Overlappende peptid biblioteket tilordne Qa-1 Epitopes i et Protein

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

QA-1 (HLA-E i menneskelig) tilhører en gruppe av ikke-klassiske store histocompatibility kompleks 1b molekyler. Immunisering med Qa-1-bindende epitopes har vist seg å øke vev-spesifikk immun regulering og forbedre flere autoimmune sykdommer. Her beskriver vi en overlappende peptid biblioteket strategi for identifikasjon av Qa-1 epitopes i et protein.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Xu, Y., Wasnik, S., Baylink, D. J., Berumen, E. C., Tang, X. Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein. J. Vis. Exp. (130), e56401, doi:10.3791/56401 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

QA-1 (HLA-E i menneskelig) tilhører en gruppe av ikke-klassiske store histocompatibility kompleks 1b (MHC-Ib) molekyler. Siste data tyder på at Qa-1 molekyler spille viktige roller i kartlegging celler for strukturelle og funksjonelle integritet, indusere immun regulering og begrense immunreaksjoner for virusinfeksjoner. I tillegg funksjonelle augmentation av Qa-1-begrenset CD8+ T celler gjennom epitope immunisering har vist terapeutiske effekter i flere autoimmun sykdom dyr modeller, f.eks eksperimentelle allergisk immunsviktvirus, kollagen indusert artritt, og ikke-obese diabetes. Derfor er det et presserende behov for en metode som kan effektivt og raskt identifisere funksjonelle Qa-1 epitopes i et protein. Her beskriver vi en protokoll som benytter Qa-1-begrenset CD8+ T celle linjer spesifikke for en overlappende peptid (OLP) bibliotek for å bestemme Qa-1 epitopes i et protein. Dette maritime biblioteket inneholder 15-mer overlappende peptider som dekker hele lengden på et protein, og tilstøtende peptider overlappe av 11 aminosyrer. Bruker denne protokollen, identifisert vi nylig en 9-mer Qa-1 epitope i myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG). Dette nylig tilordnede MOG Qa-1 epitope ble vist å indusere epitope-spesifikke, Qa-1-begrenset CD8+ T celler som forbedret myelin-spesifikk immun regulering. Derfor denne protokollen er nyttig for fremtidige undersøkelser av romanen mål og funksjonene til Qa-1-begrenset CD8+ T celler.

Introduction

QA-1 tilhører en gruppe av ikke-klassiske store histocompatibility kompleks 1b (MHC-Ib) molekyler i mus. Den menneskelige homolog er HLA-E. Tidligere bevis har vist at Qa-1 molekyler har viktige biologiske funksjoner. Først spiller Qa-1 molekyler en viktig rolle i kartlegging celler for strukturelle og funksjonelle integritet. I denne forbindelse har Qa-1 molekyler utviklet flere strategier for å overvåke normal funksjon av en celle. En slik strategi kan Qa-1 molekyler til skjemaet komplekser med et behandlet leder peptid (epitope), dvs den Qa-1 determinant modifikator (Qdm) som behandles fra klassisk MHC-Ia molekyler i endoplasmatiske retikulum1. Disse Qa-1/Qdm senere vises på overflaten av en celle og binde til hemmende NKG2A reseptorer på NK celler å hemme NK drepe aktivitet2. Hvis uttrykket av MHC-Ia molekyler er tapt, blir en celle (f.eks en ondartet celle) følsomme for NK drepe2. Andre strategien aktiverer Qa-1 molekyler å danne nye Qa-1/epitope komplekser på overflaten av en celle som er mangelfull i trykk (transporter forbundet med antigen prosessering)3 og/eller ERAAP (endoplasmatiske retikulum aminopeptidase tilknyttet antigen prosessering)4 (både mangler ofte oppstår i ondartede celler). Cellen som uttrykker disse nye Qa-1/epitope komplekser kan deretter gjenkjennes og eliminert av epitope-spesifikke Qa-1-begrenset CD8+ T celler. Dernest indusere Qa-1 molekyler immun regulering5. I denne forbindelse Qa-1/epitope komplekser har vist seg å stimulere CD8+ regulatoriske T (Treg) celler som er viktige for forebygging av immun-mediert skade selv-vev6,7,8 ,9,10. For det tredje, Qa-1-begrenset CD8+ Treg celler har vist seg å begrense immunreaksjoner mot virusinfeksjon11.

Derfor bestemte augmentation av epitope-spesifikke Qa-1-restrictred CD8+ T celler er en potensielt lovende strategi for eliminering av unormale celler for styrking av immunforsvaret regulering og for kontroll av omfanget av virus-indusert immunreaksjoner. Mens det er ikke fastslått om styrking av epitope-spesifikke Qa-1-begrenset CD8+ T celler kan forbedre immun overvåking og begrense forårsaket av virus immunreaksjoner, våre laboratorier og andre har vist at immunisering med Qa-1 epitopes kan utvide funksjonen til Qa-1-begrenset CD8+ Treg celler spesifikke for patogene autoimmune CD4+ T celler, fører til effektiv kontroll av CD4+ T celle-mediert autoimmune sykdommer i en rekke dyr modeller som eksperimentelle allergisk immunsviktvirus (en dyr modell av menneskelig multippel sklerose)6,10, kollagen indusert artritt (en dyr modell av menneskelig revmatoid artritt)7, og ikke-obese diabetes (en dyr modell av menneskelig type 1 diabetes)8. I tillegg har vi oppdaget at immunisering med en vev-spesifikke Qa-1 epitope fører til bestemt kontroll av immun-mediert betennelse i at vev gjennom augmentation av CD8+ Treg celler12. Over suksesser prekliniske studier indikerer et behov for en fullstendig vurdering av Qa-1 epitope immunisering for behandling av vev-spesifikke immun-mediert sykdommer og potensielt for behandling av andre sykdommer knyttet til mangler trykk og ERAAP.

Følgelig er det et behov for en teknologi som kan trygt og raskt analysere Qa-1 epitopes i et protein. I denne forbindelse har et begrenset antall biologisk viktig Qa-1 epitopes blitt beskrevet. De fleste av disse Qa-1 epitopes ble identifisert serendipitously under studiet av CD8+ T celle Svar å bakterier13, celler mangelfull i trykk3, mangelfull i ERAAP4celler og celler som forårsaker EAE6, 9. Derfor er en høy gjennomstrømning teknikk ønskelig for identifikasjon av biologisk viktig Qa-1 epitopes i et definert protein. Nedenfor beskriver vi en overlappende peptid (OLP) bibliotek strategi som tilordner funksjonelle Qa-1 epitopes i et protein bruker Qa-1-resrticted CD8+ T celle linjer spesifikke for maritime bassenget (OLP_pool) av et protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentene ble gjort i samsvar med en institusjonell Animal Care og bruk protokollen godkjent av Animal Care og bruk komiteen ved University of Texas El Paso og Loma Linda University.

1. generasjon OLP bibliotek dekker hele lengden av et Protein

  1. Utforme et OLP bibliotek der alle peptider er 15-mer i lengde, og tilstøtende peptider overlapper 11 aminosyrer.
    Merk: I MOG OLP studien, rekke MOG forløperen [Mus musculus] ble Hentet fra NCBI protein databasen ved å følge denne linken: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. MOG forløperen (247 aminosyrer), som inneholdt både signalet og modne peptider, ble brukt fordi de fleste rapporterte Qa-1 (HLA-E) epitopes ble plassert i signal peptider (f.eks Qdm1). Begynnelsen på dens N-terminus, ble sekvenser av 15-mer peptider identifisert slik at to tilstøtende peptider overlappes av 11 aminosyrer (figur 1). Derfor ble nøyaktig 59 OLPs identifisert i 247 aminosyre MOG forløperen. Men kan den siste OLP variere fra 12 til 15-mer avhengig av lengden av protein. I tillegg velger vi 15-mer biblioteket fordi vi og andre har vist at 15-mer peptider, da legges inn dendrittiske celler (DCs) eller makrofager, kan være effektivt behandles i epitopes for anerkjennelse av CD8+ T celler14,15 .
  2. Kjøpe hver individuelle peptid kommersielt. 5 mg per peptid bør være nok for screening. OLPs og avkortede peptider (trinn 6.1) kan være avsalte peptider (renhet er ca 50-70%). Renheten av optimal peptid (trinn 6.2) som skal brukes for generering av tetramer og fremtidige biologiske analyser skal > 90%. Rekonstituer peptidene under sterilt tilstand.
  3. Gjøre 50 mg/mL personlige peptid aksjer i 100% DMSO. For 5 mg hver peptid, legge 100 μL DMSO i hver retning, blande, og lagre peptidene på 20 ° C. Disse aksjene vil brukes til å lage en OLP_pool lager for generering av CD8+ T celle linjer reaktiv til OLP_pool. I tillegg bestandene vil også bli brukt til å gjøre 10 mg/mL personlige peptid aksjer for å bestemme evne til hver individuelle peptid å stimulere en Qa-1-begrenset respons i en OLP_pool-reaktive CD8+ T celle linje.
  4. Produser OLP_pool lager ved å legge en like volum av hver peptid i en fersk rør. Dette OLP_pool lager inneholder 100% DMSO. I MOG OLP studien var 59 OLPs12. Derfor var konsentrasjon av hver peptid i OLP_pool 847.46 μg/mL (50 mg/mL ÷ 59).
  5. Gjøre 10 mg/mL personlige peptid aksjer ved utvannende (5 x) 50 mg/mL aksjen i sterilt H2O i en V-bunn 96-brønns plate (dette lager inneholder 20% DMSO). Gjøre disse bestandene i en 96-brønns plate fordi fastsettelse av Qa-1-begrenset responsen av hver individuelle peptid utføres i en 96-brønns plate med en 8 - eller 12-kanals multikanal pipette.
    Merk: Alle peptider, inkludert OLPs og avkortede peptider, bør fortynnet i enten en V-bunn 96-brønns plate eller en 96-brønns eksempel rack fylt med 1 mL rør siden peptid biblioteket screening utføres i 96-brønnen plater ved hjelp av en flerkanals pipette. Hvis det er vanskelig å fortynne et peptid, legge 1 N NaOH dråpe klokt å oppløse peptid.

2. grunning kb-/- Db-/- CD8+ T-celler med OLP_pool-pulsed Kb-/- Db-/- dendrittiske celler (DCs).

Merk: Det er to store Qa-1 alleler: en er Qa-1en, og den andre er Qa-1b. Siden dyrene brukte for akademisk forskning, f.eks C57BL/6 og Balb/c mus, bære Qa-1b, denne protokollen beskriver fremgangsmåten for kartlegging Qa-1b epitopes i et protein. CD8+ T celler som brukes i denne protokollen er renset fra Kb-/-Db-/- mus (C57BL/6 bakgrunn) i hvilke CD8+ T celler er begrenset av ikke-klassiske MHC-Ib molekyler inkludert Qa-1.

  1. Produsere Ben margtransplantasjon-avledet DCs som beskrevet tidligere12.
    1. Kort, kultur benmarg enkeltcelle suspensjoner (1 x 106 celler/mL) i RPMI-10 medium (RPMI 1640 supplert med 10% fosterets bovin serum, 5.5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1 mM natrium pyruvate og 0,1 mM unødvendige aminosyre) inneholder 10 U/mL IL-4 og 100 U/mL GM-CSF i en 6-vel plate (4 mL/vel) ved 37 ° C, 5% CO2.
    2. To dager senere, fjerne ikke-tilhenger celler nøye og legge frisk media og cytokiner.
    3. Etter dyrking cellene for to dager, kan du overføre ikke-tilhenger cellene som inneholder ferske media og cytokiner i en ny 6-vel-plate.
    4. Kultur cellene for to dager og replenished med fersk media og cytokiner som inneholder LPS (0,1 µg/mL) å aktivere domenekontrollere.
    5. 24 timer senere, samle DCs for eksperimenter.
  2. Irradiate DCs med 3000 Rads.
    1. Alternativt, behandle DCs (5 x 107 cellen/mL) med mitomycin C (50 μg/mL) Legg RPMI-0 (RPMI 1640 uten serum) i PBS på 37 ° C i 20 min. å fylle røret (~ 12 mL) og spin celler for 10 min i en bord sentrifuge på 300 x g. forkaste supernatants og repea t vask prosedyren to ganger. Disse tre vasker er avgjørende fordi noen spor mengde mitomycin C kan hemme svar CD8+ T celler under DC-T celle co kultur.
  3. Justere DC konsentrasjonen til 5 x 106 celler/mL i et serum-free medium (AIM-V serum-free medium med 5.5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1 mM natrium pyruvate og 0,1 mM unødvendige aminosyre).
  4. Legg OLP_pool lager løsning, som inneholder 100% DMSO til DCs slik at siste DMSO konsentrasjon vil være 0,5% (200 x). MOG OLP studien var konsentrasjonen av hver OLP i OLP_pool 847.46 μg/mL; derav var den endelige konsentrasjonen av hver OLP i DC kultur 4,2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200).
Men kan denne konsentrasjonen skaleres opptil 100 μg/mL så lenge DMSO konsentrasjonen i cellekultur er mindre enn 1%.
  • Inkuber DCs ved romtemperatur for 3t og riste cellene forsiktig hvert 15 min.
  • Under denne inkubasjonstiden, rense CD8+ T celler fra høstet milt eller lymfeknuter kb-/-Db-/- mus med en kommersiell CD8+ T celle rensing kit, justere celle konsentrasjonen til 10 x 106 celler/mL i serum-free mediet som inneholder 50 U/mL interleukin 2 (IL-2) og 100 U/mL av IL-7.
  • Nå legge CD8+ T celler i en 48-vel plate som 0,5 mL/vel (etter tillegg 0,5 mL/vel av OLP_pool-pulsed domenekontrollere i trinn 2.8, siste konsentrasjonen av CD8+ T celler blir 5 x 106 celler/mL).
    Merk: CD8+ T celler fra musen milten og lymfeknutene kan bli renset ved hjelp CD8 Positive isolering Kit ved å følge instruksjonene fra produsenten. CD8+ T celler innhentet er perler.
  • Nedspinning OLP_pool-pulsed DCs (300 x g, 10 min) på RT. Rekonstituer OLP_pool-pulsed DCs til 2 x 106 celler/mL i serum-free medium og legge 0,5 mL/godt inn i 48-vel-plate som inneholder CD8+ T celler (siste konsentrasjonen av maritime _pool-pulsed DCs er 1 x 106 celler/mL, siste konsentrasjon av CD8+ T celler er 5 x 106 celler/mL, siste konsentrasjonen av IL-2 er 25 U/mL og endelige konsentrasjonen av IL-7 er 50 U/mL). Kultur cellene på 37 ° C og 5% CO2.
  • På dag 4, fjerne og forkaste 400 μL kultur medium og Legg 500 μL frisk serum-free mediet som inneholder 100 U/mL IL-2 og 100U/mL av IL-7 i hver brønn. Inkuber cellene på 37 ° C og 5% CO2.
  • På dag 7 eller 8, å stimulere OLP_pool-primet CD8+ T celler med OLP_pool.
  • 3. restimulation av primet CD8+ T celler med makrofager pulserende med OLP_pool

    1. Fire dager før re stimulering av OLP_pool-primet CD8+ T celler, forberede 2% (v/v) polyakrylamid perle løsning: vask 2 g av polyakrylamid perler to ganger i 20 mL endotoxin gratis H2O eller PBS. Pellets polyakrylamid perler med sentrifugering (400 x g) i 5 min og resuspend i 100 mL PBS. Autoclave på 15 lb/m i 20 min. butikken ved romtemperatur.
    2. Injisere mus intraperitoneally med 1 mL/mus sterilt 2% polyakrylamid perle løsningen å tiltrekke inn overføringen av monocytter/makrofager i bukhulen16.
    3. Fire dager senere, ofre dyr av CO2 overdose.
      1. Under sterile forhold, skåret en liten åpning i midten av magen slik at åpningen er akkurat nok for bestått en 5 mL overføring pipette. Fyll overføring pipette med RPMI-0 og pipette inn i magen hulrommet gjennom åpningen.
      2. Skyll magen hulrommet av pipettering. Pipetter ut så mye som mulig fra magen hulrom i et sterilt rør (dette er peritoneal makrofager). Gjenta skyll trinn 4 - 5 ganger.
    4. Irradiate peritoneal makrofager med 3000 Rads.
      1. Du kan også behandle peritoneal makrofager med mitomycin C (Følg fremgangsmåten som er beskrevet i trinn 2.2).
    5. Justere konsentrasjonen av peritoneal makrofager til 5 x 106 celler/mL i serum-free medium. Legg OLP_pool lager (siste DMSO konsentrasjonen er mindre enn 1%) og M-CSF (siste konsentrasjon = 100 U/mL).
      Merk: I denne MOG OLP studien vi brukte 0,5% DMSO. Dermed var MOG OLP_pool lager utvannet 200 x (f.eks 1 μL MOG OLP_Pool lager ble lagt i 199 μL peritoneal makrofager). Siste konsentrasjonen av hver OLP var derfor 4,2 μg/mL).
    6. Legg til 200 μL/vel (1 x 106 celler/vel) i en 48-og vev kultur plate og ruge platen på 37 ° C 4 h.
    7. Fjerne ikke-tilhenger cellene og polyakrylamid perler ved mild vask med 200 μL/godt av forvarmes RPMI-0.
    8. Samle og svømmebasseng i OLP_pool primet CD8+ T celler fra trinn 2.10. Justere OLP_pool primet CD8+ T celle konsentrasjon til 1 x 106 celler/mL i serum-free medium som inneholder 25 U/mL IL-2 og 50 U/mL av IL-7. Legge til 1 mL/godt til 48-vel plate som inneholder OLP_pool-pulsed peritoneal makrofager.
    9. Fire dager senere, fylle mediet i 48-vel platen. Fjerne og slette 400 μL kultur medium i 48-brønnen platene. Legge til 500 μL frisk serum-fri medium som inneholder 100 U/mL IL-2 og 100 U/mL av IL-7 i hver brønn. Kultur cellene på 37 ° C og 5% CO2.
    10. Tre eller fire dager senere, undersøke den OLP_pool-restimulated CD8+ T-cellene for OLP_pool-spesifikke, Qa-1-begrenset respons ved enzym knyttet immunospot analysen (ELISPOT). Etter dette punktet, å stimulere CD8+ T celler hver 7-10 dager.
      Merk: Makrofager foretrekkes for re stimulering av OLP_pool-primet CD8+ T celler. Vi merket at CD8+ T celler re stimulert av macrophage vokste bedre enn DCs i vitro.

    4. fastsettelse av OLP_pool-spesifikke, Qa-1-begrenset respons i en OLP_pool-restimulated CD8+ T celle linje

    Merk: OLP_pool-spesifikke, Qa-1-begrenset respons i en OLP_pool-restimulated CD8+ T celle linje bestemmes av IFNγ sekresjon etter stimulering av OLP_pool i nærvær av C1R eller C1R. QA-1b celler ved hjelp av en IFNγ ELISPOT analysen. C1R celler kan fås kommersielt. C1R. QA-1b celler kan genereres ved transducing C1R cellene med Qa-1 lentiviral vektoren.

    1. Legg 100 μL/vel en fange anti-IFN-γ antistoff fortynnet i belegg buffer (PBS) i brønnene av en ELISPOT plate.
    Seal og ruge platen ved 4 ° C over natten.
  • På den andre dagen, forkaste belegg bufferen som inneholder fange anti-IFN-γ antistoffer og legge til 200 μL/godt-blocking løsning (serum-free medium) og ruge platen i 2 timer ved romtemperatur.
  • Irradiate C1R og C1R. QA-1b celler med 9.600 Rads.
    1. Du kan også behandle C1R og C1R. QA-1b celler med mitomycin C som beskrevet i trinn 2.2 bortsett fra at behandling tid vil være 30 min.
  • Juster C1R og C1R. QA-1b celler i serum-free medium til 4 x 106 celler/mL.
  • Forkast blokkerer løsningen i platen og legge til C1R og C1R. QA-1b celler på 50 μL/vel (200 000 celler/vel) og bland.
  • Legg 50 μL/vel 100 x fortynnet OLP_pool lager (i serum-free medium) og bland riktig. Inkuber platen ved romtemperatur for 2-3 h.
  • Justere OLP_pool-restimulated-CD8+ T celler 1-2 x 106 celler/mL i serum-free medium som inneholder 150 U/mL av IL-7 og legge 50 μL/vel (50.000 – 100.000 celler/vel) til platen. Sentrifuge platen (58 x g) i 5 minutter.
  • Inkuber platen på 37 ° C og 5% CO2 over natten.
  • Sug opp cellen suspensjon. Vask brønner 2 ganger med deionisert (DI) vann (250 μL/vel). Tillate brønner suge 5 min på hver vask trinn.
  • Vask brønner 3 ganger med vaskebuffer jeg (PBS inneholder 0,05% Tween20). Tillate brønner suge 1 min på hver vask trinn. Kast vaskebuffer.
  • Tilsett 100 μL oppdagelsen antistoff fortynnet i en fortynning buffer (PBS inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS)).
  • Inkuber platene ved romtemperatur for 2T.
  • Kast oppdagelsen antistoff løsning. Vask brønner 3 ganger med 250 µL/vel vaske Buffer I. gi brønner suge 1 min på hver vask trinn.
  • Legg 100 μL/godt av enzymet konjugert (Streptavidin-HRP) fortynnet i fortynning buffer på 1: 100 fortynning.
  • Inkuber platene 1t ved romtemperatur.
  • Kast enzym konjugat løsning. Vask brønner 4 ganger med 250 µL/vel vaske Buffer I. gi brønner suge 1 min på hver vask trinn.
  • Vask brønner 2 ganger med 250 µL/godt vaske bufferen II (PBS).
  • Tilsett 100 µL av substratløsningen (mix 1 dråpe = 20 µL av AEC Chromogen med 1 mL av AEC substrat) hver brønn. Overvåke spot utvikling for 5 til 60 minutter.
  • Da ønskede resultater begynner å oppstå, stoppe substrat reaksjonen ved å vaske brønner med destillert vann.
  • Air-Dry plater ved romtemperatur for 2 timer eller over natten før det er helt tørt. Fjerning av plast skuffen under platene vil gjøre tørking. Lagre plater i en forseglet plastpose i mørket før det er analysert.
  • Nummerere flekker manuelt ved kontroll under dissecting mikroskop eller en ELISPOT plate leser. Se representant resultatet i figur 2.
  • 5. fastsettelse av personlige peptider i OLP_pool som stimulerer til Qa-1 begrenset IFN-γ utskillelsen i en OLP_pool-spesifikke CD8+ T celle linje

    1. Bestemme de personlige peptidene som stimulerer OLP_pool-spesifikk, Qa-1-restrictred IFN-γ sekresjon i en OLP_pool-spesifikke CD8+ T celle linje med ovenfor beskrevet IFN-γ ELISPOT analysen (siste konsentrasjon av hver individuelle peptid brukes for ELISOPT er analysen 10 μg/mL). Se representant resultater i Figur 3.
      Merk: En OLP-spesifikk, Qa-1-restircted svaret er definert som et svar som er minst tre ganger av respons i nærvær av C1R. QA-1b -cellene men uten OLP. I MOG OLP studie, OLP68, OLP96 og OLP105 oppfylt dette vilkåret. Derfor inneholde alle de tre OLPs Qa-1 epitopes12 (Figur 3). Men ga OLP105 konsekvent sterkeste svaret. vi derfor utførte en detaljert analyse av OLP105 (Figur 4 og figur 5)12.

    6. identifikasjon av den optimale Qa-1 Epitope i en 15-mer OLP som stimulerer Epitope-spesifikke, Qa-1-begrenset svaret i en OLP_pool-spesifikke CD8+ T celle linje

    1. Syntetisere C - og N-terminalt avkortet peptider av en 15-mer OLP som vist i Figur 4.
    2. Undersøke IFN-γ sekresjon i en OLP-spesifikke CD8+ T celle linje ved å stimulere CD8+ T celler med hver av avkortet peptidene samt foreldrekontroll 15-mer-maritime i nærvær av C1R eller C1R. QA-1b celler med ovenfor beskrevet IFN-γ ELISPOT analysen. Siste konsentrasjonen av hver individuelle peptid brukes for ELISPOT analysen er 10 μg/mL. Et peptid er definert som den optimale Qa-1 epitope hvis peptid: 1) konsekvent gir lignende eller sterkere IFN-γ svar, sammenlignet med den opprinnelige 15-mer peptid, i nærvær av C1R. QA-1b celler. 2) er mellom 8 - 10-mer (9-mer peptid foretrukket) som er peptid lengder bundet til MHC-jeg molekyler15,17. Se Representant resultater i figur 5.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Design OLP bibliotek dekker hele lengden av et protein

    Begynnelsen på N-terminus et protein, er hver peptid 15 aminosyrer (15-mer). Derfor, den første peptid spenner posisjon 1 til posisjonen 15. N-terminus av den andre peptid overlapper med C-terminus av den første peptid av 11 aminosyrer. Derfor, den andre peptid spenner posisjon 5 posisjon 19. Utforme resten av peptider til slutten av C-terminus av protein (figur 1). Vi valgte 15-mer biblioteket fordi vi og andre har vist at 15-mer peptider, da legges inn dendrittiske celler (DCs) eller makrofager, kan være effektivt behandles i epitopes for anerkjennelse av CD8+ T celler14,15. Antall OLPs i et bibliotek, avhengig av lengden på et protein. I tillegg kan til siste OLP variere fra 12 til 15-mer avhengig av lengden av protein. For eksempel har myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG) en lengde på 247 aminosyrer. MOG OLP biblioteket inneholder 59 OLPs12. Representant resultatene presentert i dette manuskriptet er fra analysen av MOG OLP biblioteket.

    Fastsettelse av OLP_pool-spesifikke, Qa-1-begrenset respons i en OLP_pool-stimulert CD8+ T celle linje

    Vi generert en CD8+ T celle linje som ble primet med Kb-/-Db-/- DCs pulserende med MOG OLP_pool (MOG_pool) og restimulated av MOG_pool-pulsed Kb-/-Db-/- peritoneal makrofager som beskrevet i det nevnte protocol (protokoll 1, 2 og 3). Å finne potensielle MOG_pool-spesifikke, Qa-1-begrenset respons i denne CD8+ T celle linje, undersøkte vi responsen av denne CD8+ T celle linje til MOG_pool i nærvær av enten C1R eller C1R. QA-1b celler ved hjelp av IFN-γ ELISPOT analysen (figur 2) (Protocol trinn 4). Våre data viste at den MOG_pool-stimulert CD8+ T celle linje utskilles lave IFN-γ i nærvær av C1R. QA-1b celler (32 Spot danner celler eller SFCs), men ikke C1R celler (2 SFCs), tyder tilstedeværelsen av CD8+ T celler som svart Qa-1-bindende epitopes fra C1R celler (C1R celler er B lymphoblastoid menneskeceller). SFCs økte da MOG_pool ble lagt inn i brønnen som inneholdt C1R celler (78 SFCs), tyder tilstedeværelsen av CD8+ T celler som svart ikke-KS-1 epitopes. SFCs økte dramatisk da MOG_pool ble lagt inn i brønnen som inneholdt C1R. QA-1b celler (320 SFCs), tyder tilstedeværelsen av CD8+ T celler som svart Qa-1-bindende peptider. Dataene viser også at MOG_pool inneholder Qa-1-bindende epitope(s).

    Vilje av individuelle peptider i OLP_pool som bidrar til Qa-1-begrenset IFN-γ utskillelsen i en OLP_pool-reaktive CD8+ T celle linje

    Å bestemme peptider i OLP_pool som stimulerte Qa-1-begrenset IFN-γ utskillelsen i en MOG_pool-reaktive CD8+ T celle linje, vi stimulert av MOG_pool-reaktive CD8+ T celler med personlige 59 OLPs i nærvær av enten C1R eller C1R. QA-1b celler (Figur 3) (Protocol trinn 5). Våre data viste at noen SFCs ble observert i brønnene som inneholdt C1R celler og OLPs. Derimot økte SFCs i alle brønnene som inneholdt C1R. QA-1b celler og OLPs. Fra figur 2, vi lært at CD8+ T celler i nærvær av C1R. QA-1b alene også dannet SFCs. Derfor kan de økte SFCs i de fleste brønner skyldes ikke-spesifikk stimulering som følge av presentasjonen av Qa-1 epitopes avledet fra intracellulær proteiner i C1R celler av Qa-1 molekyler. Men OLPs i 3 innrammet brønnene i Figur 3 c (B8, D12 og E9), som matchet 3 markert OLPs i figur 3A (OLP68, OLP96 og OLP105), møtte kriteriet for å definere et OLP-spesifikke, Qa-1-begrenset IFN-γ svar som beskrevet i protokollen trinn 5.112. Data tyder på at de 3 OLPs inneholder Qa-1 epitope(s). Siden OLP105 produsert konsekvent høyeste svaret, utført vi detaljert analyse av OLP10512.

    Utformingen av en avkortet peptid bibliotek for en 15-mer OLP

    En 15-mer OLP, som har blitt bestemt å stimulere Qa-1-begrenset IFN-γ sekresjon i OLP_pool-reaktive CD8+ T celle linje, må analyseres for den optimale epitope bruker en avkortet peptid-biblioteket. Slike avkortet peptid-biblioteket er utformet ved å avkorte gradvis 15-mer OLP av 1 aminosyre i sin N - og C-termini (Figur 4). Ligner andre MHC klasse I molekyler, Qa-1 molekyler binde hovedsakelig til 8 - 10-mer peptider. Vi anbefaler derfor at den korteste avkortet peptid er 6-mer i lengden.

    Identifikasjon av den optimale Qa-1 epitope i en 15-mer OLP som stimulerer Qa-1-begrenset IFN-γ sekresjon i en OLP_pool-reaktive CD8+ T celle linje

    Over N - og C-terminalt avkortet peptidene er testet for styrken i stimulerende IFN-γ sekresjon i en CD8+ T celle linje bestemte for OLP_pool eller den 15-mer OLP bruker IFN-γ ELISPOT beskrevet ovenfor. I studiet av Qa-1 epitopes MOG12, vi generert en CD8+ T celle linje som var bestemt for MOG OLP105 (figur 5A). Videre analyse viste at det N-terminalt avkortet 9-mer peptid møtte to kriteriene for en optimal epitope som beskrevet i protokollen trinn 6.2 (figur 5B). Derfor vi konkluderte med at N-terminalt avkortet 9-mer peptid var den optimale Qa-1 epitope.

    Figure 1
    Figur 1: Design OLP bibliotek dekker hele lengden av et protein. Begynnelsen på N-terminus, ble peptider 15 aminosyre (15-mer) lengde identifisert.N-terminus av hver peptid, unntatt den første peptid, overlappet C-terminus av den forrige peptid av 11 aminosyrer.

    Figure 2
    Figur 2: MOG_pool-stimulert CD8+ T celler ble delvis MOG_pool bestemt og Qa-1-begrenset12. In vitro CD8+ T celler stimulert av MOG OLP_pool (MOG_pool) ble undersøkt for respons til MOG_pool i nærvær av enten C1R eller C1R. QA-1b celler som antigen presentere celler ved hjelp av IFN-γ ELISPOT analysen. Representant ELISPOT bilder vises. Antall spot-forming celler (SFCs) vises i øvre venstre hjørnene i hver brønn. CD8+ T celler: 50 000 celler/godt. C1R eller C1R. QA-1b celler: 200 000 celler/godt.

    Figure 3
    Figur 3: analyse av OLPs i MOG_pool som var ansvarlig for Qa-1 begrenset respons. (A) oppsett av V-bunn 96-brønns plate som inneholdt 10 mg/mL personlige MOG OLPs. Tall i brønnene representert OLP IDer. Uthevede 3 brønnene inneholdt OLPs møtte kriteriet for en OLP-spesifikke, Qa-1-begrenset IFN-γ respons som beskrevet i protokollen trinn 5.112. (B) representant SFCs i hver brønn som inneholdt en OLP (siste konsentrasjon = 4,2 μg/mL, maritime ID matchet i "A"), den MOG_pool-reaktive CD8+ T celler (50 000 celler/vel), og C1R celler (200 000 celler/vel). (C) representant SFCs i hver brønn som inneholdt en OLP (siste konsentrasjon = 4,2 μg/mL, maritime ID matchet i "A"), den MOG_pool-reaktive CD8+ T celler (50 000 celler/vel) og C1R. QA-1b celler (200 000 celler/vel). 3 innrammet brønnene inneholdt OLPs møtte kriteriet for en OLP-spesifikke, Qa-1-begrenset IFN-γ svar12. Figuren er tilpasset referanse12Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 4
    Figur 4: Design av avkortet peptider i et 15-mer peptid. En 15-mer peptid ble gradvis avkortet i sin N - og C-termini av 1 aminosyre til 6-mer. 15-mer og dens avkortet peptider ble deretter syntetisert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 5
    Figur 5: analyse av den optimale Qa-1 epitope i OLP105. (A) en OLP105-stimulert CD8+ T celle linje ble undersøkt for respons til OLP68, OLP96 og OLP105 i nærvær av C1R eller C1R. QA-1b celler ved hjelp av IFN-γ ELISPOT analysen. Representant IFN-γ SFCs (tall i øvre venstre hjørnene) vises. (B) OLP105-spesifikke CD8+ T celle linje, som vist i (A), ble undersøkt for respons til de personlige N - og C-terminalt avkortet peptidene, som vist i Figur 4, i nærvær av C1R. QA-1b celler ved hjelp av IFN-γ ELISPOT analysen. OLP105: en 15-mer OLP. N6-14: N-terminalt avkortet OLP105 peptider. C6-14: C-terminalt avkortet OLP105 peptider. CD8+ T celler: 50 000 celler/godt. C1R. QA-1b celler: 200 000 celler/godt. Tall på øvre venstre hjørnene var SFCs per 50.000 CD8+ T celler. Rød rektangel merket brønnen som møtte kriterier for å definere den optimale Qa-1 epitope i en OLP som beskrevet i protokollen trinn 6.2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Her har vi beskrev en protokoll for å analysere Qa-1 epitopes i et protein. I forhold til denne protokollen rapportert flere andre strategier også tidligere. Første, fører allogene CD8+ T cellelinjer og kloner ble brukt til å identifisere den Qdm1. Andre ble en antatte Qa-1-bindende motiv fra analyse av Qdm brukt for identifisering av HSP60p216-224 og en TCRBV8.1 epitope9,18. Tredje, individuelle overlappende peptider fra et protein ble brukt Immunize dyr. Deretter CD8+ T celler isolert fra vaksineres dyrene ble brukt til å identifisere den TCRBV8.2 peptid p42-50 senere bekreftet for binding til Qa-16,10,19. Fjerde, funksjonelle CD8+ T celle linjer i kombinasjon med cDNA vise biblioteket ble brukt til å identifisere FL9 Qa-1 epitope4.

    Referanse til de tidligere teknikkene, bruk av allogene CD8+ T celle linjer og kloner kan ikke være egnet for å analysere Qa-1 epitopes presenteres under fysiologiske immunreaksjoner. I tillegg tyder samler data på at tidligere beskrevet bindende motivet kan bare delvis representerer peptid-innbindingen behandlingskapasitet av Qa-1 molekyler. Derfor er nøyaktig Qa-1-bindende motivet fortsatt ikke kjent4. Videre er immunisering med personlige peptid for identifikasjon av Qa-1 epitopes arbeidskrevende. Endelig innebærer cDNA vise biblioteket strategi bygging av mange vektorer som bærer ulike peptid lengder for cellen transfection. Derimot OLP biblioteket strategi beskrevet her er enkel, og de tilordnede peptidene er kjent for å stimulere Qa-1-begrenset CD8+ T celler. Derfor har vår strategi en unik fordel.

    Strategien beskrevet her bruker OLP_pool-spesifikke CD8+ T celler som er generert av i vitro grunning og restimulation. En alternativ kilde for CD8+ T celler kan være fra drenering lymfeknuter en kb-/-Db-/- mus som er vaksinert med kilde protein20. Slike immun CD8+ T celler kan deretter gi IFN-γ Svar å OLPs og avkortede peptider for identifikasjon av Qa-1 epitopes. Teoretisk sett den i vivo immun CD8+ T celler er nærmere fysiologisk tilstand enn den i vitro generert CD8+ T celler. Vi fant imidlertid at responsen av immun CD8+ T celler direkte renset fra vaksineres mus var svak og ofte krever i vitro restimulations for et tilfredsstillende peptid screening resultatet. I tillegg er denne protokollen utformet for fremtidige oversettelse til menneske studie av HLA-E epitopes der i vivo immunisering ikke er praktisk.

    Teknisk, den kritiske delen av denne protokollen er generasjon av CD8+ T cellen linjer som er spesifikke for OLP_pool eller en individuell OLP. Siden Qa-1/peptid komplekser er ustabile forhold til klassisk MHC-jeg/peptid komplekser21, etter antigen presentere celler er pulserende med OLPs eller et peptid, skal pulserende cellene ikke vaskes grundig. Vi har funnet at peptid-pulsed celler, hvis vaskes grundig, mister eller redusere evnen til å stimulere CD8+ T celler. Derfor anbefaler vi vaske peptid-pulsed antigen presentere celler når umiddelbart før de er co kulturperler med CD8+ T celler.

    Også, på grunn av ustabilitet i Qa-1/peptid komplekser, anbefaler vi bruk av en serum-free medium for den peptid pulserende og stimulering av CD8+ T celler. I tillegg vi rutinemessig legge 50 U/mL av IL-7 i CD8+ T celle kultur, samt under IFN-γ ELISPOT analysen. Formålet av IL-7 er å opprettholde levedyktighet og funksjon av CD8+ T celler. IL-7 selv stimulerer ikke CD8+ T celler til å produsere IFN-γ.

    I likhet med alle strategier, Qa-1 epitopes tilordnet av denne strategien også krever videre etterforskning for biologisk betydning. For eksempel er en viktig spørsmål om den tilordnede epitope fysiologisk kan presenteres. For å løse dette spørsmålet, kan DCs være transduced med en lentiviral vektor som uttrykker epitope kilde protein (f.eks MOG i MOG OLP studie). Deretter svar epitope-spesifikke CD8+ T celler transduced DCs undersøkes. En positiv respons antyder at epitope kan fysiologisk behandles og presentert av DCs. I tillegg, funksjonelle konsekvensene som følge av epitope anerkjennelse av CD8+ T celler bør utredes videre. I denne forbindelse, har analyser av Qdm og FL9 Qa-1 epitopes ført til konklusjonen at Qa-1 molekyler er viktig for immun overvåking1,4. I tillegg til studier av HSP60p216, TCRBV8.1 peptid, og den p42-50 har ført til konklusjonen at Qa-1-begrenset CD8+ T celler regulere immunreaksjoner gjennom målretting patogene CD4+ T celler 6,7 ,9,19. Videre studier av MOG196 har for første gang avslørte at Qa-1-begrenset CD8+ T celler kan regulere immunreaksjoner ved direkte målrettet mot en vev for å hindre skade av potensielt patogene autoimmune celler12 . Til slutt, funksjonell analyse av en epitope-spesifikke, Qa-1-begrenset CD8+ T celle kan bli assistert av tetramer. Slike tetramer kan produseres i NIH tetramer kjernen anlegg (http://tetramer.yerkes.emory.edu/) eller et firma. For å be om opprettelse av et tetramer, kan sende funksjonelle data som støtter binding av den nylig tilordnede optimal Qa-1 epitope Qa-1 protein for godkjenning for generering av en Qa-1 tetramer.

    Avslutningsvis tidligere studier har vist at Qa-1-begrenset CD8+ T celler spiller en viktig rolle i regulering av lokale immunreaksjoner12. I denne forbindelse kan vev skader være forårsaket av en immunrespons direkte mål vevet. I tillegg kan collateral skader være forårsaket av en immunrespons som er rettet mot en invaderende patogene. Derfor forståelsen av Qa-1-begrenset CD8+ T celler i disse to ulike vev skader er viktig for deres kliniske applikasjoner.For å oppnå dette målet, er en grundig analyse av Qa-1 epitopes i en selv-vev eller en invaderende patogene nødvendig. Denne protokollen vil være egnet for disse analysene.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne erklære noen interessekonflikt.

    Acknowledgements

    Vi takker Penelope Garcia for hennes teknisk assistanse og forberedelsene til denne oppgaven. Dette arbeidet ble støttet av en forskning innovasjon Grant (RIGG) fra Institutt for indremedisin ved Loma Linda University (681205-2967) og pilot stipend fra nasjonal multippel sklerose samfunnet (PP1685) til XT.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    The protein to be analyzed N/A N/A Sequence of the protein can be obtained from NCBI
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Cat#: D2650 SIGMA DMSO should be sterile and cell culture tested.
    Kb-/-Db-/- mice The Lackson Laboratory Stock#: 019995 We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
    AIM V Serum Free Medium ThermoFisher Scientific Cat#: 12055091
    2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
    Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
    Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
    Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit ThermoFisher Scientific Cat#: 11333D
    Bio-Gel P-100 Bio-Rad Cat#: 150-4171
    Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
    Trasfer pipette Globe Scientific Mfg#: 137238
    Murine M-CSF PeproTech Cat#: 315-02
    48-well tissue culture plates USA Scientific Cat#: CC7682-7548
    Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom Sigma-Aldrich Cat#: Z372129 Sigma
    1ml deep 06-well PP plate, sterile USA Scientific Item#: 1896-1110
    Recombinant murine IL-2 PeproTech Cat#: 212-12
    Recombinant murine IL-7 PeproTech Cat#L: 217-17
    Capture anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    ELISPOT plate Sigma-Aldrich Cat#: S2EM004M99
    C1R ATCC Cat#: ATCC CRL-1993
    C1R.Qa-1b Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
    Qa-1 lentiviral vector GeneCopoeia Product#: Mm02955
    Detection anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    Tween20 Sigma-Aldrich Cat#: P9416
    Streptavidin-HRP BD Biosciences Cat#: BD557630
    AEC substrate BD Biosciences Cat#: 551951
    ImmunoSpot Analyzer ImmunoSpot Any immunoSpot analyer should work for this purpose.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79, (4), 649-658 (1994).
    2. Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188, (10), 1841-1848 (1998).
    3. Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207, (1), 207-221 (2010).
    4. Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13, (6), 579-586 (2012).
    5. Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5, (5), 516-523 (2004).
    6. Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177, (11), 7645-7655 (2006).
    7. Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123, (3), 1382-1389 (2013).
    8. Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (2), 534-539 (2009).
    9. Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113, (8), 1218-1224 (2004).
    10. Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178, (10), 6043-6050 (2007).
    11. Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (52), 21089-21094 (2013).
    12. Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
    13. Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72, (5), 2843-2849 (2004).
    14. Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8, (3), e59210 (2013).
    15. Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350, (6320), 703-706 (1991).
    16. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. Chapter 14, Unit 14, 11 (2008).
    17. Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360, (6402), 364-366 (1992).
    18. Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3, (14-15), 1249-1259 (2001).
    19. Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182, (11), 6959-6968 (2009).
    20. Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
    21. Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172, (3), 1661-1669 (2004).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics