones acuosas dendrímero de 2,5 x 10-8%, 10%-8, 10-2%y 4 x 10-9% w/w, respectivamente (barra de escala = 1 μm). El mapa de contorno de probabilidad correspondiente de mínima distancia entre partículas (8Dmin) aparece debajo de cada imagen AFM, con alta densidad regiones RGD en rojo oscuro (8Dmin < 70 nm). Agregados de dendrímeros y dendrímero se representan en negro para mayor claridad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Célula de adherencia en el nanopatrones RGD-Cys-D1. Diagrama del porcentaje de área de teñido para el FA proteínas pax por la célula de las células en contacto con el sustrato (eje izquierdo) con la concentración inicial del dendrímero. Valores se comparan con la densidad superficial local de RGD (porcentaje de superficie en el nanopatrones que contiene valores demin dpor debajo del umbral de nm 70) (eje derecho) con porcentajes de 100 y 0, asignados a la positiva (+ control) y negativo (- controles control), respectivamente. (A) adhesión de fibroblastos en el dendrímero nanopatrones sobre Au(111) después de 4,5 h de cultura. (B) adhesión MSC en el dendrímero nanopatrones en PLLA evaluado en el día 1 de inducción condrogénica. Valores se dan como la media con la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

RGD-Cys-D1 (% w/w) Área (< dmin = 70 nm) (%) en Au(111) Área (< dmin = 70 nm) (%) en PLLA
10-2 5 ± 1 2 ± 2
10-5 97 ± 2
2, 5 x 10-8 65 ± 11 90 ± 2
10-8 25 ± 16 45 ± 7
4 x 10-9 18 ± 11

Tabla 4: porcentaje del área con d min valores por debajo de 70 nm obtenidos para RGD-Cys-D1 dendrímero deposición en Au(111) y en PLLA las superficies en función de las concentraciones del dendrímero inicial utilizado.

Figure 3
Figura 3 : Diferenciación condrogénica de MSCs en el nanopatrones RGD-Cys-D1. (A) condensación de MSCs cultivadas en RGD-Cys-D1 nanopatrones en PLLA después de 5 días de inducción condrogénica. Imágenes de epifluorescencia de representante de los núcleos de célula teñida (Hoechst; Barra de escala = 300 μm; fila superior) y parcela de la zona de condensados de celda (fila inferior) obtenida en nanopatrones RGD-Cys-D1 del dendrímero inicial diferentes concentraciones. Diferenciación procede del paso de condensación de la célula con la expresión de marcadores específicos condrogénica: (B) porcentaje de la zona de COL2A1 coloración normalizada con el área del condensado de la célula de las correspondientes z confocales-proyecciones obtenidos después de 5 días de inducción condrogénica. (C) la expresión del mRNA de SOX9 relativa (contra el control negativo) después de 3 días de inducción condrogénica. Valores se dan como la media con la desviación estándar (B) y (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Durante el desarrollo del protocolo descrito, se debe considerar una serie de pasos críticos. La primera se refiere a la caracterización de la nanopattern con técnicas de microscopía de sonda de exploración. Para visualizar el nanopatrones, la superficie donde se produce el patrón debe tener un valor de rugosidad bajo el diámetro medio de los dendrímeros, que es alrededor de 4 – 5 nm medida por STM (figura 1B). Además, debe tenerse en cuenta que la proyección de imagen de STM de alta resolución se limita a substratos conductivos, en este caso Au(111). Cualquier elevación del polímero de las esquinas de la diapositiva después de la capa de spin puede corregirse usando pegamento biocompatible.

Dendrímero nanomotivos es un proceso a través del cual lograr adherencia de célula local en la nanoescala. Basada en la uno mismo-Asamblea de dendrímeros en la superficie por adsorción, esta técnica no requiere ningún equipo de complejo nanomotivos, contrastando así con anteriormente descrito métodos basados en la litografía36,37, 38. dendrímero nanomotivos puede fácilmente ampliarse a grandes superficies y es totalmente compatible con los protocolos de cultivo celular.

El método de nanomotivos del dendrímero descrito aquí puede encontrar futuras aplicaciones en medicina regenerativa. El control ejercido por dendrímero nanomotivos en adherencia de la célula hace que esta técnica adecuado para el acondicionamiento de biomateriales antes de la implantación, facilitando así su integración en los tejidos del huésped. Por otra parte, la facilidad con que dendrímero pueden modificarse partes periféricas que hace dendrímero nanomotivos apropiado para otros ligandos que ejercen actividad dependiente de la concentración en las células.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Los autores reconocen Oriol Font-Bach y Albert G. Castaño por su ayuda en dmin cuantificación. También reconocen a la unidad de microscopía Digital avanzada en el Instituto de investigación biomédica (IRB Barcelona) dejó a los autores de grabar el vídeo en sus instalaciones. Este trabajo fue apoyado por la red biomédica investigación centro (CIBER), España. CIBER es que una iniciativa financiada por el VI nacional R & D & i Plan 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, programa Consolider, acciones CIBER y el Instituto de Salud Carlos III, con el apoyo del Fondo Europeo de Desarrollo Regional. Este trabajo ha sido apoyado por la Comisión de universidades e investigación de la Consejería de innovación, universidades y empresa de la Generalitat de Catalunya (SGR 2014 1442). También fue financiado por los proyectos OLIGOCODES (no. MAT2012-38573-C02) y CTQ2013-41339-P, otorgado por el Ministerio de economía y competitividad, además a INTERREG V-A Portugal España 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. reconoce apoyo económico de la beca de Ministerio de economía y competitividad Español (no. IFI15/00151).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm  Spi Supplies 466PS-AB
Glass micro slides, plain Corning 2947-75x25
Deionized water Millipore 18MΩ cm
Ethanol 96% PanReac 131085.1212
L-Lactide/DL-Lactide copolymer Corbion 95/05 molar ratio
1,4 - dioxane Sigma-Aldrich 296309-1L
Silicone oil, high temperature Acros Organics 174665000
Spinner Laurell WS-650MZ-23NPP/Lite
Tissue culture laminar flow hood Telstar Bio II Advance Class II biological safety cabinet
Filter unit Millex-GP SLGP033RB 0.22 µm
Syringe 10 mL Discardit 309110
Atomic Force microscope Veeco Instruments Dimension 3000 AFM instrument
Silicon AFM probes Budget Sensors Tap300AI-G Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m
Scanning tunneling microscope Molecular Imaging PicoSPM microscope
Pt0.8:Ir0.2 wire Advent PT671012 Diameter 0.25 mm
WSxM 4.0 software Nanotec electronica
Optical contact angle (CA) system Dataphysics
SCA20 software Dataphysics
X-ray photoelectron spectrometer Physical Electronics Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141-1MG 1.0 mL solution
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) Gibco 21600-10 Powder
Mouse embryo fibroblasts ATCC ATCC CRL-1658 NIH/3T3
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose Gibco 11960044 liquid high glucose, no glutamine, 500 mL
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000044 500 mL
L-Glutamine Invitrogen 25030 200 mM (100X)
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140
Sodium pyruvate Invitrogen 11360039 100 mL
T75 culture flasks Nunclon 156499
Trypsin Life Technologies 25200072 0,25% EDTA
Centrifuge Hermle Labortechnik Z 206 A
Non-tissue culture treated plate, 12 well Falcon 351143 Non-adherent
Adipose-derived hMSCs ATCC ATCC PCS-500-011 Cell vial 1 mL
MSC basal medium ATCC ATCC PCS-500-030
MSC growth kit ATCC ATCC PCS-500-040 Low serum
Chondrocyte differentiation tool ATCC ATCC PCS-500-051
Formalin solution Sigma-Aldrich HT5011-15ML neutral buffered, 10%
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434-500G for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
Saponin Sigma-Aldrich 47036-50G-F for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059-50G
Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody Abcam ab32084 Diluted 1:200
Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain  Acris Antibodies AM00212PU-N Diluted: 1:400
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A10667 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11036 2 mg/mL. Diluted 1:1000
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10ML 10 mg/mL. Diluted 1:1000
Cover glass 24x24 mm Deltalab D102424
Fluoromount Sigma-Aldrich F4680-25ML
Epifluorescence Microscope Nikon Eclipse E1000 upright microscope with a CCD camera
Confocal Microscope Leica Microsystems Leica SPE Upright Confocal Microscope
ImageJ 1.50g freeware http://imgej.nih.gov/ij
MATLAB software The MATHWORKS, Inc.
OriginPro 8.5 software  OriginLab Coorporation

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