Procedura transuretrale instillazione in di topo maschio adulto

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Immunology and Infection

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Summary

Instillazione transuretrale è una procedura difficile e non è stato ben descritto nella letteratura. Lo scopo di questo manoscritto è quello di descrivere una tecnica per transuretrale inserzione di un catetere per consegna intravescicale di liquidi con sostanze attive nella vescica urinaria e/o della prostata nei topi del maschio adulto.

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Lee, S., Carrasco Jr., A., Meacham, R. B., Malykhina, A. P. Transurethral Instillation Procedure in Adult Male Mouse. J. Vis. Exp. (129), e56663, doi:10.3791/56663 (2017).

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Abstract

Transuretrale instillazione può essere utilizzato per fornire diverse soluzioni con principi attivi (ad es., farmaci, sostanze chimiche, batteri e virus) localmente nella vescica urinaria a indurre modelli animali di patologie della vescica o valutare la efficacia dei trattamenti intravesical. Più modelli di roditori di inferiore del tratto urinario (LUT) patologie sono indotte nei topi femmina dovuta alla facilità di instillazione intravescicale delle sostanze tramite l'uretra femminile. Tuttavia, a causa di differenze anatomiche fra il LUT maschili e femminili, transurethral instillazione in un topo maschio è stato considerato una procedura molto impegnativa, e non è stata precedentemente descritta. In questo manoscritto, forniamo una descrizione dettagliata di come preparare i tubi di polietilene (PE) per il successivo inserimento nell'uretra di un topo maschio. In più, discutiamo i tipi ideali di tubi PE da utilizzare a seconda del sito di inoculazione desiderato. Inoltre, descriviamo punto per punto come preparare un animale per un successo instillazione transuretrale evitare lesioni all'uretra e garantire la consegna della soluzione nella posizione desiderata. La procedura viene avviata da ritrarre il prepuzio e il glande per esporre l'apertura del meato uretrale. Successivamente, il glande sono afferrati dal forcipe smussato non schiacciare per stabilizzare il pene e i tubi di PE. I tubi di PE prima viene inserito nel meato uretrale parallelo al corpo animale, quindi l'angolo è regolato inclinando il catetere per manovrare per seguire la naturale curvatura dell'uretra. Questa tecnica può essere utilizzata per indotti modelli murini di patologie della vescica e/o valutare l'efficacia dei trattamenti intravesical in di topo maschio.

Introduction

L'approccio di instillazione transuretrale è stato utilizzato negli studi precedenti come uno dei metodi per creare modelli del roditore di vescica patologie1,2,3,4 e può essere utilizzato per valutare la efficacia dei trattamenti localmente trasportati nei topi. Anche se i modelli animali non possono completamente ricapitolare patologie umane, identificazione dei meccanismi sottostanti negli studi sugli animali fornisce una migliore comprensione dei disordini LUT umani come la sindrome di dolore di cistite interstiziale, neurogena cistite, cistite autoimmune e infiammazione prostatica5.

La procedura transurethral instillazione effettuata su un topo maschio adulto è tecnicamente più complessa rispetto all'instillazione intravescicale in un topo adulto femmina6. L'anatomia naturalmente curva dell'uretra maschio insieme al suo piccolo diametro lo rendono tecnicamente difficile da realizzare l'inserzione di un catetere transuretrale. Di conseguenza, istruzioni dettagliate per l'induzione transuretrale di di infezione delle vie urinarie del mouse6 e LUT infiammazione7,8,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 via catetere della vescica-inserito precedentemente sono stati delineati per topi femmina solo. Questo manoscritto mira a fornire una descrizione dettagliata della tecnica per instillazione transuretrale di sostanze in di topo maschio, compreso la video clip, immagini e illustrazioni. Transuretrale instillazione procedure in un topo maschio adulto possono essere eseguite con variabile inoculates simile a quello precedentemente descritto in mouse femminile7 e si fuse con altre tecniche quali registrazioni di elettromiografia di visceromotor risposte (VMR)16.

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Protocol

tutte le procedure con gli animali, tra cui il metodo e la durata dell'anestesia, come pure la cura postoperatoria, sono state discusse con un veterinario e approvate dalla istituzionale animale cura ed uso Committee (IACUC) presso la istituzione affiliata. In questo manoscritto, tutte le procedure sono state eseguite con 8 a di topo maschio C57BL/6 di 15-settimana-vecchio e il protocollo segue le linee guida di cura degli animali approvate dal IACUC presso l'Università del Colorado.

1. preparazione di tubi

Nota: per infondere l'inoculo, un ago inserito per i tubi di polietilene (PE) ( Figura 1A) o un piccolo calibro (< 24 G) angiocatheter può essere usato ( Figura 1). L'uso di un angiocatheter non richiede preparazione diverso da sterilizzazione con 70% di etanolo (EtOH). L'inoculo è la sostanza che è instillato/iniettato/depositato nell'apparato urinario. Può trattarsi di una soluzione contenente batteri, virus o una sostanza chimica. Questo è preparato prima del tempo e per il protocollo di ricerca. Ad esempio, se lo studio mira a valutare gli effetti di e. coli infezione del tratto urinario inferiore, il ricercatore dovrà preparare l'inoculo contenente batteri, che possono essere inoculati/instillato nel tratto urinario inferiore.

  1. Preparazione dell'ago collegato al tubo di PE è semplice e consiste dei seguenti: scegliere la dimensione della tubazione PE sulla base dell'organo bersaglio e l'età di un animale. Per un animale di età inferiore a 12 settimane, utilizzare un tubo di PE-10 (diametro esterno è 0,024 pollici e diametro interno è 0,011 pollici). Tubi PE-10 sono suggerito per essere applicabile per (1) la semina primario dell'inoculo nella prostata anteriore (AP) e vescicole seminali (SV), o (2) la semina primario dell'inoculo nella vescica di un animale di età inferiore a 12 settimane di età. Tubi in PE con diametro maggiore di fino alla taglia 50 PE (diametro esterno fino a 0,038 pollici e diametro fino a 0,023 pollici interno) può essere utilizzato per la semina primario dell'inoculo nella vescica dei più vecchi animali.
  2. Tagliare circa 2,5 pollici di tubi PE.
  3. Selezionare un ago che misura il diametro di PE selezionato per essere utilizzato. Un ago da 27 G può andare bene nel lume del tubo PE-10, e un ago 22G si inserisce il lume del tubo PE-50.
    1. Preparare l'ago prima dell'inserimento nel tubo PE sfregando il bordo tagliente dell'ago su una pietra ad olio disponibile in commercio ( Figura 1A -B) per renderlo noioso, o utilizzare un blunt commercialmente disponibile f.
  4. Introdurre l'ago sordo ( Figura 1) nel lume del tubo PE. Evitare di danneggiare il lume o entrata in un lumen falso assicurando i resti dell'ago al centro del lume. ( Figura 1 -E). Se i tubi di PE sono danneggiato durante l'inserimento dell'ago sordo, tagliare l'estremità danneggiata e riavviare il processo.
  5. Inserire i tubi di PE ago inserito nel 70% di EtOH per sterilizzazione fino al suo utilizzo per la procedura. Flush il 70% EtOH attraverso il tubo dell'ago-PE per sterilizzare il lume e garantire non c' non è nessuna perdita dal tubo PE da danni durante il processo di inserimento dell'ago. Se c'è dispersione, scartato il tubo dell'ago-PE.
    Nota: La punta del tubo PE deve essere liscia prima del cateterismo. Per evitare problemi con l'introduzione del tubo PE nell'uretra, si consiglia di tagliare la punta del tubo PE immediatamente prima del cateterismo ( Figura 1F). La lunghezza minima consigliata del tubo PE è 1,5 pollici, che comprende la parte che circonda l'ago.

2. Procedura di cateterizzazione

  1. prima dell'induzione dell'anestesia, svuotare la vescica di mouse.
    1. Applicare una leggera pressione e massaggio all'addome inferiore del mouse. Queste manovre in genere causare minzione spontanea. Una vescica piena può provocare la diluizione o la perdita immediata qualsiasi infuso inoculo.
      Nota: Un'opzione aggiuntiva per garantire una vescica vuota in un mouse è di privare l'animale d'acqua per almeno 1 ora prima dell'inizio della procedura transuretrale instillazione. Privazione dell'acqua deve essere approvata dall'istituzione come parte del protocollo animali.
  2. Utilizzare una macchina di anestesia con isoflurano flusso (2%) per indurre anestesia.
    1. Una volta che l'animale è anestetizzato, posizionarlo su una coperta calda riscaldamento e coprirlo con un pad blu con il naso all'interno di una punta conica per il mantenimento dell'anestesia continua.
    2. Confermare che l'animale è in anestesia controllando il riflesso pedale (pizzico di punta).
  3. Una volta che il pedale riflesso è assente, procedere ritraendo il prepuce.
    1. Stampa la regione pubica con il pollice e il dito indice di una mano ( figure 2A e 2B) e tirare fuori il pene di ghiandole utilizzando il pollice e il dito indice di altra mano ( Figura 2). Quando questa operazione viene eseguita correttamente, il prepuzio, glande e il corpo del pene rimangono esposte. ( Figura 2D e Figura 2F). Non utilizzare pinze per tirare fuori il pene di ghiandole come questo si tradurrà in danni al tessuto.
  4. Lubrificare la punta del catetere e il glande con lubrificante chirurgico sterile prima dell'inserimento del catetere. Questo faciliterà l'inserimento della tubazione PE.
    Nota: Singolarmente confezionati piazze di lubrificante chirurgico, invece di un condotto più largo, sono consigliate per ogni uso, per mantenere condizioni di sterilità.
  5. Premere delicatamente la punta del pene usando il forcipe noioso e spremere delicatamente il glande per causare il meato uretrale aprire.
  6. Tenere la siringa con l'ago inserito PE-tubazione o PE della tubazione stessa e inserire il tubo di PE tramite il meatus uretra.
    Nota: Per stabilità, è consigliabile una presa treppiede della siringa con l'ago inserito PE-tubazione o il PE tubi se stessa utilizzando il pollice, indice e le barrette centrali.
    Nota: Il percorso di cateterizzazione dovrebbe essere curvato dovuto alla naturale curvatura dell'uretra circondato dal pene di glans e il corpo del pene nel topo maschio adulto, come mostrato in Figura 3A e 3B di figura. I tubi di PE cateterizzato possono incontrare la resistenza durante la cateterizzazione, pertanto, si raccomanda di regolare l'angolo inclinando il tubo verso l'alto o verso il basso per aiuto anticipato i tubi di PE a seguito dell'organo bersaglio. Se necessario, i tubi di PE possono essere leggermente ruotato per aiutarlo manovra attraverso i vari tornanti dell'uretra. Quando c'è troppa resistenza, il tubo dovrebbe essere tirato indietro e quindi avanzare di nuovo con una pressione minima. Tirando il PE-tubo fuori completamente e usando maggiore lubrificazione può essere utile.
  7. Eseguire instillazione dell'inoculo, una volta che il PE-tubo ha raggiunto l'organo desiderato premendo lo stantuffo dell'ago per instillare il volume desiderato dell'inoculo (5-200 µ l di volume è suggerito).
    1. Per instillazione dell'inoculo nella vescica urinaria, avanzare la tubazione PE sino a circa 0,75 pollici di tubi di PE è inserita ( Figura 3A).
      Nota: per instillazione dell'inoculo in AP e SV, generalmente, the inserita la tubazione incontra resistenza una volta che raggiunge il punto di apertura nella prostata anteriore. Regolando l'angolo inclinando il tubo verso l'alto o verso il basso, i tubi di PE avanzerà ulteriormente fino a circa 1 pollice di tubi di PE è stato inserito ( Figura 3B).

3. In Vivo Imaging del tratto urinario inferiore e reni

Nota: lo scopo dell'imaging in vivo in questo manoscritto è: (1) per confermare la localizzazione spaziale dell'inoculo; e (2) per valutare l'incidenza del reflusso dell'inoculo per la reni. Per questo scopo, può essere utilizzato sia un mouse anestetizzato o euthanized.

  1. Per visualizzare il tratto urinario inferiore di un topo maschio adulto, eseguire inferiore laparotomia mediana addominale per esporre la vescica, prostata e vescicole seminali.
    1. Incise la pelle nel midline dall'osso pubico appena sotto il processo xifoideo utilizzando forbici.
    2. Elevare la pelle di dosso il tessuto sottocutaneo.
    3. Identificare la linea avascolare alba situata nel midline ed incise per entrare nella cavità peritoneale, dove si trovano tutti gli organi.
    4. Confermare la localizzazione spaziale da visualizzazione del colorante blu o un altro agente di rilevamento adatto.

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Representative Results

Transuretrale instillazione di colorante blu tramite tubazione PE 50 provocato instillazione del colorante nella vescica urinaria (Figura 4A) e via PE 10 tubi in colorazione della SV e AP (Figura 4B), rispettivamente. Per valutare se l'instillazione transuretrale eseguito provoca un reflusso istantanea dell'inoculo ai reni o non, del rene e dell'uretere sono stati osservati seguita da instillazione di 100 µ l del colorante blu e tintura fluorescente (fig. 4A-B). Nessuno della procedura instillazione utilizzando due diverse misure di tubi di PE e due differenti tinture ha provocato la colorazione della ureteri o reni.

Figure 1
Figura 1: Ago 22 G preparazione per l'inserimento in polietilene (PE) tubi 50. L'ago tagliente (A) è macinato contro una pietra ad olio (B) per attenuare i bordi taglienti (C). Una volta che l'ago è noioso, l'ago è inserito nel lume del tubo PE (D) e avanzata sopra l'ago con una pinzetta (E). Il tubo viene poi tagliato a circa 1,5 pollici (F). 24 G angiocath (G) può anche essere utilizzato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Prepuzio di topo maschio copre il glande e meato uretrale (A), con leggera trazione del prepuce il glande può essere esposto (B), e con leggera trazione del glande (C), può essere l'intero prepuzio retratto (D), così consentendo un facile accesso al meato uretrale e uretra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Illustrazioni degli organi del tratto urinario inferiori; vescica urinaria, prostata e vescichetta seminale (SV) mostrando instillazione transuretrale utilizzando tubi di PE 50 (A) e tubi PE 10 (B) per il seeding primario della vescica urinaria e SV/anteriore della prostata, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Immagini degli organi del tratto urinario inferiore e superiore; reni, vescica urinaria, prostata e delle vescicole seminali (SV) dopo instillazione transuretrale utilizzando tubi di PE 50 (A) e tubi PE 10 (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo manoscritto descrive in dettaglio un metodo di transurethral instillazione in di topo maschio adulto. Differenziale zona primaria di semina è raggiungibile utilizzando PE tubi di diverso diametro. PE-50 è consigliato per raggiungere con successo il lume della vescica urinaria, mentre un più grande diametro che PE-10 viene utilizzato per raggiungere l'AP e SV (Figura 3A-B). Oltre alla scelta del formato della tubazione PE e organo bersaglio per inoculazione, altri fattori, quali il volume dell'inoculo infuso, anche svolgono un ruolo nella posizione di fine e distribuzione della soluzione. I nostri esperimenti dimostrano che l'instillazione transuretrale di 100 µ l di blu tingere usando entrambi PE-10 o PE-50 non fa scattare il reflusso istantaneo dei coloranti per i reni. Tuttavia, il riflusso di urina ai reni può accadere durante il periodo post-instillazione e potrebbe causare infezione renale, come precedentemente è stato indicato in topi femmina adulti8. Pertanto, la valutazione istologica dei reni è altamente raccomandata per confermare l'assenza di contaminazione indiretta dei reni da instillazioni transurethral.

Ci sono diversi passaggi chiave importanti per eseguire un successo instillazione transurethral dell'inoculo. In primo luogo, i tubi di PE dovrebbero essere di una lunghezza sufficiente — almeno 2,5 pollici. Ciò consentirebbe per ulteriori regolazioni della lunghezza della tubazione, se necessario, durante il processo di preparazione di tubi, o seguendo la procedura transurethral instillazione. Più tentativi e fallimenti durante passaggio 9 del presente protocollo possono causare un blocco di fine inserito il tubo di PE di fluidi corporei. In questo caso, la punta del tubo PE deve essere tagliata per avere un suggerimento chiaro per i tentativi successivi. Una volta che la punta del tubo PE viene tagliata, il lubrificante chirurgico dovrebbe essere applicato nuovamente. In secondo luogo, una corretta impugnatura della siringa o PE tubi sé aumentare il tasso di successo. In terzo luogo, una sufficiente lunghezza del tubo PE deve essere inserita e il prepuzio, glande e il corpo del pene devono essere rigidamente allineati senza impugnatura durante il processo di cateterizzazione. In caso contrario, riflusso dell'inoculo può accadere quando si spinge lo stantuffo della siringa.

Migliori risultati per la procedura transurethral instillazione possono essere un risultato di pratica accompagnata da evitando di danneggiare l'organo uretra e destinazione durante la procedura. I risultati delle prestazioni possono essere convalidati utilizzando tinture colorate o tinture fluorescenti come la procedura per confermare la localizzazione primaria dell'inoculo e segni di reflusso ai reni.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori non hanno alcun acknowledgement.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 10 BD Medical 63019-004
BD INTRAMEDIC Polyethylene Tubing/ PE 50 BD Medical 63019-048
BD Insyte-N Autoguard/ Angiocath BD Medical 311411
Ethanol (EtOH) Fisher Scientific BP2818500
BD Needle Only 22 Gauge (G) 1 inch Becton Dickson 205155
BD Needle Only 27 Gauge (G) 1/2 inch Becton Dickson 305129
Luer stub, 22 G X 0.5 in / Blunt Needle Instech LS22
Luer stub, 27 G X 0.5 in / Blunt Needle Instech LS27
6" Long x 2" Wide x 1" Thick, Aluminum Oxide Sharpening Stone / Oil Stone Norton 40204034
Surgical Lubricant Sterile Bacteriostatic Folilpac Surgilube 281020543
Isoflurane Fluriso 13985-528-60
SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System Kent Scientific SS-01
Dissecting Forceps, Curved vwr 82027-392
BD 1 ml Syringe BD Medical 309626
India Ink Solution., 0.2% in PBS buffer Alfa Aesar J61007
8~12 weeks old male C57B/6 Mice Jackson Lab #000664

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References

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