यह प्रोटोकॉल अपने extracellular मैट्रिक्स घटकों के संरक्षण के दौरान मानव मायोकार्डियम की पूरी decellularization का वर्णन करता है । आगे की प्रोसेसिंग extracellular मैट्रिक्स microparticles के उत्पादन में परिणाम और एक cytoprotective स्व-कोडांतरण hydrogel ।
Acellular extracellular मैट्रिक्स तैयारी सेल-मैट्रिक्स बातचीत का अध्ययन करने और reअपक्षय सेल थेरेपी अनुप्रयोगों की सुविधा के लिए उपयोगी होते हैं । कई वाणिज्यिक extracellular मैट्रिक्स उत्पाद hydrogels या झिल्ली के रूप में उपलब्ध हैं, लेकिन इन ऊतक विशिष्ट जैविक गतिविधि के अधिकारी नहीं है । क्योंकि छिड़काव decellularization मानव हृदय ऊतक के साथ आम तौर पर संभव नहीं है, हम एक 3 कदम विसर्जन decellularization प्रक्रिया विकसित की है । मानव रोधगलन सर्जरी के दौरान खरीद के पहले डिटर्जेंट के साथ इलाज कर रहे है मुक्त hyperosmolar lysis बफर, ईओण डिटर्जेंट, सोडियम dodecyl सल्फेट के साथ गर्मी के बाद, और इस प्रक्रिया के आंतरिक DNase गतिविधि का दोहन द्वारा पूरा हो गया है भ्रूण गोजातीय सीरम । इस तकनीक के सेल में परिणाम-कार्डियक extracellular मैट्रिक्स के मुक्त चादरें मोटे तौर पर संरक्षित रेशेदार ऊतक वास्तुकला और पॉलिमर संरचना है, जो कार्डियक सेल आबादी और pluripotent स्टेम करने के लिए विशिष्ट पर्यावरणीय cues प्रदान करने के लिए दिखाए गए के साथ कोशिकाओं. कार्डिएक extracellular मैट्रिक्स चादरें तो आगे रासायनिक संशोधन के बिना एक microparticle पाउडर में संसाधित किया जा सकता है, या, अल्पकालिक पेप्सिन पाचन के माध्यम से, एक आत्म में संरक्षित के साथ कार्डियक extracellular मैट्रिक्स hydrogel कोडांतरण ।
extracellular मैट्रिक्स (ECM) न केवल संरचनात्मक समर्थन प्रदान करता है, लेकिन जीवविज्ञान सेल और ऊतक समारोह के लिए भी महत्वपूर्ण है1. दिल में, ECM फाइब्रोसिस, सूजन, angiogenesis, cardiomyocyte सिकुड़ा समारोह और व्यवहार्यता के रूप में pathophysiologic प्रतिक्रियाओं के विनियमन में भाग लेता है, और निवासी जनक सेल भाग्य । रेशेदार नच, glycosaminoglycans, और proteoglycans-इसके प्राथमिक घटकों के अलावा-यह स्रावित विकास कारकों, साइटोकिंस, और झिल्लीदार बुलबुले युक्त न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन2,3के एक मेजबान शामिल हैं ।
यह हाल ही में स्पष्ट हो गया है कि acellular ECM तैयारी केवल सेल मैट्रिक्स बातचीत का अध्ययन करने के लिए अमूल्य नहीं हैं, लेकिन यह भी संभावित चिकित्सीय कोशिका आधारित अनुप्रयोगों के लिए । चिकित्सकीय सेल उत्पादों या इंजीनियर ऊतकों के लिए एक पर्याप्त वातावरण प्रदान करने के महत्व को अब व्यापक रूप से स्वीकार किया है । प्रयत्न सेल सस्पेंशन या सक्रिय यौगिकों के साथ परिभाषित किया गया है के साथ मिश्रित पॉलिमर hydrogels4,5,6 या प्रोटीन कॉकटेल के साथ murine सार्कोमा कोशिकाओं (यानी, Matrigel, Geltrex द्वारा स्रावित) 7. हालांकि, पूर्व सीमित है, गैर गतिविधि है, बाद जीएमपी में समस्याग्रस्त ग्रेड प्रक्रियाओं रहे हैं, और दोनों के ऊतकों की कमी-कार्डियक ECM (cECM) के विशिष्ट की गैर-गतिविधि है,8,9,10, 11,12,13.
मायोकार्डियम के Decellularization पहले कोरोनरी vasculature14,15के माध्यम से पूरे दिल के छिड़काव द्वारा प्रदर्शन किया गया है । हालांकि यह जानवर दिलों में संभव है, बरकरार मानव दिल शायद ही कभी उपलब्ध हैं । इसलिए, एक विसर्जन प्रक्रिया है कि ऊतक ऑपरेटिंग कमरे में प्राप्त नमूनों से निपटने के लिए अनुमति देता है इष्ट था । हमारे “3 कदम” प्रोटोकॉल अर्थात् lysis, solubilization, और डीएनए हटाने 3 अलग मशीन कदम शामिल हैं । यह काफी हद तक संरक्षित प्रोटीन और glycosaminoglycan संरचना16,17के साथ मानव रोधगलन ECM पैदावार । इन cECM स्लाइसें सेल-मैट्रिक्स बातचीत के इन विट्रो अध्ययनों में के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन खराब संभावित मानव पैमाने चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं । विनिर्माण प्रक्रिया तो lyophilized cECM microparticles या एक cECM hydrogel18उत्पादन के लिए बढ़ाया गया था ।
इस प्रोटोकॉल मानव मायोकार्डियम शल्य चिकित्सा नमूनों से प्राप्त की decellularization के लिए अनुमति देता है, रोधगलन extracellular मैट्रिक्स (ECM) और उनके जीवविज्ञान गतिविधि के प्रमुख घटकों के संरक्षण । इस प्रोटोकॉल की सिफारिश की जाती है जब मानव कार्डियक ECM संरक्षित ऊतक के साथ-विशिष्ट गैर-गतिविधि कोशिका-मैट्रिक्स बातचीत के प्रायोगिक अध्ययन के लिए आवश्यक है, या जब एक उपयुक्त वातावरण सेल आधारित रोधगलन के दृष्टिकोण के लिए आवश्यक है. सिद्धांत रूप में, यह भी जीएमपी ग्रेड शर्तों के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलन संभव है, ताकि प्रोसेस्ड cECM का उपयोग भविष्य चिकित्सीय अनुप्रयोगों में संभव होना चाहिए ।
जब मानव रोधगलन ECM की तैयारी, लक्ष्य के लिए निंनलिखित को प्राप्त करने के लिए है: प्रासंगिक immunogenic सेलुलर सामग्री के संरक्षण, ECM अखंडता और गैर-सक्रियता, बांझपन, अंत उत्पाद, जीएमपी-प्रक्रिया संगतता की विषाक्तत?…
The authors have nothing to disclose.
अध्ययन प्रोटोकॉल हेलसिंकी की घोषणा में उल्लिखित नैतिक सिद्धांतों के अनुरूप है । रोगियों को अनुसंधान प्रयोजनों के लिए ऊतक के उपयोग के लिए सूचित सहमति प्रदान की है, और ऊतक संग्रह की प्रक्रिया संस्थागत समीक्षा बोर्ड और Charité-Universitätsmedizin बर्लिन की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (EA4/028/12) ।
Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |