Studie av i Vivo glukose metabolisme i fettrikt kosthold-matet mus muntlig glukose toleranse Test (OGTT) og Insulin toleranse Test (ITT)

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Gjeldende artikkelen beskriver generasjon og metabolske karakteristikk av fettrikt kosthold-matet mus som en modell av diett-indusert insulinresistens og fedme. Det har videre detaljerte protokoller for å utføre oral glukose toleranse test og insulin toleranse test, overvåking hele kroppen endringer av glukose metabolisme i vivo.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nagy, C., Einwallner, E. Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). J. Vis. Exp. (131), e56672, doi:10.3791/56672 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fedme representerer den viktigste risiko faktoren i patogenesen av type 2 diabetes, en sykdom som er preget av en motstand mot insulin-stimulert glukose opptak og en brutto decompensation av systemisk glukose metabolisme. Til tross for betydelig fremgang i forståelsen av glukose metabolisme fortsatt molekylære mekanismer av sin regulering i helse og sykdom under-undersøkt, mens romanen tilnærminger for å forebygge og behandle diabetes er presserende nødvendig. Kosthold avledede glukose stimulerer bukspyttkjertelen sekresjon av insulin, som fungerer som den viktigste regulatoren av mobilnettet anabole prosesser under matet-staten og dermed balanserer blodsukker nivåer for å opprettholde systemisk energi status. Kronisk overfeeding utløsere meta-betennelse, noe som fører til endringer i eksterne insulin receptor-assosiert signalisering og dermed reduserer følsomhet for insulin-mediert glukose disposisjon. Disse hendelsene til slutt føre til forhøyet fastende glukose og insulin nivåer samt en reduksjon i glukosetoleranse, som i sin tur fungerer som viktige indikatorer for insulinresistens. Her presenterer vi en protokoll for generasjon og metabolske karakteristikk av fettrikt kosthold (HFD)-matet mus som brukte modell av diett-indusert insulinresistens. Vi illustrere i detalj muntlig glukose toleranse test (OGTT), som overvåker ekstern avhending av en muntlig-administrert glukose belastning og insulin sekresjon over tid. I tillegg presenterer vi en protokoll for insulin toleranse test (ITT) for å overvåke hele kroppen insulin handling. Sammen representerer disse metodene og nedstrøms programmene kraftige verktøy som karakteriserer de generelle metabolske fenotypen av mus samt som spesielt vurdere endringer i glukose metabolisme. De kan være spesielt nyttig i feltet bred forskning av insulinresistens, diabetes og fedme å gi en bedre forståelse av patogenesen samt teste effekten av terapeutisk intervensjon.

Introduction

I den utviklede verden nådd fedme og diabetes epidemiske dimensjoner fysisk inaktivitet og overflødig forbruket av bearbeidet mat, effekter som er drevet av rask urbanisering, industrialisering samt globalisering. Selv om forskning på insulinresistens og det Co-morbidities, som hyperlipidemi og åreforkalkning, fått publisitet i løpet av de siste tiårene, de komplekse biologiske mekanismene som regulerer stoffskiftet i helse og sykdom fortsatt ufullstendig forstått og det er fortsatt et presserende behov for nye behandlingsmetoder å forebygge og behandle disse sykdommer1.

Insulin, og det er counter-regulatory hormon glukagon tjene som viktigste regulatorer av celleenergien tilbud og macronutrient balanse, dermed også opprettholde riktig systemisk blod glukose konsentrasjoner2. Glukose selv fungerer som en av de viktigste stimulators på insulinsekresjon av bukspyttkjertelen β-celler, mens andre makronæringsstoffer, Humorale faktorer samt nevrale inn ytterligere endre dette svaret. Insulin utløser følgelig anabole prosessene av matet av lette spredningen av overskytende blod glukose i muskler og fett celler og ytterligere aktivere Glykolysen samt protein- eller fettsyrer syntese, henholdsvis. I tillegg undertrykker insulin hepatic glukose utdata ved å hemme Glukoneogenesen. Kronisk overflødig energiforbruk og meta-betennelse føre til hyperinsulinemia og eksterne insulinresistens på grunn av ned-reguleringen av insulin reseptor uttrykk, samt endringer i nedstrøms signalveier, dermed resulterer i svekket følsomhet for insulin-mediert glukose disposisjon samt utilstrekkelig hemming av hepatic glukose, produksjon,3,,4,,5,,6.

En rekke dyr modeller med genetisk, ernæringsmessige eller eksperimentelle induksjon av sykdommen har vist seg for å være utmerket verktøy for å studere molekylære mekanismer av insulinresistens og ulike former for diabetes samt de tilhørende sykdommer7 . Et godt eksempel er mye brukt og godt etablert HFD-indusert musen modellen, som er preget av rask vektøkning på grunn av økt inntak i kombinasjon med redusert metabolsk effektivitet, noe som resulterer i insulin resistens8, 9. både i dyremodeller og mennesker, en høyde i faste blod glukose og insulin nivåer, samt en nedsatt toleranse til glukose administrasjon er brukte indikatorer på insulinresistens og andre systemisk endringer av glukose metabolisme. Overvåking blod glukose og insulin nivåer på basale staten eller etter stimulering er derfor lett tilgjengelig readouts.

Nåværende protokollen skisserer generering av HFD-matet mus samt to brukte metoder, muntlig glukose toleranse test (OGTT) og insulin resistens test (ITT), som er nyttig å karakterisere metabolske fenotypen og undersøke endringer i glukose metabolisme. Vi beskriver OGTT i detalj, som vurderer salg av en muntlig-administrert glukose belastning og insulin sekresjon over tid. Videre, vi gir instruksjoner om hvordan å gjennomføre ITT for å undersøke hele kroppen insulin handling ved å overvåke blod glukose konsentrasjon svar på bolus av insulin. Protokollene som beskrevet i denne artikkelen er godt etablert og har blitt brukt i flere studier10,11,12. I tillegg til små endringer som kan bidra til å øke suksess, gir vi retningslinjer for eksperimentell design og analyse, samt nyttige tips å unngå potensielle feller. Protokollene beskrevet her kan være svært kraftig verktøy for å undersøke påvirkning av genetiske, farmakologiske, kosttilskudd og andre miljømessige faktorer på hele kroppen glukose metabolisme og dens tilknyttede lidelser som insulinresistens. I tillegg til stimulering med glukose eller insulinresistens, kan en rekke andre forbindelser brukes til stimulering avhengig av formålet med personlige forskning. Selv om du er utenfor omfanget av dette manuskriptet, kan mange andre nedstrøms programmer utføres på trukket blodprøvene, som analyse av blod verdier enn glukose og insulin (f.eks, lipid og lipoprotein profiler) og detaljert analyse av metabolske markører (f.ekskvantitative sanntid Polymerase kjedereaksjon (PCR), Western blot analyse og Enzyme-Linked Immunosorbent analysen (ELISA)). Videre flow cytometri og fluorescens aktivert celle sortering (FACS) brukes til å undersøke effektene i forskjellige enkelt celle populasjoner, mens transcriptomic, proteomic og metabolomic tilnærminger kan også benyttes for uønskede analyse.

Total, vi gir en enkel protokoll for å generere en HFD-indusert musemodell, mens ytterligere beskriver to kraftige tilnærminger for å studere hele kroppen metabolske forandringer, OGTT og ITT, som kan være nyttige verktøy for å studere sykdom patogenesen og utvikle nye terapier, spesielt innen stoffskifte-assosiert sykdommer som insulinresistens og diabetes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av Animal Care og bruk komité medisinsk Universität Wien og gjennomført i henhold til Federation av europeiske laboratorium dyr Science foreninger (FELASA). Vær oppmerksom på at alle prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen skal bare utføres etter institusjonelle og offentlige godkjenning og ansatte som er teknisk dyktig.

1. HFD-matet mus

Merk: Opprettholde alle C57BL/6J mus på en 12-h lys/mørke syklus med gratis tilgang til mat og vann.

  1. For 6 ukens av alderen, plasserer du mus i 8-12 uker på en HFD (40-60% fett kalorier) å indusere fedme, mens fôring mager kontrollgruppen fettfattig diett (Hanne Cathrine) (10% fett kalorier).
  2. Bestemme kroppsvekten av musene på ukentlig basis. Vekt kurvene skal vise lignende mønstre i begge gruppene, med en høyere bakken i gruppen HFD-matet.

2. OGTT

Merk: Hvis blod prøvepunkter tid er valgt under OGTT hvert 15 min, eksperimentet bør utføres med maksimalt 15 mus parallelt for å ha minst 1 min håndtering-tid per musen.

  1. Forberedelser dagen før OGTT
    1. Overføre mus til et bur med friskt sengetøy og rask dem over natten før testing (14 h), samtidig som man sikrer at mus har tilgang til drikkevann (f.eksfjerne maten på 6:00 i starttid på neste morgen kl 8:00).
      Merk: Faste mus over natten er standard tilnærming, men en kortere rask (5-6 h) er mer fysiologiske for mus (se diskusjon for detaljer).
  2. Forberedelser på dagen av eksperimentet (men før eksperimentet)
    1. Forberede 10 mL av 20% glukose løsning (oppløse D-(+)-glukose i destillert vann).
      Merk: Alle reagenser som administreres til dyrene må være farmakologiske klasse og sterile.
    2. Forberede en 96-brønns plate plasma samling, ved å fylle en brønn for hvert tidspunkt for prøvetaking og hver, med 5 µL NaEDTA (0,5 M EDTA, pH 8.0 i 0,9% NaCl, lagring på RT). Under eksperimentet, kan du lagre denne platen på is.
      Merk: Se utfyllende figur 1 for en detaljert sjekkliste.
  3. Måle kroppsvekten av alle mus og merke halene med en permanent penn for å gjøre musene lett identifiserbar (f.eksmus 1 = 1 dash, mus 2 = 2 streker, osv).
  4. Glukose måling og blod prøvetaking (figur 2)
    1. Nøye klipp av 1-2 mm halen tips med skarp saks (Variant A"i figur 2). Tørk alltid av første dråpe blod å unngå hemolyse eller forurensning med vev væske før du tar new blodprøver for blod glukose vilje. Tegne en liten blodprøve (~ 3 µL) for måling av de basale blodsukkernivå (= tidspunkt 0) med glukosemåler.
      FORSIKTIG: Kontroller og Juster kostnad nummeret strimmelen på en glucosemåler.
      Merk: Som en alternativ blod sampling metoden, nick lateral hale åre mus med skarpe skalpell blad (Variant B"i figur 2). Lateral hale venen er vanligvis tilgjengelig omtrent en tredjedel langs halen fra halen spissen, flytte mot bunnen av halen for flere eksempler. Bruk av en lokal bedøvelse krem anbefales. Stoppe blodstrømmen ved å bruke finger press på bløtvev minst 30 s før dyret returneres til buret sitt.
    2. Samle en blodprøve (rundt 30 µL) med en frisk kapillær tube (hold kapillær tube horisontale). Tømme kapillær røret med en pipette ved å sette pipette spissen på toppen av kapillær røret slutten og forsiktig skyve samlet blod inn i en brønn av 96-brønns plate, samtidig unngå luftbobler. Gjenta dette for alle mus - en om gangen.
      Merk: Som et alternativ for blodgivning via en kapillær tube, bruke en pipette justert til riktig volum (f.eks, 30 µL) å samle blod eller samle en dråpe blod fra halen på parafin film og Pipetter det i EDTA-løsningen. Strengt unngå kontakt av petroleum gelé med blod eller glukosemåler strimmelen, da det kan påvirke påfølgende glukose og insulin målinger.
      FORSIKTIG: OGTT er svært belastende for mus: mager mus kan miste rundt 15% av deres kroppsvekt under en natts rask. I tillegg fører blod prøvetaking på ulike tidspunkt til betydelige tap av blod. For lettere blod prøvetaking er det mulig å nøye massasje mouse-tail med vaselin.
      Merk: Institusjonelle retningslinjer kan begrense tillatte mengden blod hentes innenfor en bestemt periode. Prøvetaking volumer og timepoints bør justeres ikke overstige maksimumsgrensene som er tillatt. Kroppsvekten av musene skal brukes til å beregne totalen blod uttak tillatt.
  5. Beregne den nødvendige mengden glukose løsning kroppsvekt (1 g glukose/kg kroppsvekt, dette kan økes til 3 g/kg) skal administreres av muntlig gavage for hver musen. For eksempel må en mus med en kroppsvekt på 30 g 150 µL av en 20% glukose løsning å administrere 30 mg av glukose.
    Merk: Hvis du vil basere dosen av glukose på vekten av musen er standard prosedyre. Hvis kroppen sammensetning data er tilgjengelige, dosen av glukose for OGTT skal beregnes basert på lean body mass (se diskusjon for detaljer).
  6. Glukose administrasjon
    1. Forberede everythingthat kreves under hele eksperimentet på forhånd (classes, eksperimentet posten ark, glukose skjermen og strimler, kapillærene, sprøyter, glukose løsning, 96-brønns plate, skalpell, kalkulator, balanse, permanent markør, benk papirer, en Pipetter med et tips og hansker).
    2. For glukose program, kan du holde musen av fast fatte den av scruff. Bruke nok fasthet huden rundt halsen å forebygge musen fra vri av holde og riktig vippe hodet tilbake. Kontroller også at musen kan puste riktig.
      Merk: Når glukose administrasjon er startet, god tid ledelse er svært viktig.
    3. Nøye administrere glukose løsningen (basert på trinn 2.5) direkte inn i magen bruker en fôring nål. Forsiktig direkte fôring nålen gjennom munnen mot spiserøret. Tillate musen å svelge nålen: nålen helt synker til lavere esophagus/magen av mus. Deretter injisere glukose løsningen (figur 3a).
      1. Hvis ingen motstand er oppfylt eller hvis dyret sliter umiddelbart, trekke nålen og flytte den. Starte tidtakeren umiddelbart etter den første gavage og administrere glukose til alle andre mus i 1 minutt intervaller.
        Merk: Det kan være nyttig å bruke en dråpe glukose løsning direkte fra fôring nålen til munningen av musen, som vil stimulere slikker og svelge, dermed tilrettelegge enklere innsetting av fôring nålen. Gjelde ikke press ved innsetting fôring nålen som dette kan alvorlig skade dyr.
  7. Etter 15 min., måle blodsukker med glukosemåler og dessuten ta blodprøver (~ 30 µL) (som beskrevet i detalj i trinn 2.4) hver mus i samme rekkefølge som de ble injisert.
    Merk: Tid ledelse er svært viktig. Følg så tett som mulig å bruke de samme tidsintervallene for gavage. La mus flytte så fritt som mulig og grense påbud til et minimum under hele prosedyren å redusere stress, noe som kan endre resultatet. Melk halen med én hånd og samle blod med den andre.
  8. Gjenta trinn 2.7 på valgt tidspunkt avhengig av forventede resultater (f.ekspå 30, 45, 60, 90, 120, 150 og 180 min etter glukose administrasjon). Hvis de valgte punktene er lengre enn 120 min, kontrollerer du at mus har tilgang til drikkevann. Kontroller at mus har alltid tilgang til drikkevann. Når ferdig med eksperimentet, tilbake mus til deres hjem burene utstyrt med mat og vann.
    FORSIKTIG: OGTT er svært utmattende for mus. Derfor vente minst 1 uke før neste metabolske test, som en ITT.
  9. Etter eksperimentet sentrifuge blodprøver på 2500 x g, 30 min, 4 ° C. Overføre nedbryting (plasma) tomme brønner av plate og lagre det på 20 ° C før analysen.
    1. Registrere hemolyse prøvene hvis det finnes (se avsnitt 3).
  10. Bestemme plasma insulin nivåer ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig ELISA kit (se Tabell for materiale) følger produsentens instruksjoner i pakken.
    Merk: Avhengig av faste staten og metabolismen av de undersøkte mus, vanskeligheter under denne analysen kan oppstå: overnatting faste insulin nivåer (tidspunkt 0) er svært lav og derfor nær oppdagelsen grensen. For å unngå dette problemet, doble antallet anbefalte plasma volum og tilsvarende halvere resultatet av ELISA-analysen. På den annen side, hvis mus når insulin toppen under OGTT, spesielt i HFD-matet mus, insulin nivåer kan overskride Deteksjonsgrensen på: fortynne prøven (f.eks10 ganger med 0,9% NaCl) og gjenta ELISA-analysen. Hemolyse i plasmaprøver kan føre til nedbrytning av insulin, noe som resulterer i en reduksjon av avlesning verdier. Nedbrytning avhenger av tid og temperatur hemoglobin konsentrasjon i utvalget. Hold alltid hemolyzed prøver kaldt eller på is å redusere insulin degradering.

3. ITT

Merk: De samme forholdsreglene på OGTT (håndtering av mus, blod, glukosemåler og petroleum gelé bruk) må også brukes når du utfører ITT. For eksempel skal alle injeksjoner utføres innen 15 min i 1 minutt intervaller hvis 15 mus er testet i parallell. For ITT er etterfølgende samling av blodprøver med kapillær rør valgfritt.

  1. Forberedelser før eksperimentet
    1. Rask mus for minst 2 timer før insulininjeksjon, samtidig som man sikrer at mus har tilgang til drikkevann (f.eksfjerne mat på 8:00, teste mus 2-5 h senere).
    2. Fortynne insulin 1:1,000 i 0,9% NaCl (lager: 100 U/mL insulin, arbeider konsentrasjon 0,1 U/mL) og forberede 20% glukose (D-(+)-glukose løsning oppløst i destillert vann) gis hvis musene blir hypoglycemic.
      Merk: ITT utføres vanligvis etter en kort rask å unngå hypoglykemi som ellers kan oppstå i natten fastet dyr. Reagenser som administreres til dyrene må være farmakologiske klasse og sterile.
  2. Måle kroppsvekt mus, merke hale, klippe halen tuppen med skarp saks og måle basal blodsukkernivået som beskrevet tidligere for OGTT i trinn 2.4.
  3. Insulininjeksjon
    1. Å injisere insulin intraperitoneally (0,75 U insulin/kg kroppsvekt, beregnet på forhånd), holde musen av scruff metoden.
    2. Bruk en frisk, sterile 27 eller 30 måle pinne for hvert dyr å unngå ubehag og risikoen for eventuelle infeksjoner som blir injeksjonsstedet.
      Merk: Sterilisering av huden kan forlenge varigheten av insulin administrasjon, og dermed kan forårsake ekstra forstyrrelser til dyret. Derfor er det ikke anbefalt.
    3. Vippe mus hodet ned i en liten vinkel å avsløre den ventral siden av dyret. Plass den steril nål med skråkant opp og i 30 ° vinkel i nederste høyre kvadrant av dyrets mage (figur 3b). Starte tidtakeren umiddelbart etter første musen injiseres.
      Merk: Lavdose ITTs (0,1 U/kg) kan utføres for å vurdere spesielt hepatic insulinfølsomhet. Som for OGTT, beregne injeksjon volumet kroppsvekt er standard prosedyre, mens basere dose på lean body mass er foretrukket hvis kroppen sammensetning data er tilgjengelige.
  4. Måle blodsukker på valgt tidspunkt (f.eksetter 15, 30, 45, 60 og 90 min).
    Merk: Som insulin har en kort pause ~ 10 min i mus13, sent forskjeller etter insulin administrasjon (f.eksetter 2 h) gjenspeiler kanskje ikke et direkte resultat av insulin handling. Administrere 20% glukose løsning i tilfelle en mus blir hypoglycemic (blod glucose høyder under 35 mg/dL) og er i fare for å dø.
  5. Etter siste gang poeng, plassere musene tilbake i burene sine hjem med rikelig med mat og vann.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 illustrerer en skjematisk tidsskjemaet for metabolske phenotyping mus på dietter. I en alder av ca. 6 uker plasseres mus på en HFD, mens en Hanne Cathrine-gruppe kan tjene som kontrollgruppen. Viktigere, bør kroppsvekt fastsettes ukentlig å observere hvis det er en forventet økning i kroppsvekt. Noen slags stress (f.eks, støy eller aggressiv mannlige atferd) kan forstyrre vektøkning og bør fjernes umiddelbart. Hver kohort mus for diett eksperimenter bør bestå av minst 10 mus fordi disse diett-eksperimentene er tidkrevende og outliers er hyppig (f.eksmus ikke få vekt eller mus med unormal glukose eller insulin nivåer). Etter den valgte perioden (avhengig av studien hypotesen og tidspunktet forventede endringer), kan OGTT og ITT utføres for vurdering av glukose toleranse og insulin handling. I denne utredningen ble sent tidspunkt for metabolske test valgt.

Viktigere, bør det være en utvinning tid med minst 1 uke mellom OGTT og ITT som disse eksperimentene fører til betydelig blod-tap og er dermed veldig stressende for mus. Hvis blod samling volumene er redusert (f.ekshvis utfører en ITT uten ytterligere blod samling først), kan denne restitusjonsperiode også være forkortet eller utelatt, i tråd med retningslinjene for flere blod trekker i dyr14, 15,16,17.

I denne store studien med 60 C57BL/6J mus totalt halvparten av musene ble satt på HFD eller Hanne Cathrine i en alder av 6 uker (n = 30/gruppe) og vektøkning var overvåket for 16 uker på diett. Forbruket av HFD resulterte i en betydelig økning i kroppsvekt som vist i Figur 4. For 6 ukens av alderen var kroppsvekten 20.2 g i begge gruppene. Mens mus på Hanne Cathrine viste et konsekvent, litt øke kroppsvekt (31.2 g ± 2.7) i observerte perioden, mus på HFD økt deres kroppsvekt raskt, spesielt i de første ukene og nådde kroppen vekt maksimum etter 16 uker på diett. Selv om vekten kurvene viste et lignende mønster under eksperimentet, musene av HFD-gruppen nådde en 1.5 - til 2 ganger høyere kroppsvekt (44.4 g ± 4.0) enn mus Hanne Cathrine-matet.

Undersøke metabolske fenotypen av to kohortene, ble en OGTT (figur 5) og ITT (figur 6) utført. Som blod er begrenset i små gnagere, ble en point-of-care (POC) analysen for diabetiker mennesker (glukosemåler) brukt til å overvåke blodsukker under disse metabolske phenotyping eksperimenter. Som vist i figur 2, blod glukose skjermer er enkel å bruke, trenger bare en liten dråpe blod, og vise blodsukker innen sekunder for dokumentasjon. Figur 5 viser time course of absolutt glukose (figur 5a-b) og absolutt insulin (figur 5 c) nivåer under OGTT. Generelt sunt musen med normal glukosetoleranse viser karakteristiske rask økning i blod glukose, nådde topp 15-30 min etter glukose utfordringen.

Etterfølgende glukose opptak, hovedsakelig utført av muskel, fett-vev og leveren vev fører til en gradvis reduksjon av blod glukose konsentrasjonen. Alle eksperimenter, Hanne Cathrine-matet musene som glukose tolerant kontrollgruppen og derfor oppfylt forventet metabolske profilen: toppen av blodsukkernivået av ~ 240 mg/dL ble nådd ca 15 min etter administrasjon av glukose umiddelbart etterfulgt av en nedgang nå basale nivåer ca 60 minutter etter glukose utfordringen som angir riktig glukose eliminering. I skarp kontrast HFD-mus nådde ca ~ 320 mg/dL glukose og viste nesten ingen salg av glukose, indikerer glukose motstand. Når blodsukker mellom to grupper allerede avviker i faste staten (som denne representativt eksempel), skal en beregning av området under kurven (AUC) over grunnlinjen glukose utføres for å validere resultatene (figur 5a- b).

I tillegg var sirkulerende blod insulin nivåer bestemmes ved hjelp av en insulin-ELISA test (figur 5 c) for å gi mer informasjon om den underliggende patofysiologien i denne modellen. Mens insulin nivåer var nesten uendret i kontrollgruppen, viste musene matet en HFD 16-fold opphøyet fastende nivåer sammenlignet med kontrollgruppen, samt en kraftig økt insulin respons, indikerer HFD-indusert kompenserende hyperinsulinemia som forsøkte å motvekt redusert glukose eliminering kapasitet, noe som kan være forårsaket av insulinresistens. Vær imidlertid klar over ikke å over tolke resultatene av OGTT, denne testen ikke direkte evalueres insulin handling og bør ikke brukes til å konkludere med uttalelser om insulinresistens.

For å måle insulinfølsomhet i HFD-matet mus, ble en ITT utført 1 uke etter OGTT (figur 6a). I denne analysen representerer graden som blod glukose konsentrasjoner faller etter insulin administrasjon effektiviteten av hele kroppen insulin handling. HFD-matet musene viste en svekket reduksjon av blodsukker sammenlignet Hanne Cathrine-matet kontrollgruppen, på alle tidspunkt under ITT, dermed antyder insulinresistens. ITT resultatene presenteres vanligvis som time course of blodsukkeret, men i tillegg også inverse AUC under grunnlinjen glukose kan vises som vist i figur 6b. Hvis gruppene som sammenlignes har lignende faste blodsukker (som ikke er tilfelle i dette eksperimentet), kan også blodsukkeret under ITT presenteres som en prosentandel av basale glukose. Som mus, et counter-regulatory svar på insulin aktiveres hvis blodsukkernivået faller under ~ 80 mg/dL18: feil denne counter-regulatory svar i en bestemt musemodell kan feiltolkes som en økning i insulin sensitivitet. Under HFDs og påfølgende metabolske fenotypiske eksperimenter oppstå ofte outliers. Mus som ikke oppnå vekt på HFD, eller de viser unormale fastende glukose og/eller insulin nivåer bør utelukkes fra analyse. For sistnevnte to, en avvikende test kan utføres for hver forsøksgruppen separat (f.eksGrubbs test)

I denne studien eksempel vi viste og tolket data av metabolske eksperimenter i vivoutført på mus med kosthold-indusert fedme, glukose intoleranse og insulinresistens og sammenlignet dem til en kontrollgruppe med normal kroppsvekt. Som forventet, var det nedsatt glukosetoleranse og hyperinsulinemia i overvektige mus samsvar med insulinresistens i forhold til alder-matchet kontroll mus; Dette ble avdekket med veletablerte, pålitelig, tid - og budsjett-vennlig metoder som er relativt enkle å utføre. Forskjeller i glukosetoleranse, insulin nivåer, så vel som i insulinfølsomhet, som hentes alle av presentert metoder for OGTT og ITT, kunne hjelpe planlegge neste trinnene i en studie, som kan omfatte mer avansert eksperimenter som hyperglycemic eller hyperinsulinemic klemmer, samt eksperimenter med isolert bukspyttkjertelen holmer.

Figure 1
Figur 1. Skjematisk tidsskjemaet for en foreslått diett regime og metabolske eksperimenter i vivo. For å undersøke metabolske effekten av HFD i mus, dyrene i forsøksgruppen plasseres på HFD for ca 6 ukens av alderen, mens kontrollgruppen mottar en Hanne Cathrine. Kroppsvekten av musene bør fastsettes på ukentlig basis å vurdere riktig vektøkning. Etter ca 12 uker på diett (eller et valgt tidspunkt avhengig av forskning hypotesen) vurderes metabolsk fenotypen av mus ved en OGTT etterfulgt av en uke med utvinning tid og senere en ITT. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Metoder for blod prøvetaking under metabolske eksperimenter. For OGTT så vel som for ITT, der gjentatte blodprøve er nødvendig, anbefaler vi tegning blod via nøye klippe et 1-2 mm stykke hale tips med skarp saks (Variant A), etterfulgt av fastsettelse av blodsukker nivåer med en glucosemåler og Videre samling av blod med en kapillær å bestemme insulin nivåer og andre relevante blod verdier. Blod kan eventuelt også prøves via hale blodåre (Variant B) eller arteriell catheterization (vises ikke). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Muntlige gavage glukose (a) og intraperitoneal insulin injeksjon (b). Representant bilder av muntlig glukose administrasjon med en fôring nål under OGTT (en) og intraperitoneal injeksjon av insulin under ITT (b). Se protokoll for en detaljert beskrivelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Body vektøkning HFD-matet og Hanne Cathrine-matet C57BL/6J mus. C57BL/6J mus ble enten satt på 60% HFD eller 10% Hanne Cathrine å tjene som en kontroll, for en periode på 20 uker. Mens mus på HFD viste en forventet økning i kroppsvekt, spesielt i de første ukene på diett, viste Hanne Cathrine-matet mus nesten konstant kroppsvekt i observerte perioden. Resultatene er gjennomsnittlig ± SEM. *p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0,001. n = 30 per gruppe. ANOVA og Tukey's post hoc test ble brukt til å teste forskjeller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. OGTT utføres i HFD-matet og Hanne Cathrine-matet C57BL/6J dyr. (en) glukose nivåer under OGTT. Etter en natts rask, ble blodsukkeret (mg/dL) målt i faste tilstand og 15, 30, 45 og 60 min etter administrasjon glukose løsning muntlig via gavage (1 g glukose/kg). Blodsukkeret hos HFD-gruppen ble hevet i faste staten og etter glukose utfordring. Økningen nådde sitt høydepunkt etter 15 min etterfulgt av en forsinket og langsom nedgang. Resultatene er gjennomsnittlig ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 30 per gruppe. Statistisk analyse ble utført ANOVA og Tukey's post hoc test. (b) glukose området under kurven (AUC) under OGTT. For å beregne planlagte korrigert AUC, basale glukose nivåer (tidspunkt 0) ble trukket fra senere fikk blodsukkernivået for hver musen individuelt, etterfulgt av beregningen av de personlige AUC. AUC over grunnlinjen glukose illustrerer glukose motstanden i HFD-matet mus. Statistisk analyse var utført ANOVA og Tukey's post hoc test (blodsukkeret) eller Student to tailed t-test (AUC). (c) Insulin nivåer under OGTT. Insulin (ng/mL) nivåer ble målt etter en fastende periode av 4 h og 15, 30 og 60 min etter administrasjon glukose løsning muntlig via gavage (1 g glukose/kg). HFD-matet mus ikke bare kompensert for glukose injeksjon med en høyere økning i blod insulin nivåer, de også startet og endte på OGTT med forhøyet insulin nivåer sammenlignet med kontrollgruppen. Resultatene er gjennomsnittlig ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 30 per gruppe. Statistisk analyse ble utført ANOVA og Tukey's post hoc test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. ITTs i HFD-matet og Hanne Cathrine-matet C57BL/6J dyr. (en) glukose nivåer under ITT. Blodsukkeret (mg/dL) ble målt i faste tilstand og 15, 30, 45 og 60 min etter injeksjon av insulin intraperitoneally (0,75 U insulin/kg). Under ITT viste HFD-matet mus forhøyet blodsukker nivåer. Blodsukkernivået var ikke tilstrekkelig senket i HFD-matet mus etter insulininjeksjon. Resultatene er gjennomsnittlig ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. n = 30 per gruppe. Statistisk analyse ble utført ANOVA og Tukey's post hoc test. (b) glukose området under kurven (AUC) under ITT. For å beregne den planlagte korrigerte inverse AUC, utjevner basale glukose (tidspunkt 0) ble trukket fra alle senere fått blodsukkernivået for hver musen individuelt. Verdiene var invertert (multiplikasjon med -1), etterfulgt av beregningen av de personlige AUC. Som følge av høyere glukose nivå i HFD-matet mus under OGTT korrigert grunnlinjen inverse AUC var lavere i HFD-matet mus sammenlignet kontroll mus, som ytterligere foreslått redusert insulinfølsomhet. Statistisk analyse var utført ANOVA og Tukey's post hoc test (blodsukkeret) eller Student to tailed t-test (inverse AUC). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur 1. Sjekkliste for eksperimentet forberedelse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2. Insulin nivåer under ITTs. Plasma insulin nivåer under ITT i Hanne Cathrine-matet versus HFD-matet gruppene viste lignende dynamikken i plasma insulin nivåer etter insulininjeksjon i begge gruppene. Som forventet, utstilt HFD musene sterkt økte basale insulin nivåer sammenlignet med kontrollgruppen. Videre var økningen i insulin nivåer i HFD-matet mus sterkere, som kan delvis skyldes overvurdering av lean body mass hvis mengden Injisert insulin beregnes basert på hele kroppen massen (den konvensjonelle normalisering tilnærmingen) som utføres i dette eksperimentet. Men insulin svaret ble nedsatt i gruppen HFD-matet (utilstrekkelig reduksjon på plasma glukose nivåer), dermed ytterligere understreker insulin resistente staten i disse dyrene. Resultatene er gjennomsnittlig ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Statistisk analyse ble utført ANOVA og Tukey's post hoc test. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Med den høye utbredelsen av diabetes og tilknyttede sykdommer i verdens befolkning er det et sterkt behov for forskning molekylære mekanisme, forebygging og behandling av sykdom19. Presentert protokollen beskriver veletablerte metoder for generering av HFD mus, en robust dyr modell som brukes for metabolske forskning, samt gjennomføring av OGTT og ITT, som er potent verktøy for vurdering av hele kroppen metabolske forandringer som insulinresistens. Metodene i denne artikkelen kan være nyttig å studere rollen til mistenkte gener, miljøfaktorer samt farmakologiske, kosttilskudd, fysisk eller genetisk terapi på hele kroppen glukose-metabolisme9,10. Mens glukose fungerer som den viktigste stimulus for insulinsekresjon i en OGTT, presenteres protokollen kan endres av (co-) bruk av andre stoffer som andre makronæringsstoffer og hormoner som er kjent for å endre den insulin svar2. Tilsvarende kan ITT protokollen endres av programmet (co-) av andre stoffer (f.eks, glukagon eller katekolaminer) ifølge enkelte problemstillingen. Viktigste readouts beskrevet OGTT og ITT protokollene er blod glukose og insulin konsentrasjoner; men kan målingen av andre blod parametre som glukagon, fettsyrer og lipoprotein nivåer, samt ulike metabolske markører på mRNA og protein også være nyttig avhengig av målet med undersøkelsen.

Etterforskerne bør være klar over at neuroendocrine svar hypoglykemi, insulinsekresjon, insulin action samt samlede metabolsk fenotypen sterkt avhengig av genetisk bakgrunn av mus10. Her brukes vi mus i C57BL/6J genetisk bakgrunn som en HFD-indusert modell av diabetes, som har en delvis verdifall i glukose-mediert insulinsekresjon på grunn av naturlig forekommende sletting i nikotinamid nucleotide transhydrogenase genet 20, noe som gjør dem til en passende modell for å studere fedme tilknyttet insulin resistens8,9. Protokollene beskrevet her kan imidlertid benyttes for å karakterisere metabolically alternativ musen modeller av insulinresistens og diabetes, som vanligvis er basert på monogenic lidelser eller kjemiske ødeleggelsen av β-celler21, 22 , 23. forholdsregler under eksperimentell design inkluderer testing alder-matchet mus, som insulin sensitivitet avtar med alderen24og videre gjennomføre eksperimenter i mus fra samme kjønn. Som genetiske mutasjoner og behandlinger kan resultere i Norge avhengig av sex25,26, kan det også være lurt å undersøke begge kjønn atskilt fra hverandre.

Blod sampling metoden beskrevet i denne protokollen krever ikke narkose, som kan påvirke hjertefrekvensen og blodstrøm glukose metabolisme, gir ikke-fysiologiske resultater10. Alternativt kan en arteriell kateter bli implantert, som tillater vaskulær prøvetaking uten håndtere stress under eksperimentet, men legger også til arbeid, kostnader, samt risikoen for dyr tap i eksperimentet. For OGTT, mus er vanligvis fastet overnatting (14-18 h), som provoserer en catabolic stat i mus, sterkt tappe leveren glykogen butikker. Om dette reduserer variasjon i planlagte blodsukker, langvarig rask reduserer metabolske rate og forbedrer glukose utnyttelse i mus, er situasjonen i mennesker10,27. Som fôring mønstre i mus også ikke etterligner menneskelig atferd, kan det være dermed mer fysiologiske utføre en OGTT etter en kort rask. Som døgnrytme har en sterk innvirkning på systemisk glukose metabolisme28, er det viktig å tenke på hvilken tid av dagen eksperimenter beskrevet her er utført. For å undersøke metabolismen av mus i sin aktive perioden (den mørke fasen), kan en omvendt lys og mørke syklus være nyttig å generere flere fysiologiske resultater.

Beskrevet ruten administrasjon kan også varieres avhengig av spesifikke hypotesen blir testet. Peroral administrering av glukose under en glukose toleranse test fører til mer variabel insulinsekresjon, mage tømming, gastrointestinale motilitet, hormoner (incretins) og nevrale input endre og forlenge insulin svar2, 10. i brønnen beskrevet "incretin effekt", absorpsjon av glukose fra tarmen fører til utgivelsen av gastrointestinal hormoner som GLP1, som potentiates muntlig glukose-levert insulin release29. For å omgå disse effektene, glukose bolus kan også være administrert intravenøst (IVGTT) eller intraperitoneally (IPGTT). Både glukose og insulin utflukter variere betydelig avhengig av valgt levering ruten. Sammenlignet med OGTT, fører intraperitoneal administrasjon av glukose til en økt og langvarig topp i plasma glukose nivåer, mens plasma insulin nivåer stige i en forsinket, men mer vedvarende mote30. Tilsvarende er intravenøs glukose administrasjon preget av en forsinket insulin respons31. Kraftig økning i insulin nivåer samt mer robust AUC-insulin data innhentet under OGTT foreslår at muntlig levering av glukose kan være mer følsomme for å oppdage endringer i glukose metabolisme i chow-matet versus HFD-matet mus30, 31. både intragastric og intraperitoneal har like alvorlighetsgraden for dyr og tekniske problemer, mens intravenøs administrasjon er vanligvis vanskeligere, samt mer stressende mus32. Peroral administrering ytterligere eliminerer 10-20% frekvensen av feil under intraperitoneal injeksjoner i intestinal lumen eller magen, som kan påvirke hastigheten av glukose levering og omfordeling33,34.

Selv om det mest fysiologiske ruten av glukose levering, er OGTT begrenset i regnskap for bare glukose absorpsjon, mens et komplett måltid inneholder også proteiner, komplekse karbohydrater, fett, fiber og mikronæringsstoffer. Tilnærmingen i OGTT er å basere glukose dose på kroppsvekten av musen, mens vanligvis 1-3 g av glukose/kg kroppsvekt er administrert35,36. I enkelte tilfeller kan en høyere glukose lasting enn 1g/kg være nødvendig å avsløre en svekket glukose toleranse30. Mange mus modeller av fedme og diabetes er preget av endringer i kroppssammensetning, spesielt en massiv økning i fettmasse, mens lean body mass (muskler, hjernen og leveren), som er de viktigste stedet for glukose disposisjon ikke endres proporsjonalt. Den konvensjonelle normalisering tilnærmingen til kroppsvekt vil dermed medføre en uforholdsmessig høyere dose av glukose som lean vev i en overvektige mus er utsatt sammenlignet med ikke-obese musen. Denne skjevhet øker med høyere glukose dose30. Derfor skal optimalt dosen av glukose (OGTT) samt insulin (ITT) beregnes basert på lean body mass, hvis kroppen sammensetning data tilgjengelig37. Hvis vurderingen av kroppssammensetning ikke er mulig på grunn av tekniske begrensninger, skal dosering utføres etter kroppsvekten (supplerende figur 2), mens bruke en fast dose, som i en menneskelig OGTT bør være siste utvei hvis utføre testene i mus10,35,36. I presentert protokollen, ble en håndholdt fullblod skjerm brukt til å måle blodsukker, som er en fordel i tester som OGTT og ITT som krever flere utvalg av små blod volum. Disse enhetene er imidlertid utformet for menneskelig blod, har en redusert dynamikkområde. Alternativt, glukose nivå kan måles i de innsamlede plasma prøvene, f.eksved fullt automatisert kjemi analyserer i praksis laboratorier. I tillegg til insulin, kan C-peptid måles i beskrevet protokollene som en mer direkte indikator av β-celle sekretoriske funksjon, som ikke er utvunnet av leveren i motsetning til insulin38,39. Hvis Glukoneogenesen må vurderes, kan pyruvate toleranse test (PTT) brukes, som er en annen variant av her beskrevet protokoller, overvåking glykemisk utflukter etter administrasjon av en pyruvate bolus40.

Her beskrives tilnærminger av OGTT og ITT kan ofte forklare observerte forskjeller i glukosetoleranse og kan videre tjene til å foreslå der senere, mer avanserte eksperimenter skal gjennomføres neste (f.eks, hyperglycemic klemmer eller studier på isolerte småøyer). I sammendraget, vi presenterer en enkel protokoll for generering av en HFD-indusert musemodell og videre beskriver OGTT og ITT, som er kraftige verktøy for å vurdere endringer i metabolske fenotypen i vivo og kan være nyttig å studere metabolisme-assosiert sykdom mekanismer samt romanen terapeutiske metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgements

Denne forskningen ble støttet av medisinsk vitenskapelige fondet av bygrensen og Österreichische Gesellschaft für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse strain: C57BL/6J The Jackson Laboratory 664 LFD/HFD
Accu Chek Performa - Glucometer Roche 6870228 OGTT/ITT
Accu Chek Performa - Strips Roche 6454038 OGTT/ITT
D-(+)-Glucose solution Sigma-Aldrich G8769 OGTT
Actrapid - Insulin Novo Nordisk 417642 ITT
Reusable Feeding Needles Fine Science Tools #18061-22 OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)
Omnifix-Fine dosing syringes Braun 9161406V OGTT/ITT
Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) Braun 304000 ITT; lean mice
Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm)   Braun 4657705 ITT; mice on HFD
96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible Braintree Scientific, Inc. SP0016 OGTT
Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit Crystam Chem 90080 OGTT
Rodent Diet with 60% kcal% fat Research Diets Inc D12492 mice on HFD
Rodent Diet with 10% kcal% fat. Research Diets Inc D12450B mice on LFD
BRAND micro haematocrit capillary Sigma-Aldrich BR749321 OGTT/ITT
Vaseline - creme Riviera P1768677 OGTT/ITT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Qatanani, M., Lazar, M. A. Mechanisms of obesity-associated insulin resistance: many choices on the menu. Genes Dev. 21, (12), 1443-1455 (2007).
  2. Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. Clin Biochem Rev. 26, (2), 19-39 (2005).
  3. Reaven, G. M. Pathophysiology of insulin resistance in human disease. Physiol Rev. 75, (3), 473-486 (1995).
  4. Kahn, B. B. Type 2 diabetes: when insulin secretion fails to compensate for insulin resistance. Cell. 92, (5), 593-596 (1998).
  5. Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu Rev Immunol. 29, 415-445 (2011).
  6. Odegaard, J. I., Chawla, A. Pleiotropic actions of insulin resistance and inflammation in metabolic homeostasis. Science. 339, (6116), 172-177 (2013).
  7. Srinivasan, K., Ramarao, P. Animal models in type 2 diabetes research: an overview. Indian J Med Res. 125, (3), 451-472 (2007).
  8. Surwit, R. S., Kuhn, C. M., Cochrane, C., McCubbin, J. A., Feinglos, M. N. Diet-induced type II diabetes in C57BL/6J mice. Diabetes. 37, (9), 1163-1167 (1988).
  9. Winzell, M. S., Ahren, B. The high-fat diet-fed mouse: a model for studying mechanisms and treatment of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Diabetes. 53, Suppl 3. S215-S219 (2004).
  10. Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3, (9-10), 525-534 (2010).
  11. Jais, A., et al. Heme oxygenase-1 drives metaflammation and insulin resistance in mouse and man. Cell. 158, (1), 25-40 (2014).
  12. Teperino, R., et al. Hedgehog partial agonism drives Warburg-like metabolism in muscle and brown fat. Cell. 151, (2), 414-426 (2012).
  13. Cresto, J. C., et al. Half life of injected 125I-insulin in control and ob/ob mice. Acta Physiol Lat Am. 27, (1), 7-15 (1977).
  14. First report of the BVA/FRAME/RSPCA/UFAW joint working group on refinement. Removal of blood from laboratory mammals and birds. Lab Anim. 27, (1), 1-22 (1993).
  15. McGuill, M., Rowan, A. Biological Effects of Blood Loss: Implications for Sampling Volumes and Techniques. ILAR. 31, (4), 5-18 (1989).
  16. Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29, (10), 47-53 (2000).
  17. NIH. National Institute of Health - Guidelines for Survival Bleeding of Mice and Rats. Available from: http://oacu.od.nih.gov/ARAC/survival.pdf (2017).
  18. Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, (4), E678-E684 (2006).
  19. Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Res Clin Pract. 103, (2), 137-149 (2014).
  20. Freeman, H. C., Hugill, A., Dear, N. T., Ashcroft, F. M., Cox, R. D. Deletion of nicotinamide nucleotide transhydrogenase: a new quantitive trait locus accounting for glucose intolerance in C57BL/6J mice. Diabetes. 55, (7), 2153-2156 (2006).
  21. Pelleymounter, M. A., et al. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science. 269, (5223), 540-543 (1995).
  22. Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84, (3), 491-495 (1996).
  23. Rossini, A. A., Like, A. A., Dulin, W. E., Cahill, G. F. Jr Pancreatic beta cell toxicity by streptozotocin anomers. Diabetes. 26, (12), 1120-1124 (1977).
  24. Bailey, C. J., Flatt, P. R. Hormonal control of glucose homeostasis during development and ageing in mice. Metabolism. 31, (3), 238-246 (1982).
  25. Shi, H., et al. Sexually different actions of leptin in proopiomelanocortin neurons to regulate glucose homeostasis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, (3), E630-E639 (2008).
  26. Collins, S., Martin, T. L., Surwit, R. S., Robidoux, J. Genetic vulnerability to diet-induced obesity in the C57BL/6J mouse: physiological and molecular characteristics. Physiol Behav. 81, (2), 243-248 (2004).
  27. Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J Lipid Res. 46, (3), 582-588 (2005).
  28. Kohsaka, A., Bass, J. A sense of time: how molecular clocks organize metabolism. Trends Endocrinol Metab. 18, (1), 4-11 (2007).
  29. Drucker, D. J. Incretin action in the pancreas: potential promise, possible perils, and pathological pitfalls. Diabetes. 62, (10), 3316-3323 (2013).
  30. Andrikopoulos, S., Blair, A. R., Deluca, N., Fam, B. C., Proietto, J. Evaluating the glucose tolerance test in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295, (6), E1323-E1332 (2008).
  31. Ahren, B., Winzell, M. S., Pacini, G. The augmenting effect on insulin secretion by oral versus intravenous glucose is exaggerated by high-fat diet in mice. J Endocrinol. 197, (1), 181-187 (2008).
  32. Bowe, J. E., et al. Metabolic phenotyping guidelines: assessing glucose homeostasis in rodent models. J Endocrinol. 222, (3), G13-G25 (2014).
  33. Arioli, V., Rossi, E. Errors related to different techniques of intraperitoneal injection in mice. Appl Microbiol. 19, (4), 704-705 (1970).
  34. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17, (2), 250-251 (1969).
  35. Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. Chapter 29 Unit 29B 23 (2007).
  36. Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, (1), E15-E26 (2008).
  37. McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, (4), E849-E855 (2009).
  38. Pacini, G., Omar, B., Ahren, B. Methods and models for metabolic assessment in mice. J Diabetes Res. 2013, 986906 (2013).
  39. Polonsky, K. S., Rubenstein, A. H. C-peptide as a measure of the secretion and hepatic extraction of insulin. Pitfalls and limitations. Diabetes. 33, (5), 486-494 (1984).
  40. Hughey, C. C., Wasserman, D. H., Lee-Young, R. S., Lantier, L. Approach to assessing determinants of glucose homeostasis in the conscious mouse. Mamm Genome. 25, (9-10), 522-538 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics