Extracellular मैट्रिक्स की ओर मानव कार्डियक ऊतक के प्रसंस्करण स्व-कोडांतरण Hydrogel के लिए इन विट्रो में और Vivo में अनुप्रयोगों

Developmental Biology

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Summary

यह प्रोटोकॉल अपने extracellular मैट्रिक्स घटकों के संरक्षण के दौरान मानव मायोकार्डियम की पूरी decellularization का वर्णन करता है । आगे की प्रोसेसिंग extracellular मैट्रिक्स microparticles के उत्पादन में परिणाम और एक cytoprotective स्व-कोडांतरण hydrogel ।

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Becker, M., Maring, J. A., Oberwallner, B., Kappler, B., Klein, O., Falk, V., Stamm, C. Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications. J. Vis. Exp. (130), e56419, doi:10.3791/56419 (2017).

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Abstract

Acellular extracellular मैट्रिक्स तैयारी सेल-मैट्रिक्स बातचीत का अध्ययन करने और reअपक्षय सेल थेरेपी अनुप्रयोगों की सुविधा के लिए उपयोगी होते हैं । कई वाणिज्यिक extracellular मैट्रिक्स उत्पाद hydrogels या झिल्ली के रूप में उपलब्ध हैं, लेकिन इन ऊतक विशिष्ट जैविक गतिविधि के अधिकारी नहीं है । क्योंकि छिड़काव decellularization मानव हृदय ऊतक के साथ आम तौर पर संभव नहीं है, हम एक 3 कदम विसर्जन decellularization प्रक्रिया विकसित की है । मानव रोधगलन सर्जरी के दौरान खरीद के पहले डिटर्जेंट के साथ इलाज कर रहे है मुक्त hyperosmolar lysis बफर, ईओण डिटर्जेंट, सोडियम dodecyl सल्फेट के साथ गर्मी के बाद, और इस प्रक्रिया के आंतरिक DNase गतिविधि का दोहन द्वारा पूरा हो गया है भ्रूण गोजातीय सीरम । इस तकनीक के सेल में परिणाम-कार्डियक extracellular मैट्रिक्स के मुक्त चादरें मोटे तौर पर संरक्षित रेशेदार ऊतक वास्तुकला और पॉलिमर संरचना है, जो कार्डियक सेल आबादी और pluripotent स्टेम करने के लिए विशिष्ट पर्यावरणीय cues प्रदान करने के लिए दिखाए गए के साथ कोशिकाओं. कार्डिएक extracellular मैट्रिक्स चादरें तो आगे रासायनिक संशोधन के बिना एक microparticle पाउडर में संसाधित किया जा सकता है, या, अल्पकालिक पेप्सिन पाचन के माध्यम से, एक आत्म में संरक्षित के साथ कार्डियक extracellular मैट्रिक्स hydrogel कोडांतरण ।

Introduction

extracellular मैट्रिक्स (ECM) न केवल संरचनात्मक समर्थन प्रदान करता है, लेकिन जीवविज्ञान सेल और ऊतक समारोह के लिए भी महत्वपूर्ण है1. दिल में, ECM फाइब्रोसिस, सूजन, angiogenesis, cardiomyocyte सिकुड़ा समारोह और व्यवहार्यता के रूप में pathophysiologic प्रतिक्रियाओं के विनियमन में भाग लेता है, और निवासी जनक सेल भाग्य । रेशेदार नच, glycosaminoglycans, और proteoglycans-इसके प्राथमिक घटकों के अलावा-यह स्रावित विकास कारकों, साइटोकिंस, और झिल्लीदार बुलबुले युक्त न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन2,3के एक मेजबान शामिल हैं ।

यह हाल ही में स्पष्ट हो गया है कि acellular ECM तैयारी केवल सेल मैट्रिक्स बातचीत का अध्ययन करने के लिए अमूल्य नहीं हैं, लेकिन यह भी संभावित चिकित्सीय कोशिका आधारित अनुप्रयोगों के लिए । चिकित्सकीय सेल उत्पादों या इंजीनियर ऊतकों के लिए एक पर्याप्त वातावरण प्रदान करने के महत्व को अब व्यापक रूप से स्वीकार किया है । प्रयत्न सेल सस्पेंशन या सक्रिय यौगिकों के साथ परिभाषित किया गया है के साथ मिश्रित पॉलिमर hydrogels4,5,6 या प्रोटीन कॉकटेल के साथ murine सार्कोमा कोशिकाओं (यानी, Matrigel, Geltrex द्वारा स्रावित) 7. हालांकि, पूर्व सीमित है, गैर गतिविधि है, बाद जीएमपी में समस्याग्रस्त ग्रेड प्रक्रियाओं रहे हैं, और दोनों के ऊतकों की कमी-कार्डियक ECM (cECM) के विशिष्ट की गैर-गतिविधि है,8,9,10, 11,12,13.

मायोकार्डियम के Decellularization पहले कोरोनरी vasculature14,15के माध्यम से पूरे दिल के छिड़काव द्वारा प्रदर्शन किया गया है । हालांकि यह जानवर दिलों में संभव है, बरकरार मानव दिल शायद ही कभी उपलब्ध हैं । इसलिए, एक विसर्जन प्रक्रिया है कि ऊतक ऑपरेटिंग कमरे में प्राप्त नमूनों से निपटने के लिए अनुमति देता है इष्ट था । हमारे "3 कदम" प्रोटोकॉल अर्थात् lysis, solubilization, और डीएनए हटाने 3 अलग मशीन कदम शामिल हैं । यह काफी हद तक संरक्षित प्रोटीन और glycosaminoglycan संरचना16,17के साथ मानव रोधगलन ECM पैदावार । इन cECM स्लाइसें सेल-मैट्रिक्स बातचीत के इन विट्रो अध्ययनों में के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन खराब संभावित मानव पैमाने चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं । विनिर्माण प्रक्रिया तो lyophilized cECM microparticles या एक cECM hydrogel18उत्पादन के लिए बढ़ाया गया था ।

इस प्रोटोकॉल मानव मायोकार्डियम शल्य चिकित्सा नमूनों से प्राप्त की decellularization के लिए अनुमति देता है, रोधगलन extracellular मैट्रिक्स (ECM) और उनके जीवविज्ञान गतिविधि के प्रमुख घटकों के संरक्षण । इस प्रोटोकॉल की सिफारिश की जाती है जब मानव कार्डियक ECM संरक्षित ऊतक के साथ-विशिष्ट गैर-गतिविधि कोशिका-मैट्रिक्स बातचीत के प्रायोगिक अध्ययन के लिए आवश्यक है, या जब एक उपयुक्त वातावरण सेल आधारित रोधगलन के दृष्टिकोण के लिए आवश्यक है. सिद्धांत रूप में, यह भी जीएमपी ग्रेड शर्तों के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलन संभव है, ताकि प्रोसेस्ड cECM का उपयोग भविष्य चिकित्सीय अनुप्रयोगों में संभव होना चाहिए ।

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Protocol

अध्ययन प्रोटोकॉल हेलसिंकी की घोषणा में उल्लिखित नैतिक सिद्धांतों के अनुरूप है और Charité चिकित्सा विश्वविद्यालय की संस्थागत समीक्षा बोर्ड और आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था. सभी रोगियों प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए दिल के ऊतकों के उपयोग के लिए लिखित, सूचित सहमति प्रदान की है ।

1. मानव मायोकार्डियम को प्रखण्डित करने की तैयारी

  1. बाएँ वेंट्रिकुलर मायोकार्डियम प्राप्त करें (आकार शल्य चिकित्सा के प्रकार पर निर्भर करता है) सीधे ऑपरेटिंग कमरे से और एक बाँझ कंटेनर में ठंडे पंजाब में परिवहन.
  2. बाँझ शर्तों के तहत एक नहीं 10 ब्लेड के साथ एक बाँझ स्केलपेल के साथ सभी वसा ऊतक निकालें ।
  3. लगभग 1 x 1 x 1 सेमी एक स्केलपेल का उपयोग कर के क्यूब्स में मायोकार्डियम काटें ।
  4. बाँझ ५० मिलीलीटर ट्यूबों में cubes प्लेस ।
    नोट: रोकें करने के लिए, चरण १.५, अंयथा चरण २.२ के साथ जारी रखें । प्रोटीन क्षरण और ऊतक की गुणवत्ता में कमी को रोकने के लिए दोहराया फ्रीज-गल चक्र से बचें ।
  5. -८० डिग्री सेल्सियस पर cubes युक्त ट्यूबों की दुकान । ऊतक कई महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।

2. स्लाइस में मायोकार्डियम क्यूब्स की धारा

  1. फ्रीजर से बाहर तैयार cubes युक्त ट्यूब (ओं) ले लो ।
  2. cryostat के लिए बर्फ पर परिवहन ।
  3. -15 डिग्री सेल्सियस के लिए वस्तु और चैंबर तापमान निर्धारित करें ।
    नोट: सही तापमान सही अनुभाग की गारंटी के लिए महत्वपूर्ण है ।
  4. चिल खाली ५० मिलीलीटर ट्यूबों और टिकटों चैंबर में या सूखी बर्फ पर ।
  5. एक परत जोड़ें (लगभग ०.५-१.० एमएल) cryosection मध्यम के शीत स्टांप पर और इसे स्थिर जब तक यह सफेद और ठोस है ।
  6. cryosection मीडियम की दूसरी लेयर डालें और इस लेयर पर एक मायोकार्डियम क्यूब लगाएं ।
  7. सुनिश्चित करें कि cryosection मध्यम और मायोकार्डियम आप जारी रखने से पहले पूरी तरह से जमे हुए हैं ।
    नोट: जब नमूना और cryosection माध्यम जमी नहीं है अनुभाग बिगड़ जाएगा । पूरी तरह से जमे हुए cryosection मध्यम तरल पदार्थ से बदल जाता है और ठोस, सफेद, और गैर पारदर्शी करने के लिए पारदर्शी । रोधगलन से कम 30 मिनट की जरूरत है 1 करने के लिए पूरी तरह से फ्रीज अगर कदम से तुरंत जारी १.४ । जब ऊतक जम गया है यह ख़राब नहीं जब छुआ/
  8. धारक में जमे हुए मायोकार्डियम के साथ स्टांप डालें और सभी शिकंजा कस ।
  9. एक भी अनुभागीय सतह प्राप्त की है जब तक ऊतक की सतह ट्रिम कर दीजिए ।
  10. ३०० µm को खोदी मोटाई सेट करें ।
  11. धारा जम मायोकार्डियम साथ स्वत: खोदी । यह गारंटी वर्दी कट वर्गों । लगभग 30-40 वर्गों एक घन से कटा हुआ जा सकता है ।
  12. प्रत्येक स्लाइस को एक शानदार ५० एमएल ट्यूब में लचर खोदी जाने के बाद रखें ।
    नोट: स्लाइस दबाने या कसकर पैक न करें. लगभग ४० स्लाइस एक ट्यूब में फिट कर सकते हैं ।
  13. भरा ट्यूबों और बर्फ पर जगह बंद करो ।
    नोट: चरण २.१४, अंयथा चरण ३.२ के साथ जारी रखने के साथ पर जाएं को रोकने के लिए ।
  14. -८० डिग्री सेल्सियस पर मायोकार्डियम स्लाइस स्टोर । स्लाइस कई महीनों के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।

3. मानव मायोकार्डियम स्लाइस की Decellularization

  1. ५० मिलीलीटर ट्यूब की आवश्यक संख्या से बाहर मायोकार्डियम वर्गों युक्त लो-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर और बर्फ पर परिवहन ।
  2. एक बाँझ चोंच में कदम ३.१ से सभी ५० मिलीलीटर ट्यूबों के जमे हुए वर्गों स्थानांतरण । लगभग ४० स्लाइस को ५० एमएल ट्यूब प्रति यूरिन में जोड़ा जाता है । चोंच में तीन बार ५० मिलीलीटर ट्यूबों की मात्रा होनी चाहिए; उदाहरण के लिए, १ ५० मिलीलीटर ट्यूब के decellularization के लिए एक १५० मिलीलीटर चोंच का उपयोग करें ।
  3. जोड़ें ५० मिलीलीटर lysis समाधान (10 मिमी Tris, ०.१% डब्ल्यू/वी EDTA, पीएच ७.४ में एच2O) प्रति ५० मिलीलीटर ट्यूब मायोकार्डियम स्लाइस के साथ ।
  4. एक बाँझ चोंच में मायोकार्डियम स्लाइसें १००-१५० rpm में लगातार 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हिला ।
  5. एक मोटे छलनी के माध्यम से ऊतक स्लाइस के साथ तरल तनाव । एक नया बाँझ चोंच के लिए एक कुंद नोचना के साथ ऊतक स्लाइस स्थानांतरण. मायोकार्डियम स्लाइस की प्रारंभिक ५० मिलीलीटर ट्यूब में ०.५% एसडीएस की ५० मिलीलीटर जोड़ें (उदा., १०० ml एसडीएस सॉल्यूशन का उपयोग करें जब २ ५० एमएल ट्यूब्स की रोधगलन की जा रही हैं) ।
  6. कमरे के तापमान पर १००-१५० rpm पर 6 घंटे के लिए लगातार हिला ।
  7. एक मोटे छलनी के माध्यम से ऊतक स्लाइस के साथ तरल तनाव । एक नया बाँझ चोंच के लिए एक कुंद नोचना के साथ ऊतक स्लाइस स्थानांतरण और 10 मिनट के लिए ५० मिलीलीटर पंजाबियों के साथ 3 बार धो जबकि १५० rpm पर मिलाते हुए । अगले, 1% पेनिसिलिन/Streptomycin और 1% Nystatin (पंजाब-पी/एस-एन) 100-150 rpm पर और 4 डिग्री सेल्सियस जबकि मिलाते हुए पंजाब में रातोंरात धो लें ।
    ध्यान दें: पूरी तरह से धोने के लिए महत्वपूर्ण है किसी भी अवशिष्ट एसडीएस हटा दें । एसडीएस के शेष निशान विषाक्त जब ECM कोशिकाओं के साथ संयोजन में प्रयोग किया जाता है ।
  8. वॉशिंग सॉल्यूशन निकालें और 1% पेनिसिलिन/Streptomycin के साथ 25 मिलीलीटर कचौरी FBS (३७ डिग्री सेल्सियस) जोड़ें और मायोकार्डियम स्लाइस के आरंभिक ५० एमएल ट्यूब के अनुसार 1% Nystatin ।
  9. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए मशीन । इस चरण में, किसी भी शेष डीएनए FBS के आंतरिक DNase गतिविधि के कारण मैट्रिक्स से हटा दिया जाता है ।
  10. एक नया बाँझ चोंच करने के लिए स्लाइस हस्तांतरण और 10 मिनट के लिए ५० मिलीलीटर पंजाबियों के साथ 3 बार धो जबकि १५० rpm पर मिलाते हुए ।
    नोट: ECM स्लाइसें कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पंजाब-पी/एस-एन में संग्रहित किया जा सकता है । हालांकि, इसे तुरंत आगे बढ़ने की सिफारिश की गई है ।

4. एक पाउडर के लिए सेलुलर cECM प्रसंस्करण

  1. एक नए बाँझ 6-अच्छी तरह से थाली में ECM स्लाइसें शिथिल रखें. एक lyophilizer में 2 दिनों के लिए-८० डिग्री सेल्सियस और lyophilize पर ECM फ्रीज ।
    नोट: एक से अधिक स्लाइस प्रति अच्छी तरह से रखा जा सकता है । अच्छी तरह से सतह को पूरी तरह कवर करने के लिए स्लाइस व्यवस्थित करें । अतिव्यापी स्लाइसें बाद में चूर सफलता को प्रभावित नहीं करता है ।
  2. ECM टुकड़ा के चूर्णन के लिए, विशिष्ट मिलिंग ट्यूबों का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) १.४ mm सिरेमिक मोती युक्त । lyophilized ECM बाँझ कुंद चिमटी का उपयोग कर के साथ शिथिल ट्यूबों भरें । इष्टतम परिणामों के लिए, 10-20 मिलीग्राम के बीच ECM की कुल वजन की सिफारिश की है ।
    नोट: यदि ECM मिलिंग ट्यूब में भी कसकर पैक किया जाता है तो चूर करने की प्रक्रिया नकारात्मक रूप से प्रभावित होगी ।
  3. स्नैप-फ्रीज ट्यूब तरल नाइट्रोजन में ।
    सावधानी: तरल नाइट्रोजन अत्यंत कम तापमान है, उपयुक्त व्यक्तिगत संरक्षण पहनते हैं ।
  4. मिलिंग मशीन में जमे हुए ट्यूबों डालें और ECM को चूर करें ।
    1. 30 एस की एक अवधि और एक अधिकतम गति सेट और डिवाइस शुरू करते हैं ।
    2. परिष्करण के बाद, बाहर ट्यूबों और स्नैप-फ्रीज फिर से तरल नाइट्रोजन में ले ।
    3. पांच बार दोहराएं ।
  5. ट्यूब से microparticles 1 मिलीलीटर ddH2ओ जोड़ने और शेक या पूर्ण solubilizing के लिए भंवर से धो लो । एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में एक २०० µm जाल के माध्यम से विषम समाधान फ़िल्टर ।
  6. -८० ° c या तरल नाइट्रोजन में ट्यूब फ्रीज ।
  7. एक ०.२२ µm फिल्टर के साथ ट्यूब के मानक ढक्कन बदलें । इस फिल्टर ढक्कन पाउडर ट्यूब से बाहर बहने से रोकता है लेकिन पानी वाष्पीकरण के लिए हवा परिसंचरण की अनुमति देता है ।
  8. lyophilizer में ट्यूबों डालें और lyophilize चरण से पानी निकालने के लिए फिर से (चरण ४.५)
    नोट: इस चरण में Lyophilization पर 3 दिन का समय लग सकता है ।
  9. स्टोर पाउडर पर-८० ° c आगे की प्रक्रिया तक या ५.१ चरण के साथ जारी रखें ।

५. cECM सूक्ष्म कणों का एंजाइम आधारित अनुमन्य

  1. 0.01 एम एचसीएल (pH २.०) में सुअर पेप्सिन को भंग कर 1 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता के लिए । कमरे के तापमान पर एक रोटरी शेखर पर प्लेस जब तक यह पूरी तरह से घुल गया है ।
  2. lyophilized मानव ECM पाउडर (चरण ४.८) पेप्सिन समाधान में एक अंतिम एकाग्रता के लिए भंग 10 मिलीग्राम/एमएल । pipetting के माध्यम से अच्छी तरह मिलाएं । कुल मात्रा ECM समाधान की मात्रा पर निर्भर करता है की जरूरत है । उदाहरण के लिए, 1 मिलीलीटर पेप्सिन समाधान में ECM पाउडर के 10 मिलीग्राम भंग ।
    नोट: भंग कणों कोमल भंवर (१,०००-१,५०० RPM) के माध्यम से समर्थित किया जा सकता है । microparticles की शेष गांठ से पाचन पर नकारात्मक प्रभाव पड़ेगा ।
  3. 2 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए एक ट्यूब प्रति 1 मिलीलीटर की मात्रा के साथ समाधान स्थानांतरण ।
  4. 27 डिग्री सेल्सियस और १,२०० rpm पर ४८ ज के लिए एक ट्यूब शेखर में ट्यूबों प्लेस ।
  5. बाहर के बरतन और बर्फ या एक पूर्व ठंडा ट्यूब धारक पर जगह के ट्यूबों लो ।
  6. ठंडा 10x पंजाबियों (पीएच ७.४) के ECM समाधान की मात्रा का मिश्रण 1/9 ठंड 0.1 m NaOH के ECM समाधान की मात्रा के साथ एक ठंडा ट्यूब और बर्फ पर जगह में । यह मिश्रण पच ECM हल को बेअसर कर देगा और अचल को निष्क्रिय कर पेप्सिन ।
  7. बेअसर मिश्रण करने के लिए ECM समाधान जोड़ें और pipetting या भंवर के माध्यम से अच्छी तरह से मिश्रण ।
  8. 1x पंजाबियों (पीएच ७.४) के साथ वांछित एकाग्रता के लिए ECM सेट करें । समाधान का पीएच पीएच कागज के साथ जांच की जा सकती है ।
    नोट: 10 मिलीलीटर पचता ECM समाधान के लिए उदाहरण परिकलन:
    10 एमएल एचसीएल (pH २.०) में १० मिलीग्राम सुअर पेप्सिन डालें ।
    जोड़ें १०० मिलीग्राम ECM पाउडर पेप्सिन समाधान के लिए ।
    नोट: 10 मिलीलीटर पचता ECM समाधान को निष्क्रिय करने और 8 मिलीग्राम/एमएल के लिए एकाग्रता की स्थापना के लिए उदाहरण गणना:
    volअंतिम = cप्रारंभ x volप्रारंभ /cअंतिम = 10 मिलीग्राम/एमएल x 10 एमएल/
    vol10xPBS = volstart /9 = 1/9 से 10 मिलीलीटर = १.११ मिलीलीटर 10x पंजाब
    volNaOH = volstart /10 = 1/10 से 10 मिलीलीटर = 1 मिलीलीटर
    vol1xPBS = volअंतिम -volstart -vol10xPBS -volNaOH = १२.५ एमएल-10 एमएल-.11 एमएल-1 एमएल = ०.३९ एमएल

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Representative Results

मानव मायोकार्डियम के decellularization के लिए 3 कदम प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत सेलुलर सामग्री के पास पूरा हटाने में परिणाम है, जबकि प्रमुख ECM घटकों और ECM के fibrillar संरचना के संरक्षण । decellularization के बाद, ऊतक से कोशिकाओं का सकल हटाने रंग में परिवर्तन (चित्र 1a) द्वारा स्पष्ट है. एच एंड ई और Masson Trichrome दाग के साथ ऊतकीय विश्लेषण अवशिष्ट बरकरार कोशिकाओं (आंकड़ा 1b) के पूर्ण अभाव का पता चला. व्यक्तिगत ECM घटकों के लिए मात्रात्मक परख एक अधिक पूरा डीएनए को हटाने और कुल कोलेजन, elastin के बेहतर संरक्षण से पता चला, और glycosaminoglycans के रूप में अकेले एसडीएस द्वारा decellularization के साथ तुलना में (चित्र 2a) । cECM की जीवविज्ञान गतिविधि के कार्यात्मक सबूत चित्रा बीमें दिखाया गया है । यहाँ, आरटी-पीसीआर संरचनात्मक cardiomyocyte प्रोटीन की अभिव्यक्ति (Myh6, Tnnt2), जल्दी (Mef2c, nkx 2.5) और देर से (Gata4) cardiomyogenic प्रतिलेखन कारकों, और endothelial सेल सतह मार्कर जीन (वॉन Willibrand फैक्टर (vWF) का इस्तेमाल किया गया था, VE-cadherin) मे murine ESC सहज विभेद के दौर से गुजर रहा है. दोनों unकोट संस्कृति पकवान सतह और Matrigel-ECM कोटिंग की तुलना में, यह स्पष्ट है कि cECM ड्राइव के साथ संपर्क pluripotent स्टेम कोशिकाओं अधिमानतः एक cardiomyocyte की तरह phenotype की ओर ।

Lyophilized ECM स्लाइस आगे एंजाइमी या केमिकल रिएजेंट का उपयोग किए बिना microparticles में संसाधित किया जा सकता है । मैकेनिकल पीस या एक समान आकार (चित्रा 3) के साथ microparticles के उत्पादन के लिए अनुमति दी उपयुक्त किट का उपयोग कर चूर । मास स्पेक्ट्रोमेट्री cECM में मौजूद सभी पहचानने योग्य प्रोटीन का अवलोकन प्रदान करता है । जीन आंटलजी विश्लेषण सेलुलर घटकों पर ध्यान केंद्रित से पता चला कि ECM प्रोटीन के बहुमत वास्तव में extracellular अंतरिक्ष से प्राप्त कर रहे हैं, कुछ हीमोग्लोबिन अवशेषों और मुख्य रूप से intracellular प्रोटीन की एक संख्या के साथ (चित्रा 4) । इस पैटर्न cECM के ऊतक विशिष्ट जीवविज्ञान समारोह निर्धारित कर सकते हैं, लेकिन इस परिकल्पना आगे अनुसंधान की जरूरत है । cECM प्रोटीन संरचना का एक सारांश तालिका 1 में दिखाया गया है. microparticles में ECM प्रसंस्करण अपनी जैविक गतिविधि को बरकरार रखता है । एचएल-1 नकली "कोरोनरी" शर्तों को उजागर कोशिकाओं (हाइपोक्सिया, ग्लूकोज और सीरम अभाव) सेल चयापचय में वृद्धि प्रदर्शित (चित्र3) और कोशिका मृत्यु में कमी जब cECM पर कल्चरित (चित्र4 सी).

सीमित पेप्सिन-आधारित पाचन cECM पाउडर, एक संशोधित कोलेजन के लिए विकसित प्रोटोकॉल पर आधारित19, एक homogenized ECM समाधान में परिणाम । चरण कंट्रास्ट लाइट माइक्रोस्कोपी पिक्चर्स (चित्र 5 ए) 0 एच और ४८ एच के बाद पाचन प्रक्रिया को प्रदर्शित करता है । इस अनुमन्य चरण में अपक्षयी चिकित्सा10में आवेदनों की सुविधा है । परिणामी संसाधित cECM आरेख 5Bमें दिखाया गया है । कमरे के तापमान के नीचे यह तरल (चित्रा 5B, बाएं) रहता है, लेकिन ३७ डिग्री सेल्सियस पर यह सेल निलंबन की अनुमति 3 डी संस्कृति (प्रतिनिधि चित्र, चित्रा 5B सही है, hydrogel के साथ एक ओवरले के लिए उपयुक्त स्थिरता के साथ एक स्व-कोडांतरण hydrogel रूपों संस्कृति माध्यम के साथ स्तरित) । मानव कार्डियक fibroblasts के जीवित/मृत दाग भी cECM (चित्रा 5C) पर संवर्धन के लाभकारी प्रभाव को दर्शाता है । दोनों cECM microparticles और cECM hydrogel मानक संस्कृति में कोशिकाओं की तुलना में कोरोनरी स्थितियों में सिकुड़ा HL1 कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि में वृद्धि हुई (चित्रा 5C, निचले सही पैनल) ।

Figure 1
चित्रा 1: मानव हृदय मायोकार्डियम के Decellularization । (क) स्टीरियो माइक्रोस्कोपी द्वारा cECM के Macroscopic विश्लेषण 3 कदम decellularization प्रोटोकॉल के साथ सेलुलर सामग्री को हटाने से पता चलता है. यह पारदर्शिता में वृद्धि से स्पष्ट है । (ख) प्रोटोकॉल के साथ decellularization से पहले और बाद में रोधगलन के दाग-(बाएं; स्केल बार = ५० µm) and Masson Trichrome धुंधलान (right; स्केल बार = २०० µm) ऊतक से कोशिकाओं के सफल हटाने से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: cECM स्लाइस की सामग्री और प्रभाव. (क) चयनित ECM घटकों और डीएनए का मात्रात्मक जैव रासायनिक विश्लेषण, ३-स्टेप decellularization प्रोटोकॉल की तुलना ०.५% एसडीएस-अलोन decellularization. डेटा देशी मायोकार्डियम में सामग्री के प्रतिशत के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । 3 कदम प्रोटोकॉल के साथ, अवशिष्ट डीएनए सामग्री लगभग शूंय और काफी कम है कि एक मानक संयुक्त ०.५% एसडीएस/lysis बफर संयोजन और FBS (एसडीएस 9 ज + FBS) के साथ एक 9 घंटे की मशीन के बाद से था । संबंधित जैव रासायनिक परख कोलेजन का एक निकट पूरा संरक्षण, लगभग 20% glycosaminoglycan सामग्री का संरक्षण देशी ऊतक की तुलना में प्रदर्शन किया, और elastin सामग्री के लगभग 30% संरक्षण, सभी के साथ काफी अधिक मानक एसडीएस संदर्भ प्रोटोकॉल (सलाखों मतलब ± SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं) । (ख) प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं में cECM पर अंतर करने में चयनित जीन की mRNA अभिव्यक्ति, unकोट संस्कृति व्यंजन की तुलना में और Matrigel के लिए लेपित सतह । cECM डेटा संबंधित नियंत्रण सामग्री (नियंत्रण = 1, डैश्ड लाइन) पर प्राप्त उन लोगों के लिए सामान्यीकृत हैं । हृदय जीन के बहुमत काफी अधिक व्यक्त कर रहे है जब cECM पर संस्कृति (सलाखों मतलब ± SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: cECM microparticles की उपस्थिति और जैविक गतिविधि । (क) cECM microparticle चूर्ण के बाद lyophilization. (ख) चयापचय (MTS) और (ग) कोशिका मृत्यु (LDH रिलीज) का विश्लेषण एचएल-1 के cECM या जिलेटिन के साथ प्रसंस्कृत कोशिकाओं । cECM काफी सेल मौत कम कर देता है और चयापचय बढ़ जाती है । सलाखों मतलब ± SEM प्रतिनिधित्व करते हैं, सांख्यिकीय महत्व एक तरह से ANOVA और Bonferroni द्वारा परीक्षण किया । चित्र बी -सी Kappler एट अल से संशोधित किया गया है । 18 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: cECM microparticles की प्रोटीन संरचना । मास स्पेक्ट्रोमेट्री के बाद, स्ट्रिंग DB विश्लेषण cECM के प्रमुख घटक है, जो मुख्य रूप से extracellular अंतरिक्ष (जाओ: 0005615; लाल क्षेत्रों p > 0.05) के साथ जुड़े रहे है चित्रित । रेखाएं प्रोटीन इंटरैक्शन के आधार पर प्रयोगात्मक-जैव-रासायनिक डेटा (जामुनी), सह-अभिव्यक्ति डेटा (black), पर डेटाबेस इंटरैक्शन (नीला), और सह-अभिव्यक्ति (हरा) पर आधारित संकेत देती हैं. स्ट्रिंग DB आवश्यक विश्वास: स्कोर > 0.4 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एक hydrogel को cECM के प्रसंस्करण जैविक effectivity की रक्षा । चरण कंट्रास्ट प्रकाश माइक्रोस्कोपी चित्र प्रदर्शित करता है कि एंजाइमी पाचन cECM के लिए ४८ h परिणामों में एक अधिक homogenized ECM समाधान; स्केल बार = ५०० µm. (क) ECM समाधान कमरे के तापमान (ख, बाएँ) तक तरल रहता है और ३७ डिग्री सेल्सियस (बी, सही) में जब एक hydrogel की ओर स्वयं इकट्ठा करने की क्षमता शामिल है. जीवित/कार्डियक मानव fibroblasts के साथ और cECM के बिना संस्कृति के दाग जीवित कोशिकाओं की एक उच्च calcein धुंधला तीव्रता पता चलता है; स्केल बार = ५० µm (C)। cECM hydrogel सूक्ष्म कणों के रूप में एक ही तरीके से कोरोनरी स्थितियों में HL1 कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि बढ़ जाती है (सी, निचले सही पैनल, Kappler एट अल से संशोधित. 18) सलाखों मतलब ± SEM प्रतिनिधित्व करते हैं, सांख्यिकीय एक तरह से ANOVA और Bonferroni द्वारा परीक्षण महत्व । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्रोटीन का विवरण
5-hydroxytryptamine रिसेप्टर 7 OS = होमो sapiens GN = HTR7 PE = 1 SV = 2
Actin-like प्रोटीन घमण्ड OS = होमो sapiens GN = ACTL6B PE = 1 SV = 1
Actin, महाधमनी स्मूथ स्नायु OS = होमो sapiens GN = ACTA2 PE = 1 SV = 1
सीरम एल्ब्युमिन OS = होमो sapiens GN = ALB PE = 1 SV = 2
Antithrombin-III OS = होमो sapiens GN = SERPINC1 PE = 1 SV = 1
Apolipoprotein C-III OS = होमो sapiens GN = APOC3 PE = 1 SV = 1
Apolipoprotein E OS = होमो sapiens GN = APOE PE = 1 SV = 1
कुंडलित-कुंडल डोमेन युक्त प्रोटीन ४७ OS = होमो sapiens GN = CCDC47 PE = 1 SV = 1
C-प्रकार लेक्टिन डोमेन परिवार 11 सदस्य A OS = होमो sapiens GN = CLEC11A PE = 1 SV = 1
क्लोराइड intracellular चैनल प्रोटीन 1 OS = होमो sapiens GN = CLIC1 PE = 1 SV = 4
कोलेजन अल्फा-2 (I) चेन OS = होमो sapiens GN = COL1A2 PE = 1 SV = 7
पूरक c3 OS = होमो sapiens GN = c3 PE = 1 SV = 2
कोलेजन अल्फा-2 (IV) चेन OS = होमो sapiens GN = COL4A2 PE = 1 SV = 4
चक्रीय AMP-उत्तरदायी तत्व-बाइंडिंग प्रोटीन 3-जैसे प्रोटीन 4 OS = होमो sapiens GN = CREB3L4 PE = 1 SV = 1
Dermatopontin OS = होमो sapiens GN = डीपीटी PE = 2 SV = 2
Fibronectin OS = होमो sapiens GN = FN1 PE = 1 SV = 4
Glutathione peroxidase 3 OS = होमो sapiens GN = GPX3 PE = 1 SV = 2
हीमोग्लोबिन उपइकाई अल्फा OS = होमो sapiens GN = HBA1 PE = 1 SV = 2
हीमोग्लोबिन उपइकाई बीटा OS = होमो sapiens GN = HBB PE = 1 SV = 2
़ कापा चेन C क्षेत्र OS = होमो sapiens GN = IGKC PE = 1 SV = 1
Lumican OS = होमो sapiens GN = LUM PE = 1 SV = 2
Mimecan OS = होमो sapiens GN = OGN PE = 1 SV = 1
Nidogen-1 OS = होमो sapiens GN = NID1 PE = 1 SV = 3
Pseudopodium-समृद्धी असामान्य कळेनासे 1 OS = होमो sapiens GN = PEAK1 PE = 1 SV = 4
वर्णक उपकला-व्युत्पंन कारक ओएस = होमो sapiens GN = SERPINF1 PE = 1 SV = 4
Mitochondrial coenzyme A ट्रांसपोर्टर SLC25A42 OS = होमो sapiens GN = SLC25A42 PE = 2 SV = 2
सीरम amyloid P-घटक OS = होमो sapiens GN = APCS PE = 1 SV = 2
प्रतिलेखन दीक्षा कारक TFIID उपइकाई 5 OS = होमो sapiens GN = TAF5 PE = 1 SV = 3
ट्यूडर डोमेन-प्रोटीन युक्त 3 OS = होमो sapiens GN = TDRD3 PE = 1 SV = 1
जिंक फिंगर मातृऋण-टाइप प्रोटीन 4 OS = होमो sapiens GN = ZMAT4 PE = 2 SV = 1
जिंक फिंगर प्रोटीन १०१ OS = होमो sapiens GN = ZNF101 PE = 2 SV = 1

तालिका 1: cECM पाउडर की प्रोटीन संरचना के रूप में मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा निर्धारित ।

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Discussion

जब मानव रोधगलन ECM की तैयारी, लक्ष्य के लिए निंनलिखित को प्राप्त करने के लिए है: प्रासंगिक immunogenic सेलुलर सामग्री के संरक्षण, ECM अखंडता और गैर-सक्रियता, बांझपन, अंत उत्पाद, जीएमपी-प्रक्रिया संगतता की विषाक्तता, और हैंडलिंग के मामले में दिए गए आवेदन के लिए उत्पाद की उपयुक्तता । microparticles या स्व-कोडांतरण hydrogel में आगे प्रसंस्करण के साथ हमारे 3-कदम decellularization प्रोटोकॉल के संयोजन से, मानव हृदय ECM सामग्री प्राप्त की है कि विशिष्ट जैविक गतिविधि के पास, को संभालना आसान है, और के लिए क्षमता है इन विट्रो में एकाधिक अनुप्रयोगों और vivo में, क्या कई जानवरों प्रजातियों से ECM उत्पादों के लिए दिखाया गया है के समान11,13,20,21

रोधगलन के प्रारंभिक प्रसंस्करण के दौरान, यह समान मोटाई के अनुभाग रोधगलन के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यौगिक एकाग्रता और उपचार की अवधि ३०० µm स्लाइस के लिए titrated किया गया है । मोटा स्लाइस पूरी तरह से विसेलुलर और पतले स्लाइस हो जाएगा ECM घटकों के अवांछित टूटने के साथ साथ की कमी होगी । यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है एसडीएस उपचार के संबंध में, जहां विषाक्तता नकारात्मक ECM गुण और सेलुलर विश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं16. इसके अलावा, लंबे समय तक एसडीएस उपचार Godier-Fournement एट अल द्वारा अध्ययन में देखा के रूप में fibronectin के अभाव को पूरा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । 22, जबकि यह हमारे विधि17के साथ संरक्षित है । cECM वर्गों आगे प्रसंस्करण के बिना प्रयोगों में उपयोग के लिए उपयुक्त हैं (यानी, 3 डी संस्कृति मॉडल में सेल विभेद या सेल-ECM बातचीत, या के लिए "ऊतक इंजीनियरिंग" सेलुलर पुनर्जनसंख्या के दृष्टिकोण का विश्लेषण). डीएनए हटाने के लिए FBS का उपयोग अत्यधिक कुशल है, लेकिन संभावित ECM वर्गों में कुछ अवशिष्ट FBS प्रोटीन के लिए नेतृत्व कर सकता है । यह किसी भी FBS संवेदनशील परख को प्रभावित कर सकता है । एक नैदानिक ग्रेड जीएमपी प्रोटोकॉल के लिए अनुवाद प्रमाणित सीरा के उपयोग के साथ संभव होना चाहिए, लेकिन एक अनुकूलन नियमों के आधार पर आवश्यक हो सकता है । यह या तो ECM में FBS अवशेषों के अभाव की पुष्टि हो सकता है या प्रोटोकॉल के लिए एक परिवर्तन DNase उपचार के साथ FBS की जगह के लिए आवश्यक हो जाएगा । अंत में, दोहराया फ्रीज-गल चक्र ऊतक और ECM वर्गों के मैट्रिक्स के क्षरण को रोकने के लिए बचा जा करने के लिए कर रहे हैं ।

जब cECM hydrogel उत्पादन, पेप्सिन पाचन प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण कदम है । हमारे प्रारंभिक प्रयोगों में, ३७ डिग्री सेल्सियस पर ४८ ज के लिए पीएच 1 में पेप्सिन पाचन, जो 27 सी में ४८ एच के लिए पीएच 2 के लिए मशीन को संशोधित करने से रोका जा सकता है की एक हानि के लिए नेतृत्व किया । इसके अलावा, मन में भालू है कि hydrogel lyophilized cECM microparticle निलंबन से नहीं, हौसले से विनिर्मित गीला cECM स्लाइस से उत्पादित है । cECM स्लाइस की तुलना में hydrogel के सुधार सामान्य हैंडलिंग के अलावा, hydrogel यह विभिन्न सांद्रता में उपयोग के लिए पतला किया जा सकता है कि लाभ है, उदाहरण के लिए अन्य सामग्री के साथ संयोजन में एक उच्च एकाग्रता पर या 3 डी के लिए संस्कृति, या सेल संस्कृति व्यंजन की कोटिंग के लिए एक कम एकाग्रता या संस्कृति माध्यम के लिए एक additive के रूप में ।

इस प्रोटोकॉल मानव cECM तैयारी के लिए एक प्रयोगशाला ग्रेड शराबी के रूप में स्थापित किया गया है कि हाल ही में Saldin एट अल द्वारा वर्णित किया गया है कि अनुवाद अपक्षयी दवा में अंतराल को भरने में मदद करने के लिए । 10 जबकि सेलुलर cECM स्लाइसें रोगग्रस्त दिल की epicardial सतह पर चादरें के रूप में लागू किया जा सकता है, के रूप में हाल ही में Sarig एट अलद्वारा वर्णित है, रोधगलन23का एक चूहा मॉडल में सुअर cECM के साथ, एक hydrogel में प्रसंस्करण vivo अनुप्रयोगों में और अधिक विविध के लिए अनुमति देता है, जैसे मायोकार्डियम में cECM के इंजेक्शन के रूप में Singelyn एट अल द्वारा दिखाया गया है । 13 , 24 नैदानिक शोधों की गतिविधियों की ओर आगे बढ़ने के लिए, वर्तमान प्रोटोकॉल को जीएमपी-ग्रेड प्रक्रियाओं में परिवर्तित करना होगा । सिद्धांत रूप में, सभी सामग्री का इस्तेमाल भी अनुमोदित चिकित्सा उपकरण का हिस्सा है/ATMP उत्पादन प्रक्रियाओं (यानी, हृदय वाल्व या रक्त वाहिकाओं) और कोई बड़ी बाधाओं की उंमीद कर रहे हैं । हालांकि, सुरक्षित भंडारण की अवधि और रोगजनकों की अनुपस्थिति पर जानकारी निश्चित रूप से आवश्यक हो जाएगा । अंत में, हृदय रोग के बिना दाताओं से ताजा और बाँझ दिल के ऊतकों की बड़ी मात्रा का एक विश्वसनीय स्रोत की जरूरत है । यहां, मृतक अंग दाताओं कि प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त नहीं है से दिल सबसे अधिक संभावना परिदृश्य हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

अध्ययन प्रोटोकॉल हेलसिंकी की घोषणा में उल्लिखित नैतिक सिद्धांतों के अनुरूप है । रोगियों को अनुसंधान प्रयोजनों के लिए ऊतक के उपयोग के लिए सूचित सहमति प्रदान की है, और ऊतक संग्रह की प्रक्रिया संस्थागत समीक्षा बोर्ड और Charité-Universitätsmedizin बर्लिन की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (EA4/028/12) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Balance DR Precisa, Dietikon, Switzerland Precisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany SK-10-004
Cell culture plates (6-well) Greiner, Frickenhausen, Germany 657160
Cryostat CM Leica, Wetzlar, Germany 3050S
EDTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8043.3
Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) Greiner, Frickenhausen, Germany 616201, 623201
Falcon 15ml, 50ml Greiner, Frickenhausen, Germany 188271, 227270
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrome, Berlin, Germany S 0115
Freeze Dry System Labconco, Kansas City, USA 7670520
Freezer (-80°C) Thermo Scientific, Waltham, MA, USA Forma 900 Series
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 281.1
Microtome Blades Type 819 Leica, Wetzlar, Germany 14035838925
Minilys Homogeniser PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany 91-PCSM
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany K021.1
Nystatin PAN Biotech, Aidenbach, Germany P06-07800
PBS Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 14190-094
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Darmstadt, Germany 15140122
Pepsin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany 91-PCS-CK14
Rotamax 120 Plate shaker Heidolph, Schwabach, Germany 544-41200-00
SDS Carl Roth, Karlsruhe, Germany CN30.3
Stereo microscope Leica, Wetzlar, Germany M125
Steriflip-GP, 0,22 µm Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCGP00525
Stuart analogue rocker & roller mixers Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compound Hartenstein, Wurzburg, Germany TTEK
Transfusion set 200µm Sarstedt, Nümbrecht, Germany 798.200.500
TRIS Carl Roth, Karlsruhe, Germany 5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm Medical Highlights, Rohrdorf, Germany CV102-003
Vortex-Genie2 Scientific Industry, New York, USA SI-0256

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References

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