Síntese e avaliação de um inibidor de absorção de cálcio mitocondrial rutênio-baseado

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Um protocolo para a síntese, purificação e caracterização de um inibidor de rutênio-baseado da absorção de cálcio mitocondrial é apresentado. Um procedimento para avaliar a sua eficácia em células de mamíferos permeabilized é demonstrado.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nathan, S. R., Wilson, J. J. Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor. J. Vis. Exp. (128), e56527, doi:10.3791/56527 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Detalhamos a síntese e purificação de um inibidor de absorção cálcio mitocondrial,5 +[(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)]. A síntese otimizada deste composto começa de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 em 1 M NH4OH em um recipiente fechado, produzindo uma solução verde. Purificação é realizada com a cromatografia de permuta catiónica. Este composto é caracterizado e verificado ser puro por espectroscopia UV-vis e IR. As propriedades inibitório de absorção de cálcio mitocondrial são avaliadas em pilhas HeLa permeabilized por espectroscopia de fluorescência.

Introduction

Cálcio mitocondrial é um regulador chave para um número de processos que são críticos para a função celular normal, incluindo apoptose e produção de energia. 1 , 2 , 3 o uniporter cálcio mitocondrial (MCU), uma proteína de transporte de íon que reside na membrana mitocondrial interna, regula o influxo de íons cálcio na mitocôndria. 4 , 5 , 6 químicos inibidores do MCU são ferramentas valiosas para continuar os esforços para estudar a função e funções celulares deste transporte de proteína e cálcio mitocondrial. O composto [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, é um dos único conhecidos inibidores seletivos para o MCU com um valor ded K relatado de 24 µM.7 ,8,9,10 , este complexo é uma impureza comum encontrada em comerciais formulações de rutênio vermelho (RuRed), um triruthenium di-µ-oxo em ponte hexacation da fórmula [(NH3) 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, que também tem sido usado como um inibidor de absorção de cálcio. Embora Ru360 seja disponível comercialmente, é muito caro. Além disso, a síntese e isolamento de Ru360 é desafiado por processos de purificação difícil e métodos de caracterização ambíguo.

Recentemente informamos procedimentos alternativos para acessar um Ru360 análogo, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 este composto inibe a MCU com alta afinidade, semelhante ao Ru360. Neste protocolo, descreveremos nossa mais eficaz síntese deste composto, que se inicia a partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Purificação do produto usando resina permutadora de catiões fortemente ácida é detalhada, juntamente com armadilhas comuns para este procedimento. Podemos também apresentar métodos para caracterização e avaliação da pureza de compostos e delinear uma abordagem simples para testar a sua eficácia em bloquear a absorção de cálcio mitocondrial.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nota: ácidos concentrados e bases são usadas nesta síntese. Usar todas as práticas de segurança adequadas ao realizar a reação, incluindo o uso de controles de engenharia (coifa) e equipamentos de proteção individual (EPI) incluindo óculos de segurança, luvas, jaleco, calça comprida e sapatos fechados.

1. preparação de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5

  1. síntese de [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 12
    1. dissolver 1,00 g de RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru por peso, 4,1 mmol) em 5 mL de H 2 Cool O. a solução de marrom escura a 0 ° C em banho de gelo. Adicione 11 mL (0,23 mol) da solução de hidrato de hidrazina 80% de forma gota a gota. A reação inicial será vigorosa com o gás de evolução, resultando em uma solução de marrom. Deixe a solução resultante agitar à temperatura de 16 h; a solução final será vermelho escuro
      Cuidado: Hidrazina é extremamente tóxico e cancerígeno. Além disso, formas anidra estes reagentes são explosivas. Como sempre, use capuzes PPE e emanações apropriados ao manusear. Não se concentrar essas soluções à secura.
    2. a esta solução, adicionar cerca de 5-10 mL de HCl concentrado para ajustar o pH a 2. Neste ponto, a solução será amarelo-marrom na cor.
    3. Calor esta solução a 105 ° C, agitando para 1-2 h. Um sólido amarelo irá precipitar fora da solução. Quando não mais visivelmente precipitar formas, retire do fogo.
    4. Permitir a mistura de reação para arrefecer à temperatura ambiente e em seguida, coloque em banho de gelo a 0 ° C por 10 min. recolher o sólido amarelo por vácuo filtração e lavagem com 5 mL de etanol e éter dietílico.
    5. Dissolver completamente o produto bruto em 15-25 mL de água quente. Fica frio 10 mL de uma solução de HCl concentrada em um frasco de filtro, colocando-o em um banho de gelo. Filtre a solução amarela para a solução de HCl refrigerada para induzir a precipitação de um sólido puro amarelo pálido. Esse precipitado de filtrar e lavar com 5 mL de HCl 0,5 M, etanol e éter.
    6. Caracterizar o composto usando espectroscopia de IR. Verificar a pureza pela identificação de alongamento as frequências de 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 e 801 cm -1. Uma impureza comum menor em 2069 cm -1 é atribuída ao [Ru (NH 3) 5 N. 2] Cl 3.
  2. Síntese de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
    1. dissolver 100 mg (0,34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 em 50 mL de 1 M NH 4 OH em uma embarcação de pressão redondo de parede pesados de 200 mL. Vagamente tampar o frasco com uma rolha e aquecer a mistura de reação a 75 ° C, durante 6 h. Retire do fogo e misture à temperatura ambiente durante 4 dias produzir uma solução verde escura.
      Cuidado! Um resultado de recipiente selado em um acúmulo de pressão de aquecimento. Certifique-se de usar produtos vidreiros de pressão-seguro apropriado. Para esta reação, a finalidade de selar o recipiente é minimizar a perda de gases NH 3. Portanto, coloque a rolha frouxamente para permitir a liberação do excesso de pressão.
  3. Purificação por cromatografia de permuta catiónica
    1. em uma proveta de 25 mL, suspender resina permutadora de catiões de 5 g (por exemplo, malha Dowex 50WX2 200-400 (formulário H +) em 10 mL de 0.1 M HCl.
    2. Carregar este chorume em uma coluna de 10 mL (10 mm de diâmetro, 15 cm de altura) afixado com um reservatório de solvente de 50 mL. Lave a resina com cerca de 20-30 mL de 0.1 M HCl, até que o eluído esteja incolor.
    3. Voltar para a solução de verde de reação isolada na etapa 1.2.1. Para esta solução, adicionar HCl concentrado para ajustar o pH a 2, no ponto em que a cor da solução muda para marrom.
    4. Carregar esta solução acidificada à coluna de resina permutadora de catiões, preparada na etapa 1.3.2 pipetando suavemente em cima da resina. Deixe o eluato completamente escorra e continuar a carregar a solução. Repita este processo até que toda a solução foi adicionada. O topo da resina será castanho escuro/preto. A resina irá diminuir volume ligeiramente.
    5. , Grânulos de vidro de uso para cobrir o topo da resina. Estas impedirá a resina de ser incomodado quando novas soluções são adicionadas.
    6. Eluir a coluna com 20 mL de 1 HCl, M.
    7. Eluir a coluna com uma maior concentração de HCl de 1,5 M (≈ 50 mL). Uma solução amarela começará a sair da coluna. Aumentar a concentração de HCl a 2 M e continuar até o eluato é incolor de eluição ou um verde-amarelo muito pálido. Um volume total de 150-200 mL serão necessário para este processo.
    8. Aumentar a concentração de HCl a 2,5 M (20-50 mL). Recolha o eluato em fracções em tubos de ensaio. Aumentar para 3 M HCl. O produto vai eluir da coluna como uma solução verde-marrom. Uma fração de vermelho-marrom também pode começar a sair da coluna. Como estas frações são impurezas oxidadas rutênio vermelho, não da piscina com as frações de verde-marrom.
  4. Caracterização e verificação de pureza de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
    1. testar todas as frações de Passo 1.3.8. por espectroscopia UV-vis. Para realizar essa tarefa, adicionar 100 µ l de uma fração dada em 2 mL de 3 M de NH3 e analisar por espectroscopia UV-vis. Frações que contêm o produto puro terá uma banda grande absorvância a 360 nm e uma absorvância menos intensa em 600 nm. Absorvância a 480 ou 533 nm é indicativa de oxidado rutênio vermelho e impurezas de rutênio vermelho, respectivamente.
    2. Piscina frações contendo o produto puro e evaporar a solução para o ressecamento por evaporação rotativa. O produto será isolado como um sólido verde-marrom. Rendimentos são tipicamente da ordem de 5-15 mg (10-20% de rendimento). Single-cristais, apropriados para difração de raios x, podem ser obtidas através da difusão de vapor de etanol em solução aquosa do composto.
    3. Para verificar a pureza, analisar o composto por espectroscopia UV-vis em uma solução de pH 7,4 fosfato salino (PBS). Pureza pode ser avaliada tendo a relação de intensidade do 360 nm e 600 nm de picos. Esta proporção é 31 para um composto puro. Para compostos impuros, a proporção será menor.
    4. Analisar a amostra no estado sólido por espectroscopia de IR. Bandas de diagnósticos estão no 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 e 815 cm -1. Bandas de impureza comum são vistas em 1762 cm -1 e 1400 cm -1, característico de NH 4 vermelho de rutênio CL pode ser identificado por bandas em 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 e 800 cm -1.
  5. Avaliação da inibição de absorção de cálcio mitocondrial por espectroscopia de fluorescência
    cuidado! Os procedimentos a seguir usam células de mamíferos. Trabalho deve ser efectuado em capas de adequado fluxo laminar que são certificadas para a segurança biológica de nível 2 (BSL2) pesquisa.
    ​ Nota: [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 será referido como [Ru] nesta seção
    1. fazer buffer glicose contendo solução salina (BGSS) como a mídia de ensaio. BGSS é uma solução composta por 110 mM KCl, 1mm KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, ácido de-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic de 20 mM 4 (HEPES), succinato de sódio de 5 mM, 30 µM glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-ácido etilenodiaminotetracético (EGTA). Combinam com tudo, exceto o EGTA, ajustar o pH para 7,4. Adicionar EGTA e reajustar o pH para 7,4. Para 50 mL de mídia de ensaio, adicionar 0,5 mL de glicose 1 mg/mL.
    2. Células HeLa cultura em 500 cm 2 placas de Petri em Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) com 10% soro bovino fetal (FBS) numa incubadora umidificado com 5% CO 2 a 37 ° C. amplificar as células HeLa crescendo em uma placa de Petri de 100mm por semeadura -os em um prato de petri de 2 500 cm. O volume total de mídia no prato grande é 115 mL. Cada prato grande produzirá cerca de 18 milhões células, suficiente para dois experimentos de espectroscopia de fluorescência.
      1. Crescer as células até atingirem 90-95% Confluencia. Remova a mídia e lave as células com PBS pH 7,4 de 15 mL. Adicionar 15 mL de ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em PBS e incubar durante 10 min separar as células. Transferir as células para 14 mL redonda Falcão tubos
    3. contar células usando trypan azul e um hemocytometer com um microscópio invertido e calcular o número total de células e o volume dos meios necessários para atingir 7,5 milhões de células por volume de 1,8 mL do meio. Centrifugar as células durante 10 minutos a 5310 × g. decantar o sobrenadante e adicionar o volume calculado de BGSS. Ressuspender as células suavemente.
      1. Para este ensaio, preparar soluções estoque de digitonin de 40 mM em dimetilsulfóxido (DMSO), 1mm verde de cálcio-5N em H 2 O e 10 mM CaCl 2 em H 2 O. [Ru] Soluções conservadas em estoque, preparadas em água pura, pode variar de 1 a 3 mM.
        ​ Nota: cálcio Green-5N é sensível à luz. Armazenar no escuro e minimizar a exposição à luz.
    4. Configurar o fluorímetro para excitar a 506 nm e leitura das emissões em 532 nm com a cubeta do titular controlada em 37 ° C. Prepare uma cubeta do acrílica com uma barra de agitação ou roda, suspensão de células de 1,8 mL de 1.5.2 acima, 1,8 µ l digitonin de solução, 3.6 & #181; L cálcio Green-5N (solução) e 9 µ l [Ru] (para solução estoque de 1 mM, concentração final de 5 µM). Incube as células durante 15 min no fluorímetro.
      1. Ler os dados como a relação de excitação/emissão, em vez da absorção bruta. Esta prática minimiza os erros associados com as flutuações da intensidade da fonte de luz.
      2. Análise da primeira amostra na ausência de [Ru] para medir o efeito da adição de CaCl 2 sobre a resposta das células.
      3. Begin análise sobre o fluorímetro com as configurações descritas na 1.5.4. Espere aproximadamente 2 minutos para estabelecer uma base estável de emissão e em seguida, adicionar 1,8 µ l de CaCl 2 (concentração final de 10 µM). A intensidade de emissão vai aumentar imediatamente após a adição do CaCl 2 e então irá decair ao longo dos minutos como os íons cálcio entram na mitocôndria. Esperar até que tenha terminado a decadência (≈ 5 min). Adicionar bolus de cálcio adicional para determinar a resposta de absorção de cálcio mitocondrial das células não tratadas com [Ru].
    5. Em uma outra cubeta contendo 5 µM [Ru], repetir a experiência, como descrito acima em 1.5.4.3. Na presença do inibidor, intensidade de emissão vai aumentar, mas não decadência. Esta observação significa que bloqueou a absorção de cálcio mitocondrial.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Este método descreve uma síntese do cálcio mitocondrial absorção inibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 a partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, um matérias-primas ruthenium(III) conhecidos. [Ru (NH3)5Cl] CL2 caracteriza-se por espectroscopia de IR, com modos vibracionais em 3200 cm-1, cm 1608-1, 1298 cm-1e 798 cm-1 (Figura 1). Uma impureza menor em 2069 cm-1 pode ser atribuída à [Ru (NH3)5N2] Cl3. A reação desta espécie de Ru(III) com 1 M NH4OH proporciona [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. O progresso desta reação é evidenciado por uma dramática mudança na cor da solução de amarelo para verde. A solução final da reação é verde escuro na cor. A acidificação da solução com HCl concentrado resulta em uma mudança de cor para marrom; um subproduto desta neutralização é cloreto de amônio, que pode contaminar o produto final se não cuidado. Purificação do composto prossegue através de cromatografia de permuta catiónica usando resina de malha fortemente ácida (formulário H+ ). A resina é incubada primeiro com 0,10 M de HCl, e a solução de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 é carregada na coluna. O subproduto de cloreto de amônio elutes com as lavagens de HCl 1 M. Compostos de rutênio contendo eluir em altas concentrações de HCl. Uma série de frações amarelas, que contêm não tenha reagido [Ru (NH3)5Cl] Cl2 material começar, saem da coluna quando a concentração de HCl é de 1,5 M. O produto desejado elutes entre 2.5-3.0 M HCl e as frações resultantes aparecem verde para verde-marrom na cor.

Antes de reunir as frações do produto, deve ser verificada a sua pureza. Porque o composto desejado exibe alguma dependência do pH em seu espectro de UV-vis, sugerimos adicionar pequenas alíquotas das frações de soluções altamente básicas da3 do NH 3 M para garantir que as características espectrais são os mesmos para todas as frações. Frações puras só devem exibir um pico intenso a 360 nm e um pico fraco em 600 nm (Figura 2). Picos perto de 480 e 533 nm indicam a presença de rutênio marrom e vermelho, respectivamente e um pico significativo em 260 nm, com um ombro em 290 nm, significa a presença de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 prima (Figura 3 ). Evaporação rotativa de frações puras proporciona o composto desejado como um sólido verde-marrom.

O composto isolado, ainda mais, pode ser caracterizado por espectroscopia UV-vis e IR tanto. O UV-vis espectro (Figura 2) exibe a 360 nm e 600 bandas de absorvância nm conforme descrito acima. O coeficiente de extinção para a banda de 600 nm é 850 M-1cm-1 e da banda de 360 nm é 27000 M-1cm-1. A relação entre a intensidade da banda 360 nm em comparação com a banda de 600 nm deve ser 31 em PBS pH 7,4, e essa métrica pode ser efetivamente usada para medir a pureza do composto. O espectro de IR deve aparecer como mostrado na Figura 4. A frequência de estiramento O-Ru-Ru, por exemplo, é um diagnóstica em 850 cm-1. O espectro de IR foi utilizado para determinar o estiramento O-Ru-Ru e certifique-se de que cloreto de amônio não estava presente no produto final. Cloreto de amônio, uma impureza comum, tem modos vibracionais em 1762 cm-1 (muito fraca) e 1400 cm-1 (forte) que pode ser facilmente discernido a partir do espectro de IR (Figura 5). Rutênio Vermelho é um subproduto comum da reação e pode ser identificado no IR espectro com trechos em 1404 cm-1, 1300 cm-1, 1037 cm-1 e 800 cm-1, embora alguns se sobrepõem com o produto desejado irá ocorrer ( A Figura 6).

A resposta de absorção de cálcio em células de HeLa digitonin-permeabilizado é observada (Figura 7). Os asteriscos indicam que a adição de CaCl2 em bolus. Na presença de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 um aumento na intensidade de emissão é observado após a adição de cálcio, mas nenhuma deterioração devido ao cálcio mitocondrial absorção é observada.

Figure 1
Figura 1 : Espectros de infravermelhos de [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Os espectros de infravermelhos de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 com uma muito pequeno [Ru (NH3)5N.2] Cl3 impureza. A seta vermelha indica a impureza no 2.069 cm-1Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Espectros de UV-vis de representante para material puro. [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Espectros de absorvância CL5 UV-vis e perto de infravermelho (inserir) tomadas em PBS pH 7,4. O coeficiente de extinção para o major absorvância a 360 nm é 27.000 M-1 cm-1Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Espectros de UV-vis de mistura reacional bruto. [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] CL5 UV-vis espectros de absorvância da mistura de reação bruto antes da purificação tomada em PBS pH 7,4. As setas vermelhas indicam as impurezas comuns. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Representante espectros de infravermelhos para puro material. Os espectros de infravermelhos de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. O estiramento O-Ru-Ru em 850 cm-1, os outros trechos são de osciladores de3 o NH. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5/>
Figura 5 : Espectros de infravermelhos contendo NH4Cl impurezas. Os espectros de infravermelhos de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 com cloreto de amônio impureza. A seta vermelha indica o cloreto de amónio em 1.400 cm-1Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : Espectros de infravermelhos de rutênio comercial vermelho O espectro infravermelho de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 (traço preto) e comercial rutênio vermelho (traço vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7 : Resultados de absorção de cálcio representativa. O aumento da fluorescência, devido à adição de cálcio para um coquetel de digitonin-permeabilizado as células HeLa, cálcio Green-5N e [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 em BGSS. O espaço em branco não contém nenhum [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 e diminuição de fluorescência devido a absorção de Ca2 + na mitocôndria pode ser vista. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

O cálcio mitocondrial absorção inibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 pode ser sintetizada de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, um ruthenium(III) bem conhecido começando o material, conforme descrito neste procedimento. A síntese de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 é facilmente alcançada com pouca dificuldade. Após agitação RuCl3 para 16 h na hidrazina hidrato, o pH da solução deve ser ajustado para um valor de 2 com HCl. A queda de pH é crítica para atingir o produto desejado. Se desejado, essa síntese pode ser modificada de forma [Ru (NH3)5Br] Br2 por refluxo na HBr em vez de HCl.

Temos observado algumas estratégias para minimizar a formação de subprodutos indesejáveis durante a síntese do inibidor de absorção de cálcio mitocondrial. Notavelmente, manter o recipiente tampado é fundamental para o sucesso desta reação; Se o frasco for aberto, uma série de outros subprodutos, incluindo rutênio vermelho (RuRed), é formada em quantidades apreciáveis. Presumivelmente, amônia gasosa está perdida desde a embarcação da reação aberta e esta formação de compromissos de evento do produto desejado. O tamanho do balão e o volume de amônia aquosa também são parâmetros importantes que não devem ser modificados significativamente daqueles descritos no presente protocolo, como temos notado que a eficiência desta reação é diminuída em frascos menores. Este método não aumenta drasticamente o rendimento deste composto em comparação com os outros dois métodos que tinha anteriormente divulgada. , No entanto, conter menos etapas e dar origem à formação de produto menos colaterais, tais como RuRed. O baixo rendimento pode ser atribuído à presença de uma pequena quantidade de não tenha reagido [Ru (NH3)5Cl] Cl2 , bem como desconhecido altamente carregada de impurezas que são retidas no topo da coluna. Embora não exploramos muitas condições de reação adicional, é possível que melhorias podem ser realizadas através da variação do tempo de reação e as concentrações de reagente, para obter rendimentos mais elevados.

A purificação de [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 é a parte mais difícil e tedioso do presente protocolo. Uma coluna bem embalada irá ajudar muito na separação; carregando a resina como chorume é uma abordagem eficaz para embalar a coluna. Note-se que como a concentração de HCl é aumentada ao longo de eluição da coluna, a resina contrato em tamanho. Para obter êxito material puro, a taxa na qual a concentração do ácido é aumentada não deve desviar o procedimento indicado. O produto final será um sólido verde-marrom; uma solução básica será verde-escuro, mas soluções ácidas será marrons. Se for observada uma solução-rosa ao vermelho brilhante, contaminações de rutênio vermelho estão presentes. A quantidade de RuRed pode ser determinada utilizando-se o coeficiente de extinção (62.000 M-1·cm-1 em 533 nm). Este processo de purificação é relativamente geral para colunas de resina permutadora de catiões forte.

A inibição de absorção de cálcio mitocondrial pode ser testada usando permeabilized as células HeLa, o sensor de cálcio fluorescente verde-5N de cálcio e um spectrofluorimeter. 13 , 14 este ensaio requer uma grande quantidade de células e, portanto, exigem a amplificação da cultura em um grande 500 cm2 placa de Petri. Estes frascos de cultura grande evitar desafios adicionais em minimizar a contaminação microbiana, porque as áreas de superfície expostas são muito grandes. Trabalho deve ser realizado em um fluxo laminar para manter a esterilidade. A resposta de fluorescência de cálcio Green-5N em pilhas HeLa permeabilized é monitorada por espectroscopia de fluorescência. A adição de um bolus externo de cálcio para a célula provoca um aumento imediato na fluorescência, decorrentes de íons de cálcio interagindo com o sensor. Ao longo de vários minutos na ausência de um inibidor, a intensidade decai devido a absorção destes íons cálcio na mitocôndria, uma organela que não pode ser acessada pelo corante. Quando este ensaio é realizado na presença de um inibidor a adição de um bolus de íons cálcio dá origem a um aumento na intensidade de emissão. A decadência devido a absorção de cálcio mitocondrial, no entanto, não está presente, verificando as propriedades de inibitória de absorção de cálcio mitocondrial deste composto. Este processo pode ser usado como uma tela geral para inibidores de absorção de cálcio. Além disso, este procedimento pode ser aplicado a outras células eucarióticas de interesse. Este ensaio depende a permeabilização do exterior membrana celular, portanto, não fornece informações sobre a capacidade de absorção celular de um complexo.

Em resumo, este protocolo descrever a síntese e purificação de um inibidor de absorção de romance de cálcio mitocondrial rutênio-baseado. Este composto é de valor significativo para o estudo da biologia de cálcio mitocondrial e seu papel na fisiologia da célula mamífera. O ensaio relativamente simples para teste de absorção de cálcio mitocondrial também é útil para a triagem e a investigação de novos inibidores.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pela Universidade de Cornell. Este trabalho fez uso do centro Cornell para materiais compartilhados instalações de pesquisa, que são suportados pelo programa NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. reconhece apoio por uma bolsa de pesquisa da pós-graduação NSF (Grant DGE - 1650441) e Dr. Dave Holowka para assistência com os experimentos de cálcio. Qualquer opinião, conclusões e conclusões ou recomendações expressadas neste material são as dos autores (s) e não refletem necessariamente as opiniões da National Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ruthenium Trichloride hydrate Pressure Chemical 3750
Concentrated hydrochloric acid J.T. Baker 9535
Concentrated ammonium hydroxide Mallinckrodt Chemical Works A669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 Mesh Alfa Aesar 13945
Calcium Green 5N Invitrogen C3737
Digitonin Aldrich 260746
DMSO Aldrich 471267
EGTA Aldrich E3889
KCl USB 20598
KH2PO4 Aldrich P3786
MgCl2 Fisher Scientific M33-500
HEPES Fluka 54466
Sodium Succinate Alfa Aesar 33386
EDTA J.T. Baker 8993-01
Glucose Aldrich G5000
200 Round bottom flask ChemGlass CG-1506-14
Glass stopper ChemGlass CG-3000-05
10 mm x 15 cm glass column with reservoirs Custom - similar to Chemglass columns Similar to CG-1203-20
DMEM Corning 10-017-CV
FBS Gibco 10437028
PBS Corning 21-040-CV
Round bottom Falcon tubes Fisher Scientific 14-959-11B 
500 cm2 petri dishes Corning 431110
Trypan blue ThermoFisher Scientific 15250061
Hemacytometer Aldrich Z359629
Acrylic Cuvettes VWR  58017-875
UV-Vis spectrometer Agilent Model Cary 8454 
Spectrofluorimeter SLM Model 8100C
IR spectrometer Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment
Centrifuge ALC Model PM140R
Inverted light microscope VWR  89404-462

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
  2. Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797, (6-7), 607-618 (2010).
  3. Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12, (1), 77-85 (2012).
  4. De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476, (7360), 336-340 (2011).
  5. Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476, (7360), 341-356 (2011).
  6. Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16, (9), 545-553 (2015).
  7. Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30, (20), 4949-4952 (1991).
  8. Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115, (25), 11799-11805 (1993).
  9. Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273, (17), 10223-10231 (1998).
  10. Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533, (7602), 269-273 (2016).
  11. Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56, (6), 3123-3126 (2017).
  12. Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45, (12), 1337-1341 (1967).
  13. Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, (18), 9893-9898 (1996).
  14. Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics