Procedimiento transuretral instilación en ratón macho adulto

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Immunology and Infection

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Summary

La instilación transuretral es un procedimiento difícil y no ha sido bien descrita en la literatura. El objetivo de este manuscrito es describir una técnica para la inserción transuretral de un catéter para la administración intravesical de líquidos con sustancias activas en la vejiga o la próstata en ratones macho adultos.

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Lee, S., Carrasco Jr., A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. Transurethral Instillation Procedure in Adult Male Mouse. J. Vis. Exp. (129), e56663, doi:10.3791/56663 (2017).

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Abstract

Instilación transuretral puede utilizarse para ofrecer diferentes soluciones con principios activos (p. ej., drogas, productos químicos, bacterias y virus) localmente en la vejiga urinaria para inducir modelos animales de patologías de vejiga o evaluar la efectividad de los tratamientos intravesical. Más roedores modelos de patologías de vías urinarias (LUT) inferiores son inducidos en ratones hembra debido a la facilidad de instilación intravesical de las sustancias a través de la uretra femenina. Sin embargo, debido a las diferencias anatómicas entre el LUT femenina y masculina, instilación transuretral en un ratón macho ha sido considerada un procedimiento muy difícil, y no se ha descrito previamente. En este manuscrito, nos proporcionan una descripción detallada de cómo preparar tubería de polietileno (PE) para la posterior inserción en la uretra de un ratón macho. Además, discutimos los tipos ideales de la tubería de PE a utilizar dependiendo del sitio deseado de la inoculación. Además, se describe punto por punto cómo preparar un animal para un exitoso instilación transuretral evitar lesiones en la uretra y asegurar la entrega de la solución a la ubicación deseada. El procedimiento es iniciado por retraer el prepucio y el glande para exponer la apertura del meato uretral. A continuación, el glande son tomados por Roma fórceps no machacar para estabilizar el pene y la tubería de PE. La tubería de PE se inserta por primera vez en el meatus uretral paralelo al cuerpo animal, entonces su ángulo está ajustado inclinando el catéter para maniobrarlo para seguir la curvatura natural de la uretra. Esta técnica puede utilizarse en modelos murinos inducidos de patologías de vejiga o evaluar la efectividad de los tratamientos intravesical en ratones machos.

Introduction

El enfoque de instilación transuretral se ha utilizado en estudios anteriores como uno de los métodos para crear modelos de roedores de vejiga patologías1,2,3,4 y puede usarse para evaluar la efectividad de los tratamientos locales entregados en ratones. Aunque los modelos animales no pueden recapitular completamente patologías humanas, identificación de los mecanismos subyacentes en los estudios animales proporciona una mejor comprensión de los trastornos humanos de LUT como síndrome de dolor de la cistitis intersticial, vejiga, neurogénico cistitis, cistitis autoinmune e inflamación prostática5.

El procedimiento transuretral instilación realizado en un ratón macho adulto es técnicamente más difícil que la instilación intravesical de un ratón hembra adulto6. La anatomía naturalmente curvada de la uretra masculina junto con su pequeño diámetro hace técnicamente difícil de lograr la inserción transuretral de un catéter. Por lo tanto, instrucciones detalladas para la inducción transuretral de ratón de la infección de vías urinarias6 y LUT inflamación7,8,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 vía el catéter insertado en la vejiga se esbozaron anteriormente para ratones femeninos solamente. Este manuscrito tiene como objetivo proporcionar una descripción paso a paso de la técnica de transuretral instilación de sustancias en los ratones machos incluyendo los clips de vídeo, imágenes e ilustraciones. Transuretral instilación variable pueden realizar procedimientos en un ratón macho adulto inocula similar al anteriormente descrito en el ratón hembra7 y combinado con técnicas adicionales tales como grabaciones de Electromiograma de respuestas visceromotor (VMR)16.

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Protocol

todos los procedimientos con animales, incluyendo el método y la duración de la anestesia, así como cuidados postoperatorios, se habla con un veterinario y aprobados por la atención institucional Animal y el Comité uso (IACUC) en el institución afiliada. En este manuscrito, todos los procedimientos se realizaron con 8 a ratones machos de 15 semanas de edad C57BL/6 y el protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales aprobadas por el IACUC en la Universidad de Colorado.

1. preparación de la tubería

Nota: para infundir el inóculo, una aguja conectada a la tubería de polietileno (PE) ( figura 1A) o un calibre pequeño (< 24 G) angiocatéter puede ser usado ( figura 1). El uso de un angiocatéter no requiere ninguna preparación excepto esterilización con 70% de etanol (EtOH). El inóculo es la sustancia que es inculcada/inyección/depositado en las vías urinarias. Esto puede ser una solución que contiene bacterias, virus o un químico. Esto se prepara antes de tiempo y por el protocolo de investigación. Por ejemplo, si el estudio pretende evaluar los efectos de la infección por e. coli en las vías urinarias inferiores, el investigador tendrá que preparar el inóculo que contiene bacterias, que pueden ser inoculados/instilado en las vías urinarias bajas.

  1. Preparación de la aguja unida a la tubería de PE es simple y consiste en lo siguiente: elegir el tamaño de la tubería de PE basado en el órgano Diana y la edad de un animal. Para animales menores de 12 semanas, utilice tubería de PE-10 (diámetro exterior es de 0,024 pulgadas y diámetro interior es de 0,011 pulgadas). Tubería de PE-10 sugiere para ser aplicable para (1) la siembra primaria de inóculo en el anterior (AP) de la próstata y las vesículas seminales (SV), o (2) la siembra primaria de inóculo en la vejiga de un animal de menos de 12 semanas de edad. Tubería de PE con un diámetro de hasta 50 PE (fuera de diámetro 0,038 pulgadas y diámetro hasta 0,023 pulgadas interior) puede ser utilizado para la siembra primaria de inóculo en la vejiga de los animales de mayores tamaño.
  2. Corte aproximadamente 2,5 pulgadas de tubería de PE.
  3. Seleccione la aguja que se ajuste el diámetro PE seleccionado para ser utilizado. Una aguja de 27 G puede caber en el lumen del tubo de PE-10, y una aguja de 22 G adapta a la luz del tubo de PE-50.
    1. Prepare la aguja antes de la inserción en la tubería de PE frotando el borde afilado de la aguja en una piedra de aceite disponible en el mercado ( figura 1A -B) que sea opaco, o usar un blunt comercialmente disponible aguja.
  4. Introducir la aguja embotada ( figura 1) en el lumen de la tubería de PE. Evitar daños en el lumen o entrada en un lumen falso asegurándose de que los restos de la aguja en el centro del lumen. ( figura 1 -E). Si la tubería de PE se daña durante la inserción de la aguja embotada, corte el extremo dañado y reiniciar el proceso.
  5. Coloque la tubería de PE conectado a la aguja en el 70% de EtOH para esterilización hasta su uso para el procedimiento. Descarga el 70% EtOH a través del tubo de PE de aguja para esterilizar la luz y allí es no hay fugas de la tubería de PE de daño durante el proceso de inserción de la aguja. Si hay fugas, desechar el tubo de la aguja-PE.
    Nota: La punta de la tubería de PE debe ser liso antes de cateterismo. Para evitar problemas con la introducción de la tubería de PE en la uretra, se recomienda cortar la punta de la tubería de PE inmediatamente antes del cateterismo ( Figura 1F). La longitud mínima sugerida de la tubería de PE es de 1,5 pulgadas, que incluye la parte que rodea la aguja.

2. Procedimiento de cateterismo

  1. antes de la inducción de la anestesia, vaciar la vejiga del ratón de.
    1. Aplicar presión suave y masaje a la parte inferior del abdomen del ratón. Estas maniobras suelen provocar micción espontánea. Una vejiga llena puede resultar en la dilución o pérdida inmediata cualquier inóculo instilado.
      Nota: Una opción adicional para asegurar una vejiga vacía en un ratón es privar a los animales de agua para al menos 1 hora antes del inicio del procedimiento transuretral instilación. Privación de agua debe ser aprobada por la institución como parte del protocolo animal.
  2. Usar una máquina de anestesia con isoflurano flujo (2%) para inducir anestesia.
    1. Una vez que el animal está anestesiado, colocarlo en una manta caliente y cubrirla con una almohadilla azul con su nariz dentro de una ojiva para el mantenimiento de la anestesia continua.
    2. Confirman que el animal está bajo anestesia comprobando el reflejo pedal (pellizco del dedo del pie).
  3. Una vez que el reflejo pedal está ausente, se procederá a retraer el prepucio.
    1. Prensa de la región pubiana con el pulgar y el dedo índice de una mano ( figuras 2A y 2B) y saque el pene las glándulas con el pulgar y el dedo índice de la otra (de la mano figura 2). Cuando esto se logra correctamente, el prepucio, glande y cuerpo del pene siendo expuestos. ( Figura 2D y figura 2F). No use pinzas para sacar pene glándulas como esto puede causar daños al tejido.
  4. Lubricar la punta del catéter y el glande con lubricante quirúrgico estéril antes de la inserción del catéter. Esto facilitará la inserción de la tubería de PE.
    Nota: Embalados individualmente plazas de lubricante quirúrgico, en vez de un tubo grande, se recomiendan para que cada uso, para mantener las condiciones de esterilidad.
  5. Sujete suavemente la punta del pene utilizando fórceps embotado y apretar suavemente el glande para causar el meato uretral abrir.
  6. Sostenga la jeringa con la aguja-tubería de PE o PE sí mismo de la tubería e inserte la tubería de PE a través del meato uretral.
    Nota: Un agarre trípode de la jeringa con la aguja unida PE-tubería o el PE tubería utilizando el pulgar, índice y dedos medios se recomienda estabilidad.
    Nota: El camino de la cateterización debe ser curvado debido a la curvatura natural de la uretra rodeada por el glande y cuerpo del pene en el ratón macho adulto, como se muestra en la Figura 3A y 3B de la figura. La tubería de PE urocultivo puede encontrar resistencia durante cateterismo, por lo tanto, se recomienda ajustar el ángulo inclinando el tubo de arriba o abajo ayuda avanzar el tubo PE al órgano Diana. Si es necesario, la tubería de PE puede girarse ligeramente para ayudar a maniobrar a través de las diferentes curvas de uretra. Cuando hay demasiada resistencia, la tubería debe ser hacia atrás y luego avanzar otra vez con una mínima presión. Tirar de la tubería de PE hacia fuera completamente y usando más lubricación puede ayudar.
  7. Realizar instilación del inóculo de una vez la tubería de PE ha llegado el órgano deseado empujando el émbolo de la aguja para el volumen del inóculo (volumen de 5-200 μL sugiere).
    1. Para la instilación del inóculo en la vejiga urinaria, avanzar en la tubería de PE hasta alrededor de 0,75 pulgadas de tubería de PE es insertado ( Figura 3A).
      Nota: para la instilación del inóculo en el AP y el SV, por lo general, thtubería e insertado cumple resistencia una vez que alcanza el punto de apertura hacia la próstata anterior. De ajuste del ángulo de inclinación del tubo hacia arriba o hacia abajo, la tubería de PE avanzará más lejos hasta aproximadamente 1 pulgada de la tubería de PE ha sido insertado ( figura 3B).

3. En Vivo Proyección de imagen del tracto urinario inferior y los riñones

Nota: el propósito de las imágenes en vivo de este manuscrito es: (1) para confirmar la localización espacial del inóculo; y (2) para evaluar la incidencia de reflujo del inóculo para la riñones. Para ello, se puede utilizar un ratón anestesiado o eutanasia.

  1. Para visualizar el tracto urinario inferior de un ratón macho adulto, realizar laparotomía de línea media abdominal baja para exponer la vejiga, próstata y vesículas seminales.
    1. Haga una incisión en la piel en la línea media del hueso púbico a justo debajo del proceso xifoides con unas tijeras.
    2. Elevar la piel de tejido subcutáneo.
    3. Identificar la linea avascular alba situado en la línea media y haga una incisión para acceder a la cavidad peritoneal donde se encuentran todos los órganos.
    4. Visualización de colorante azul o de otro agente de seguimiento adecuado para confirmar la localización espacial.

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Representative Results

Instilación transuretral de colorante azul a través de tubería de PE 50 dio lugar a la instilación de contraste en la vejiga urinaria (Figura 4A) y a través de 10 PE tubo de coloración de la SV y AP (Figura 4B), respectivamente. Para evaluar si la instilación transuretral realizada provoca un reflujo inmediato del inóculo a los riñones o no, el riñón y el uréter se observaron seguida por la instilación de 100 μl del colorante azul y colorante fluorescente (Figura 4A-B). Ninguno de lo procedimiento de instilación usando dos diferentes tamaños de tubería de PE y dos colorantes diferentes dio lugar a la coloración de los uréteres o los riñones.

Figure 1
Figura 1: Preparación para inserción en polietileno (PE) tubería 50 la aguja 22 G. La aguja (A) es molida contra una piedra de aceite (B) embotados los filos (C). Una vez que la aguja está embotada, la aguja se inserta en el lumen de la tubería de PE (D) y avanza sobre la aguja con pinzas finas (E). El tubo entonces se corta a aproximadamente 1,5 pulgadas (F). Angiocath 24 G (G) también puede ser utilizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Prepucio del macho ratón cubre el glande y meato uretral (A), con leve tracción del prepucio el glande puede ser expuesto (B) y con leve tracción del glande (C), el prepucio entero puede retraerse (D), así lo que permite fácil acceso en el meato uretral y la uretra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Ilustraciones de los órganos de tracto urinario inferiores; vejiga urinaria, próstata y vesícula seminal (SV) con instilación transuretral mediante tubería de PE 50 (A) y (B) de la tubería de PE 10 para la siembra primaria de la vejiga urinaria y próstata SV anterior, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes de los órganos del tracto urinario superior e inferior; riñones, vejiga, próstata y vesícula seminal (SV) después de la instilación transuretral mediante tubería de PE 50 (A) y (B) de la tubería de PE 10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este manuscrito describe detalladamente un método de instilación transuretral en ratón macho adulto. Área siembra primaria diferencial puede llegar mediante el uso de tubería de PE de diferentes diámetros. PE-50 se recomienda para llegar con éxito a la luz de la vejiga urinaria, mientras que un diámetro mayor que PE-10 se utiliza para llegar a la AP y la SV (Figura 3A-B). Además de la elección del tamaño de la tubería de PE y órgano Diana para la inoculación, otros factores como el volumen de inóculo inculcada, también desempeñan un papel en la ubicación final y la distribución de la solución. Nuestros experimentos demuestran que la instilación transuretral de 100 μl de azul tinte utilizando cualquiera de los dos PE-10 o 50 PE desencadenar el reflujo inmediato del tinte a los riñones. Sin embargo, el reflujo de orina a los riñones puede ocurrir durante el período después de la instilación y puede resultar en infección de los riñones, como fue demostrado previamente en ratones hembras adultos8. Por lo tanto, la evaluación histológica de los riñones es muy recomendable para confirmar la ausencia de contaminación indirecta de los riñones de instilaciones transuretrales.

Hay varios pasos claves importantes para llevar a cabo una exitosa instilación transuretral del inóculo. En primer lugar, la tubería de PE debe ser de una longitud suficiente — por lo menos de 2,5 pulgadas. Esto permitiría ajustes adicionales de la longitud de la tubería, si es necesario, durante el proceso de preparación de la tubería, o después de la instilación transuretral. Múltiples intentos y fracasos en el paso 9 de este protocolo pueden causar una obstrucción del extremo insertado de la tubería de PE por fluidos corporales. En esta situación, la punta de la tubería de PE se debe cortar para tener un claro Consejo para posteriores intentos. Una vez que se corta la punta de la tubería de PE, el lubricante quirúrgico debe ser vuelven a aplicar. En segundo lugar, un adecuado agarre de la jeringa o el PE tubería sí mismo aumentar la tasa de éxito. En tercer lugar, se debe insertar una suficiente longitud de la tubería de PE y el prepucio, glande y cuerpo del pene deben ser rígidamente alineados sin apretón de la mano durante el proceso de la cateterización. De lo contrario, reflujo del inóculo puede ocurrir cuando se empuja el émbolo de la jeringa.

Mejores resultados para el procedimiento transuretral instilación pueden ser consecuencia de la práctica acompañada de evitar daños en el órgano de la uretra y objetivo durante el procedimiento. Los resultados de rendimiento se pueden validar mediante el uso de colores de tintes o colorantes fluorescentes como el procedimiento para confirmar la localización primaria del inóculo y signos de reflujo a los riñones.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores no tienen ningún reconocimiento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 10 BD Medical 63019-004
BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 50 BD Medical 63019-048
BD Insyte-N Autoguard/ Angiocath BD Medical 311411
Ethanol (EtOH) Fisher Scientific BP2818500
BD Needle Only 22 Gauge (G) 1 inch Becton Dickson 205155
BD Needle Only 27 Gauge (G) 1/2 inch Becton Dickson 305129
Luer stub, 22 G X 0.5 in / Blunt Needle Instech LS22
Luer stub, 27 G X 0.5 in / Blunt Needle Instech LS27
6" Long x 2" Wide x 1" Thick, Aluminum Oxide Sharpening Stone / Oil Stone Norton 40204034
Surgical Lubricant Sterile Bacteriostatic Folilpac Surgilube 281020543
Isoflurane Fluriso 13985-528-60
SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System Kent Scientific SS-01
Dissecting Forceps, Curved vwr 82027-392
BD 1 ml Syringe BD Medical 309626
India Ink Solution., 0.2% in PBS buffer Alfa Aesar J61007
8~12 weeks old male C57B/6 Mice Jackson Lab #000664

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References

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