Трансуретральная инстилляции процедура в взрослого мужчины мыши

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Трансуретральная инстилляции является сложной процедурой и не хорошо описаны в литературе. Цель этой рукописи должен описать технику для трансуретральной ввода катетера для доставки внутрипузырной жидкостей с активными веществами в мочевого пузыря и предстательной железы у взрослых мышей-самцов.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, S., Carrasco Jr., A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. Transurethral Instillation Procedure in Adult Male Mouse. J. Vis. Exp. (129), e56663, doi:10.3791/56663 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Трансуретральная инстилляций может использоваться для доставки различных решений с активных ингредиентов (например, наркотиков, химических веществ, бактерий и вирусов) локально в мочевого пузыря побудить животных моделей патологии пузыря или оценить эффективность лечения внутрипузырной. Большинство грызунов моделей патологии нижних мочевыводящих путей (LUT) индуцированной в самок мышей из-за простоты внутрипузырной инстилляции через женской уретры веществ. Однако благодаря анатомические различия между женской и мужской LUT, трансуретральная инстилляции в мужской мышь была сочтена весьма сложной процедуры, и он не был описан ранее. В этой рукописи мы предоставляем подробное описание о том, как подготовить полиэтилен (ПЭ) труб для последующей вставки в мочеиспускательный канал мужчины мыши. Кроме того мы обсуждаем идеальные типы ПЭ трубы для использования в зависимости от желаемого места прививки. Кроме того мы опишем пункт за пунктом, как готовить животных для успешной трансуретральная инстилляций избежать травмы уретры и обеспечить доставку решения в нужное место. Процедура запускается путем втягивания крайней плоти и головки подвергать отверстие уретры слухового прохода. Далее головки захвачен тупой-дробление щипцы для стабилизации пенис и ПЭ трубы. ПЭ трубы вставляется сначала уретры слухового прохода параллельно телу животного, то его угол регулируется, наклоняя катетер для маневра он следовать естественной кривизны мочеиспускательного канала. Этот метод может использоваться для индуцированного мышиных моделях патологии пузыря и/или оценки эффективности лечения внутрипузырной у мышей-самцов.

Introduction

Трансуретральная инстилляции подход был использован в ходе предыдущих исследований как один из методов для создания грызунов моделей мочевого пузыря патологий1,2,3,4 и может быть использован для оценки эффективность локально поставленного обработок в мышах. Хотя Животные модели нельзя охарактеризовать полностью человеческих патологий, выявление основных механизмов в исследованиях на животных обеспечивает более глубокое понимание человека LUT расстройств, таких как интерстициального цистита/мочевого пузыря болевого синдрома, нейрогенные цистит, аутоиммунные цистит и простаты воспаления5.

Трансуретральная инстилляции процедура, проводимая на взрослого мужчины мыши технически более сложной, чем внутрипузырной инстилляции в взрослых женщин мыши6. Естественно изогнутые Анатомия мужской уретры наряду с ее малого диаметра сделать технически сложно выполнить трансуретральная ввода катетера. Таким образом подробные инструкции для трансуретральной индукции инфекции мочевыводящих путей мыши6 и LUT воспаление7,8,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 через катетер мочевого пузыря вставить ранее были подготовлены только самок мышей. Эта рукопись призвана обеспечить пошаговое описание методики для трансуретральной инстилляций веществ у мышей-самцов, включая видеоклипы, изображения и иллюстрации. Трансуретральная инстилляции, что процедуры в взрослого мужчины мыши могут быть выполнены с помощью переменной прививает аналогична ранее описанные в женской мыши7 и объединена с дополнительные методы, такие как записи ЭМГ visceromotor ответов (VMR)16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

все процедуры с животными, включая метод и Продолжительность анестезии, а также послеоперационного ухода, были обсуждены с ветеринаром и одобрен институциональный уход за животными и использования Комитет (IACUC) на ассоциированные учреждения. В этой рукописи, с 8 до 15-недельных самцов мышей C57BL/6 были выполнены все процедуры и протокола следует животных ухода руководящими принципами, утвержденными IACUC в университете Колорадо.

1. Подготовка трубы

Примечание: привить посевным материалом, иглы придает полиэтилен (ПЭ) труб ( рис. 1A) или небольшой датчик (< 24 G) angiocatheter может быть используемые () Рисунок 1 g). Использование angiocatheter требует никакой подготовки помимо стерилизации с 70% этанола (EtOH). Посевным материалом является вещество, которое привили/вводят/хранение в мочевыводящих путей. Это может быть решение, содержащее бактерий, вирусов или химического. Это подготовлен заранее и на один протокол исследования. Например, если цель исследования для оценки воздействия инфекции E. coli на нижних мочевыводящих путей, исследователь необходимо будет подготовить посевным материалом, содержащий бактерии, которые могут быть привиты, привил нижних мочевыводящих путей.

  1. Подготовка иглы, придает ПЭ трубы прост и состоит из следующих действий: выберите размер ПЭ трубы основе органа-мишени и возраста животного. Для животных моложе 12 недель, использование труб PE-10 (внешний диаметр составляет 0,024 дюймов и внутренний диаметр составляет 0,011 дюймов). Трубы PE-10 предложил, чтобы быть применимым для (1 первичного посева посевным материалом в передней простаты (AP) и семенных пузырьков (SV), или (2 первичного посева посевным материалом в мочевом пузыре моложе 12 недель возраста животного. ПЭ трубы с диаметром больше до размера 50 PE (внешний диаметр до 0.038 дюймов и внутренний диаметр до 0,023 дюймов) может использоваться для начального заполнения посевным материалом в мочевом пузыре пожилых животных.
  2. Сократить примерно 2,5 дюйма труб PE.
  3. Выберите иглы, которая будет соответствовать выбранной PE диаметр использоваться. 27 G игла может поместиться в просвете труб PE-10, и иглой 22 G соответствует просвета трубы PE-50.
    1. Подготовить иглы до вставки в ПЭ трубы, потерев острый край иглы на камне коммерчески доступных нефти ( рис. 1A -B) сделать это скучно, или использовать коммерчески доступных Блант игла.
  4. Ввести тупой иглой ( рис. 1 c) в просвете ПЭ трубы. Избежание повреждения люмен или вступления в ложных люмен, обеспечивая игла остается в центре люмен. ( рис. 1 d -E). ПЭ трубы при повреждении во время вставки тупой иглой, вырезать поврежденные конца и перезапуска процесса.
  5. Место иглы придает ПЭ трубы в 70% случаев EtOH для стерилизации до его использования для процедуры. Флеш, 70%, которую EtOH через иглу ПЭ трубы для стерилизации просвета и обеспечить там не происходит утечки из ПЭ трубы от повреждения во время процесса иглы. Если есть утечка, отбрасываются иглы ПЭ трубы.
    Примечание: Кончик ПЭ трубы должна быть гладкой до катетеризации. Чтобы избежать проблем с внедрением ПЭ трубы в мочеиспускательный канал, рекомендуется вырезать кончик трубки PE непосредственно перед катетеризация ( Рисунок 1F). Предлагаемые минимальная длина труб PE – 1,5 дюйма, который включает в себя часть вокруг иглы.

2. Катетеризация процедура

  1. до индукции анестезии, опорожнить мочевой пузырь мыши.
    1. Применить нежное давление и массаж в нижней части живота мыши. Эти маневры обычно приводят к спонтанной мочеиспускания. Полный мочевой пузырь может привести к ослаблению или немедленного утечки любой внушал посевным материалом.
      Примечание: Дополнительные опции для обеспечения пустой мочевой пузырь в мыши, лишить животное воды для по крайней мере за 1 час до начала процедуры ОВОС трансуретрально инстилляции. Лишение воды должен быть одобрен учреждение как часть протокола животных.
  2. Использовать машину анестезии с потоком изофлюрановая (2%), чтобы побудить анестезии.
    1. После наркоза животного, поместите его на теплой электроодеяло и покрыть ее с синей колодки с его нос внутри ураном для поддержания непрерывной анестезии.
    2. Подтверждают, что животное находится под наркозом, установив педаль рефлекс (мыс пинча).
  3. После того, как педаль рефлекс отсутствует, перейти от втягивания крайней плоти.
    1. Пресс лобковой области с большой палец и указательный палец одной руки ( 2A цифры и 2B) и вытащить пенис желез, с большим и указательным пальцами другой руки ( Рисунок 2 c). Когда это будет сделано правильно, крайней плоти, головки полового члена и полового органа по-прежнему подвергаются. ( 2D рисунок и Рисунок 2F). Не используйте щипцы для вытащить желез пенис, как это приведет к повреждению тканей.
  4. Смажьте кончик катетера и головки с стерильные хирургические смазки до ввода катетера. Это облегчит вставки труб PE.
    Примечание: Индивидуально упакованных квадратов хирургических смазочных материалов, вместо одной большой трубы, рекомендуются для каждого использования для поддержания стерильных условий.
  5. Аккуратно прижмите кончик пениса, используя тупой щипцами и осторожно выжмите головки вызвать уретры слухового прохода открыть.
  6. Держите шприц с иглой придает ПЭ трубы или PE трубы сама и вставьте ПЭ трубы через мочеточниковый слухового прохода.
    Примечание: Для стабильности рекомендуется штатив захват шприца с иглой придает ПЭ трубы или PE трубы себя, используя большой палец, указательный и средний пальцы.
    Примечание: Путь катетеризация следует быть изогнут вследствие естественной кривизны уретры, окруженный головки полового члена и полового органа в взрослого мужчины мыши, как показано на рисунке 3A и 3B рисунок. Catheterized ПЭ трубы может встретить сопротивление при катетеризации, поэтому он рекомендуется для регулировки угла наклона трубы вверх или вниз, чтобы помочь заранее ПЭ трубы в дополнение к целевым органом. При необходимости, чтобы помочь ему маневр через различные резкие повороты уретры ПЭ трубы может поворачиваться слегка. Когда есть слишком много сопротивление, трубы должны быть вытащил обратно и затем снова вперед с минимальным давлением. Потянув ПЭ трубы из полностью и с использованием более смазки могут быть полезны.
  7. Выполняют инстилляции посевным материалом после ПЭ трубы достиг желаемого орган, нажав иглы поршень, чтобы привить желаемый объем посевным материалом, (5-200 мкл объем предложил).
    1. Для инстилляций посевным материалом в мочевой пузырь, заранее ПЭ трубы до приблизительно 0,75 дюйма ПЭ трубы вставляется ( рис. 3A).
      Примечание: для инстилляций посевным материалом в ап и SV, как правило, the вставляется трубка встречает сопротивление, когда он достигает точки открытия в передней простаты. Регулируя угол наклона трубы вверх или вниз, ПЭ трубы будут двигаться дальше, до тех пор, пока примерно на 1 дюйм труб PE был вставлен ( рис. 3B).

3. В естественных условиях Визуализация нижних мочевыводящих путей и почек

Примечание: цель в vivo изображений в этой рукописи: (1) для подтверждения пространственной локализации посевным материалом; и (2), чтобы оценить распространенность рефлюкс посевным материалом для почки. Для этой цели, может использоваться либо наркотизированных или Усыпленных мышь.

  1. Для визуализации нижних мочевыводящих путей взрослого мужчины мыши, выполнить нижней брюшной срединная лапаротомия подвергать мочевого пузыря, предстательной железы и семенных пузырьков.
    1. Надрезать кожу в средней линии от лобковой кости чуть ниже мечевидного отростка, используя ножницы.
    2. Поднять кожу с подкожной клетчатки.
    3. Определить аваскулярный linea alba расположен в срединной и надрезать это вступить в брюшной полости, где расположены все органы.
    4. Подтверждается визуализации синий краситель или другой подходящей отслеживания агента пространственной локализации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Трансуретральная инстилляции синего красителя через PE 50 трубы в результате инстилляции красителя в мочевого пузыря (рис. 4A) и через 10 ПЭ труб в раскрашивания SV и AP (рис. 4B), соответственно. Чтобы оценить ли выполненных трансуретральная инстилляции вызывает мгновенное рефлюкс посевным материалом для почек или нет, почки и мочеточника наблюдались после инстилляции 100 мкл синий краситель и флуоресцентные краски (рис. 4A-B). Ни один из инстилляции процедуры, с помощью двух разных размеров ПЭ трубы и два различных красителей привело раскрашивания мочеточников и почек.

Figure 1
Рисунок 1: Иглой 22 G подготовки для вставки в полиэтилен (ПЭ) труб 50. Острые иглы (A) шлифованный камень нефти (B) чтобы заглушить острыми краями (C). После того, как иглы скучно, игла вставляется в Люмене ПЭ трубы (D) и расширенный через иглу с тонкой щипцами (E). Труб затем вырежьте приблизительно 1,5 дюймов (F). Может также использоваться angiocath 24 G (G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Мужчины мыши крайняя плоть покрывает головки и уретры слухового прохода (A), с небольшой тягой крайняя плоть головки могут быть подвержены (B), и с небольшой тракции головки (C), весь крайней плоти может быть отозвано (D), таким образом позволяет для легкого доступа к уретры слухового прохода и мочеиспускательного канала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Иллюстрации нижних мочевых органов; мочевого пузыря, предстательной железы и семенных пузырьков (SV) показаны трансуретральная инстилляции, с использованием труб PE 50 (A) и трубы PE 10 (B) для первичного посева мочевого пузыря и простаты SV/передней, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Изображения верхних и нижних мочевых органов; почек, мочевого пузыря, предстательной железы и семенных пузырьков (SV) после трансуретральной инстилляции, с использованием труб PE 50 (A) и трубы PE 10 (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта рукопись подробно описывает метод трансуретральная инстилляции в взрослого мужчины мыши. Дифференциальный первичного заполнения области можно добраться с помощью ПЭ трубы различного диаметра. PE-50 рекомендуется для успешного достижения мочевого пузыря люмен, а большего диаметра, PE-10 используется для достижения AP и SV (Рисунок 3А-B). Помимо выбора размера трубы PE и органом-мишенью для прививки другие факторы, такие как объем внушал посевным материалом, также играть роль в конце местоположения и распределение раствора. Наши эксперименты показывают что трансуретральная инстилляции 100 мкл синего красителя, используя либо PE-10 или PE-50 не вызвать мгновенное рефлюкс красителя на почки. Однако рефлюкса мочи почками могут произойти в период после инстилляции и может привести к инфекции почек, как ранее было показано в8взрослых самок мышей. Таким образом гистологические оценки функции почек рекомендуется подтвердить отсутствие косвенное загрязнение почек от трансуретральная закапывание.

Есть несколько важных ключевых шагов для выполнения успешной трансуретральная инстилляции посевным материалом. Во-первых, ПЭ трубы должна быть достаточной длины — по крайней мере 2,5 дюйма. Это позволило бы дополнительные корректировки длины труб, при необходимости, во время процесса подготовки труб, или после процедуры трансуретральная инстилляции. Несколько попыток и неудачи во время шага 9 настоящего Протокола может вызвать засорение вставленной конца трубы PE, жидкости организма. В этой ситуации кончик трубки PE следует вырезать, чтобы иметь четкий наконечник для последующих попыток. Как только вырезать кончик трубки PE, хирургических смазочных материалов должно быть повторно прикладной. Во-вторых держание шприц или PE трубы себе увеличить показатель успеха. В-третьих следует вставить достаточной длины труб PE и крайней плоти, головки полового члена и полового органа должны быть жестко выстроились без рукоятка в процессе катетеризации. В противном случае обратный посевным материалом может произойти когда помещается поршень шприца.

Лучшие результаты для трансуретральной инстилляции процедуры может быть результатом практики сопровождается во избежание повреждение уретры и целевых орган во время процедуры. Результаты производительности могут быть проверены с помощью цветных красителей или флуоресцентными красителями как процедура для подтверждения первичной локализации посевным материалом и каких-либо признаков рефлюкс на почки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы не имеют каких-либо подтверждений.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 10 BD Medical 63019-004
BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 50 BD Medical 63019-048
BD Insyte-N Autoguard/ Angiocath BD Medical 311411
Ethanol (EtOH) Fisher Scientific BP2818500
BD Needle Only 22 Gauge (G) 1 inch Becton Dickson 205155
BD Needle Only 27 Gauge (G) 1/2 inch Becton Dickson 305129
Luer stub, 22 G X 0.5 in / Blunt Needle Instech LS22
Luer stub, 27 G X 0.5 in / Blunt Needle Instech LS27
6" Long x 2" Wide x 1" Thick, Aluminum Oxide Sharpening Stone / Oil Stone Norton 40204034
Surgical Lubricant Sterile Bacteriostatic Folilpac Surgilube 281020543
Isoflurane Fluriso 13985-528-60
SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System Kent Scientific SS-01
Dissecting Forceps, Curved vwr 82027-392
BD 1 ml Syringe BD Medical 309626
India Ink Solution., 0.2% in PBS buffer Alfa Aesar J61007
8~12 weeks old male C57B/6 Mice Jackson Lab #000664

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, S., Yang, G., Bushman, W. Prostatic inflammation induces urinary frequency in adult mice. PLoS One. 10, (2), e0116827 (2015).
  2. Wong, L., Hutson, P. R., Bushman, W. Prostatic inflammation induces fibrosis in a mouse model of chronic bacterial infection. PLoS One. 9, (6), e100770 (2014).
  3. Elkahwaji, J. E., Zhong, W., Hopkins, W. J., Bushman, W. Chronic bacterial infection and inflammation incite reactive hyperplasia in a mouse model of chronic prostatitis. Prostate. 67, (1), 14-21 (2007).
  4. Boehm, B. J., Colopy, S. A., Jerde, T. J., Loftus, C. J., Bushman, W. Acute bacterial inflammation of the mouse prostate. Prostate. 72, (3), 307-317 (2012).
  5. Bjorling, D. E., Wang, Z. Y., Bushman, W. Models of inflammation of the lower urinary tract. Neurourol Urodyn. 30, (5), 673-682 (2011).
  6. Thai, K. H., Thathireddy, A., Hsieh, M. H. Transurethral induction of mouse urinary tract infection. J Vis Exp. (42), (2010).
  7. Bjorling, D. E., Wang, Z. Y., Boldon, K., Bushman, W. Bacterial cystitis is accompanied by increased peripheral thermal sensitivity in mice. J Urol. 179, (2), 759-763 (2008).
  8. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infect Immun. 66, (6), 2798-2802 (1998).
  9. Dinis, P., Charrua, A., Avelino, A., Cruz, F. Intravesical resiniferatoxin decreases spinal c-fos expression and increases bladder volume to reflex micturition in rats with chronic inflamed urinary bladders. BJU Int. 94, (1), 153-157 (2004).
  10. Cayan, S., et al. Botulinum toxin type A may improve bladder function in a rat chemical cystitis model. Urol Res. 30, (6), 399-404 (2003).
  11. Jerde, T. J., Bjorling, D. E., Steinberg, H., Warner, T., Saban, R. Determination of mouse bladder inflammatory response to E. coli lipopolysaccharide. Urol Res. 28, (4), 269-273 (2000).
  12. Saban, M. R., et al. LPS-sensory peptide communication in experimental cystitis. Am J Physiol Renal Physiol. 282, (2), F202-F210 (2002).
  13. Schilling, J. D., Mulvey, M. A., Vincent, C. D., Lorenz, R. G., Hultgren, S. J. Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. J Immunol. 166, (2), 1148-1155 (2001).
  14. Saban, M. R., et al. Discriminators of mouse bladder response to intravesical Bacillus Calmette-Guerin (BCG). BMC Immunol. 8, 6 (2007).
  15. Bjorling, D. E., et al. Acute acrolein-induced cystitis in mice. BJU Int. 99, (6), 1523-1529 (2007).
  16. Sadler, K. E., Stratton, J. M., Kolber, B. J. Urinary bladder distention evoked visceromotor responses as a model for bladder pain in mice. J Vis Exp. (86), (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics