Um método melhorado para coleta de líquido cefalorraquidiano de ratos anestesiados

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Este protocolo descreve uma técnica melhorada para a coleção abundante de líquido cerebrospinal (CSF), sem contaminação de sangue. Com a maior coleção de amostra e pureza, mais análises podem ser executadas usando o CSF para aprofundar nossa compreensão das doenças que afetam o cérebro e a medula espinhal.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lim, N. K., Moestrup, V., Zhang, X., Wang, W. A., Møller, A., Huang, F. D. An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice. J. Vis. Exp. (133), e56774, doi:10.3791/56774 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

O líquido cefalorraquidiano (LCR) é um fluido corporal valioso para análise na pesquisa da neurociência. É um dos fluidos em contato mais próximo com o sistema nervoso central e assim, pode ser usado para analisar o estado doente do cérebro ou da medula espinhal sem acessar diretamente esses tecidos. No entanto, em ratos, é difícil de obter da cisterna magna devido a sua proximidade de vasos sanguíneos, que muitas vezes contaminar amostras. A área para a coleção do CSF em ratos também é difícil de dissecar a e muitas vezes apenas pequenas amostras são obtidas (máximo de 5 a 7 µ l ou menos). Este protocolo descreve, em detalhes, uma técnica que melhora na atuais métodos de coleção para minimizar a contaminação do sangue e permitir a coleção abundante de LCR (em média que 10-15 µ l podem ser coletados). Esta técnica pode ser usada com outros métodos de dissecação na recolha de tecidos de ratos, como isso não afeta quaisquer tecidos durante a extração do CSF. Assim, o cérebro e a medula espinhal não são afetados com esta técnica e permanecem intactos. Com a maior coleção de amostra do CSF e pureza, mais análises podem ser usadas com esta pesquisa de neurociência do fluido para mais ajuda e entendem melhor as doenças que afetam o cérebro e a medula espinhal.

Introduction

O CSF é um fluido corporal valioso para análise na pesquisa da neurociência. O CSF é feito principalmente do plasma sanguíneo, que contém poucas células (sem células vermelhas do sangue e apenas algumas células brancas do sangue) e é quase livre de proteína. É um dos fluidos em contato próximo com o sistema nervoso central (SNC) e pode passar muitos eletrólitos para fora do cérebro e da medula espinhal para o sistema periférico. Em humanos, CSF amostras podem ser coletadas para auxiliar no diagnóstico de doenças ou para fins de pesquisa em ensaios clínicos, como uma punção (ou punção lombar) é um procedimento invasivo, menor: o fluido CSF pode refletir as alterações no SNC sem ter que acessar diretamente estas tecidos. Assim, nos últimos anos, para fins de pesquisa, na clínica, amostras de CSF foram obtidas de pacientes de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer e outras demências1,2,3. Existem muitos ensaios de biomarcador que foram desenvolvidos usando amostras do CSF para potencialmente auxiliar no diagnóstico de doenças na clínica2,3. No entanto, existe muito debate sobre a fiabilidade destes ensaios para produzir resultados consistentes, sensíveis para diagnosticar especificamente doença4,5. Então, há uma grande necessidade para o desenvolvimento de melhores ensaios e alvos, que podem ser encontrados no CSF, para auxiliar na produção de uma norma técnica para diagnosticar doenças neurodegenerativas com maior sensibilidade e especificidade. Devido a importância potencial das amostras de CSF humanas na doença, a coleção de LCR de roedores em pesquisas de Neurociências também é de interesse.

Ratos são animais importantes em pesquisas biológicas e médicas e permitam o teste de potenciais compostos terapêuticos e estudos de prova de conceito antes de testes clínicos em humanos. No entanto, em camundongos é difícil obter amostras CSF devido a sua proximidade ao cérebro de um animal pequeno, como o método usual de coleção do CSF em camundongos é obtê-la através da cisterna magna, uma abertura entre o cerebelo e a superfície dorsal da medulla oblongata. Isso faz com que a dificuldade na coleta de amostras de CSF nesta área é difícil de dissecar a e na proximidade de vasos sanguíneos, aumentando o risco de contaminação das células do sangue. Devido a essas dificuldades, a maioria dos pesquisadores só podem obter uma pequena quantidade de LCR para análise (geralmente indicado como 5 a 7 µ l) e a contaminação das amostras do CSF por pilhas de sangue é uma preocupação primordial para análises6,7,8 , 9. contaminação de sangue pode obscurecer os resultados e não realmente refletem o estado do SNC. Além disso, amostra limitada coletada pode afetar a pesquisa como a quantidade habitual coletada de ratos é suficiente para apenas uma medição (em duplicado ou triplicado) utilizando ensaio imunoenzimático (ELISA). Assim, amostras de CSF são geralmente agrupadas de vários mouses para ter suficiente amostra para executar vários ensaios. Desenvolver um protocolo para a abundante, coleção incontaminada de LCR de ratos é muito desejada e será benéfica na melhoria da investigação neurociência usando roedores.

Neste protocolo, uma técnica para a abundante (uma média de 10-15 µ l) coleção de LCR de ratos anestesiados é descrita em detalhes e melhora em um método atualmente conhecido da coleção do CSF para minimizar a contaminação do sangue10. Um protocolo robusto para coleção CSF ajudarão no desenvolvimento dos ensaios baseados em CSF biomarcador, que poderia ser usado para auxiliar no diagnóstico de doenças, bem como melhorar a pesquisa para os mecanismos subjacentes a doenças que afectam o CNS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com as políticas da sociedade de neurociência (EUA) e comissões de ética de Fudan University (Shanghai, China). Este procedimento é para uma cirurgia não-sobrevivência.

1. instalação de aparelhos de coleção do CSF

  1. Puxe o vidro capilar (diâmetro interno de 0,75 mm, diâmetro externo 1,0 mm) usando um extrator de micropipeta (conforme mostrado no Liu et al . 10; capilar afiada é mostrado na Figura 1).
  2. Lugar um capilar no suporte do capilar de vidro afiado firmemente montado em um micromanipulador (figura 1A).
  3. Quebrar a ponta do capilar afiado com pinça reta sob um microscópio de dissecação, para que o diâmetro interno da ponta quebrada é sobre 10-20 µm (Figura 1).
  4. Anexar um tubo fino e uma seringa para a outra extremidade do titular do capilar e conectar a seringa e o tubo fino com uma válvula de três vias.
  5. Deslocar a válvula de três vias para abrir e mergulhar a seringa para soprar ar da seringa através da tubulação para o capilar de expulsar todos os contaminadores e criar pressão positiva no tubo capilar de vidro.
  6. Repita isso algumas vezes por dis-ligação e re-conectar a seringa para a válvula de três vias e elaborar a seringa ~ 100-200 µ l antes da última re-conexão da seringa com a válvula de três vias (figura 1B).
  7. Mova o micromanipulador com o capilar de vidro para o lado para evitar danos durante a dissecção do mouse.

Figure 1
Figura 1. Microscópio, micromanipulador e instalação capilar. (A) microscópio e micromanipulador com capilar anexado setup, bem como uma imagem mais perto de (B) a seringa conectada e a válvula de três vias para abrir (mostrado aqui) ou fechar a tubulação e (C) uma ininterrupta (direita) e quebrado (à esquerda) ponta capilar pronta para coleta do CSF. Uma vez quebrado, a ponta do capilar deve ter um diâmetro interno de 0,75 mm, diâmetro externo de 1,0 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Mouse dissecação

  1. Anestesia o mouse.
    Nota: para este protocolo, C57BL/6 e amiloide precursora da proteína/presenilina 1 (APP/PS1) transgénicos (modelo do rato da doença de Alzheimer) ratos foram utilizados e anestesiados com 4% hidrato de cloral (em dH20) em 10 µ l/g do peso do mouse via intraperitoneal injeção.
  2. Quando totalmente anestesiados, certifique-se de que o mouse é adequadamente anestesiado. A resposta de retirada aos pés pitada, ligeiramente estendendo membros posteriores e beliscar os dedos e olhando para uma resposta de retirada, é executada para garantir a adequada anestesia. Verificar por beliscar todos os quatro membros; Se não houver nenhuma reação o mouse corretamente é anestesiado. Cortar e aparar o cabelo na parte de trás da cabeça do mouse acima dos olhos, entre os ouvidos para a parte inferior do pescoço com uma tesoura de dissecação (Figura 2A). Alternativamente, tosquiadeiras ou creme depilatório pode ser usado para ajudar na remoção de pelos.
  3. Fixar a cabeça do rato usando um adaptador para mouse (parte de trás da cabeça virada para cima com o nariz apontado para baixo ~ 45 °, Figura 2A). Corrigir barras de orelha entre as orelhas e os olhos do mouse e aperte. Verifique se a cabeça não pode se mover e está segura firmemente o adaptador empurrando suavemente para baixo para a cabeça do rato.
  4. Verifique novamente a resposta de retirada para toe pitada antes de fazer a incisão cirúrgica e regularmente posteriormente para garantir o plano cirúrgico da anestesia. Visualmente, observe qualquer alteração na taxa respiratória durante o procedimento para indicar alterações nos planos da anestesia. Uma técnica limpa, não assépticas, pode ser usada para esta cirurgia não-sobrevivência curta. Usando uma tesoura e pinça curvada, corte a pele e a primeira camada do músculo até a base do crânio é exposta com apenas uma fina camada de músculo.
    Nota: Corte através da pele de rato em toda a volta do pescoço e em seguida, corte a pele para baixo no meio do crânio entre as orelhas e os olhos do rato. Pele e tecido podem então ser puxados distante e fora da área a cisterna magna.
  5. Enquanto a visualização através do microscópio de dissecação, cuidadosamente dissecar fora o último finas camadas de músculo sobre a base do crânio usando fórceps e mover estas camadas de músculo para o lado e fora da área de interesse. Se lá está sangrando, use cotonetes para remover e ajudar a parar o sangramento.
  6. Uma vez que a dura-máter sobre a cisterna magna é exposta (forma triangular com geralmente 1-2 grandes vasos sanguíneos que atravessa a área; ambos os lados de ou entre os vasos sanguíneos é ideal para inserção capilar e coleção de CSF, Figura 2B), use um úmido cotonete para limpar a membrana e em seguida, use um cotonete seco para secar a área.

Figure 2
Figura 2. Configuração de mouse e dissecação com imagens representativas de inserção capilar para coleção CSF. Configuração do mouse pronta para extração de CSF com (A) raspou a cabeça presa no lugar para dissecção e (B) detalhadas imagem (vista de x 10) de um rato dissecado dura cobrindo a cisterna magna (seta tracejada mostra um vaso sanguíneo que atravessa a área e seta sólida mostra área ideal para inserção capilar). Imagens detalhadas (10 x modo de exibição) de (C) afiada ponta do capilar de vidro alinhada contra a dura-máter da cisterna magna, (D) o ponto em que o capilar puncturas quase a dura-máter, com alguma resistência de dura-máter e (E) a ponta capilar aproveitada através da dura-máter para coletar CSF. CSF deve ser um líquido coletado no vidro capilar (seta pontilhada). Todas as barras de escala na parte inferior direita de cada imagem de microscópio indicam 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. CSF coleção de Mouse anestesiado

  1. Alinhe o capilar de vidro na parte de trás da cabeça do rato, de modo que o ponto afiado é apenas atrás da membrana em um ~ 30-45 ° ângulo (Figura 2).
  2. Mergulhar a seringa uma vez ou algumas vezes e elaborar a seringa ~ 100-200 µ l (para certificar-se de que não há nenhum contaminante e existe pressão negativa no vidro capilar).
  3. Usando o micromanipulador, mova o capilar dica mais perto da membrana até a resistência pode ser vista, mas não puncioná-la (Figura 2D).
  4. Uma vez que a resistência é vista entre a ponta do capilar e a membrana, bata levemente o tubo capilar através da membrana por bater nos controles de micromanipulador. Use o microscópio para ver o ponto afiado da punção capilar para a cisterna magna. CSF automaticamente deve ser desenhado dentro do tubo capilar, uma vez que a abertura foi esvaziada (Figura 2E).
  5. Sair do capilar para coletar lentamente CSF. Se o CSF parou de desenhar, desenhar a seringa uma pequena quantidade lentamente (~ 50 µ l) para criar pressão mais negativa no capilar para extrair para fora o CSF.
    Nota: Alternativamente, capilar pode ser suavemente e lentamente tirou o cérebro usando os controles bem micromanipulador para permitir CSF flua capilar novamente. Um montante total de ~ 10-15 µ l de LCR (~ 3-4 cm no capilar) leva ~ 10-30 min e ocasionalmente de 20 µ l ou mais podem ser coletados. Embora não seja absolutamente necessário, é recomendável usar uma almofada de calor durante a coleta do CSF. Coleção de CSF foi realizada à temperatura ambiente (~ 23 ° C).
  6. Uma vez que a quantidade de LCR desejado é coletada, feche o tubo deslocando-se a válvula de três vias para fechar (para parar de desenhar fora o CSF).
  7. Retire a seringa conectada para o tubo e abrir e fechar o tubo (para criar pressão equalizada no capilar, um tubo e a área fora do capilar). Reconectar a seringa com a válvula de três vias, mas não mergulhe a seringa.
  8. Remova cuidadosamente o capilar de vidro do mouse usando o micromanipulador.
  9. Coloque o tubo de coleta (microtubos de 1,5 mL com 1 µ l de 20 x inibidor da protease) sob o ponto afiado do vidro capilar.
  10. Abra o tubo e mergulhar suavemente a seringa: o CSF deve fluir fora do capilar e o tubo de coleta.
  11. Após a coleta, centrifugar rapidamente (pulso rotação por 5 s, a velocidade máxima, usando uma mini centrífuga) o CSF para misturar a amostra com o inibidor de protease na parte inferior do tubo da coleção.
    Nota: As amostras de CSF podem ser aliquotadas e então armazenados para posterior análise a-80 ° C. O resto do mouse pode ser dissecado para outros tecidos, tais como cérebro e medula espinhal. O mouse ainda está vivo nesta fase e, portanto, sangue pode também ser recolhido, se necessário.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Usando o procedimento descrito aqui (Figura 1 e Figura 2), o CSF imediatamente recolhido no capilar deve ser clara (Figura 2E), não rosa ou vermelho. Se houver uma rosa para coloração avermelhada para o fluido coletado no capilar, depois houve contaminação com sangue.

Como um exemplo da aplicação da amostra do CSF coletados com esse método, os níveis de proteína amiloide-beta (Aβ) foi medido utilizando ELISA. Os níveis de Aβ no CSF é geralmente medido em doença de Alzheimer pesquisa7. CSF é na maior parte livre de proteína. Em um modelo do rato da doença de Alzheimer (APP/PS1 ratos), os níveis de Aβ humano42 são aumentou significativamente, como estes ratos overexpress APP humana. Isto pode ser observado com as amostras de LCR coletados de ratos de 12 meses de idade, usando os métodos descritos aqui (0 pg/mL no CSF de ratos de tipo selvagem (WT) em comparação com 1.303 pg/mL nos CSF da APP/PS1 ratos, Figura 3).

Figure 3
Figura 3. Resultados representativos para a amostra do CSF coletados. Análise de ELISA da CSF amostra coletada. Em um modelo do rato da doença de Alzheimer (APP/PS1), há um aumento significativo nos níveis de Aβ humano42 no CSF, como estes ratos overexpress humano Aβ42 (1.303 pg/mL). Em tipo selvagem (WT) ratos lá devem ser não humano Aβ42 detectado (0 pg/mL). Um unpaired t-teste foi utilizado para medir significado, * * p < 0,01, barras de erro representadas como SEM, n = 3 e 4 mouses com 12 meses de idade, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este protocolo descreve, em detalhes, uma técnica que melhora na atual métodos10 da coleção do CSF para minimizar a contaminação do sangue e permitir a coleção abundante de LCR (em média ~ 10-15 µ l podem ser obtidos) dos ratos. Ao quebrar a ponta capilar, a ponta do capilar não deve ser muito pequena (como então o CSF será extraído muito lentamente) ou muito grande (vontade não ser fino o suficiente para recolher o CSF e tecido pode tornar-se alojou no capilar). Tenha cuidado quando dissecando a área para a coleção do CSF: qualquer sangramento deve ser interrompido e a área para inserção do capilar de vidro limpo do sangue com dH20 para evitar a contaminação com a amostra. A anatomia de cada mouse é diferente, mas a maioria dos ratos tem 1-2 vasos sanguíneos atravessa a área onde o capilar precisa ser inserido para a coleção do CSF. Escolher que o local correto para a inserção do capilar é importante, como inserir muito perto de vasos sanguíneos contaminará o CSF com sangue. Como mostrado na Figura 2, uma área livre de vasos sanguíneos, tais como entre ou em ambos os lados dos grandes vasos sanguíneos, é ideal para inserção capilar evitar contaminação. Se o CSF não flui para fora a uma taxa constante e para depois de algum tempo, a seringa de desenho um pouco (~ 50 µ l) pode ajudar a reiniciar o fluxo de LCR para o capilar. Alternativamente, o capilar em si pode ser movido devagar e com cuidado dentro ou fora do mouse com o micromanipulador para reiniciar o fluxo de extração do CSF. Deve ter cuidado ao fazer estes passos como sangue pode fluir para o capilar também. Esta técnica funciona bem devido as diferenças na pressão do cérebro e vidro capilar para tirar CSF do mouse. Assim, o mouse pode somente ser perfurado uma vez, como depois capilar é inserido o mouse e retirado, há uma perda de pressão no cérebro e CSF não será mais ser atraído para o capilar automaticamente se ele é inserido novamente. Portanto, prática irá aperfeiçoar essa técnica para produzir sem contaminantes de sangue e obter adequada coleção CSF na primeira inserção do capilar para o rato (de experiência, 10-20 ratos de prática será suficiente para chegar a esta fase).

Este protocolo é um método eficiente e melhorado para extrair o CSF de ratos e se feito corretamente, minimiza a contaminação do sangue (Figura 1, Figura 2, Figura 3). Esta técnica é limitada pelo tempo tomado para CSF a recolher. Normalmente, é necessário coletar 30 min ~ 15 µ l ou mais de LCR em temperatura ambiente (~ 23 ° C). Durante este tempo, o mouse pode ser mantido quente com lã de algodão ou tecido, mas sem uma cobertura ou almofada do calor, CSF pode ainda ser com êxito coletado. Adição de uma almofada de calor ou aquecimento o rato antes que o procedimento pode melhorar essa técnica, aumentando o fluxo de LCR fora do cérebro e reduzir o tempo necessário para a coleção, conforme descrito em outros métodos de10,11. Mas o protocolo descrito aqui, nenhuma almofada de calor ou aquecimento do rato foi usado e entre ratos, não havia nenhuma dificuldade no montante de CSF que poderia ser coletado. Como um exemplo da aplicação, que desta técnica pode ser usada, os níveis de Aβ humano42 foram medidos usando ELISA. Aβ é conhecido por ser pegajoso e pode aderir ao vidro e os tubos de coleta. Neste protocolo, capilares de vidro borossilicato e em polipropileno tubos foram utilizados para coletar o CSF de ratos. Enquanto alguns Aβ pode aderir às paredes dos tubos de coleta de capilar de vidro, o ELISA resultados mostram que os níveis Aβ pode ser medido (Figura 3). No entanto, é uma possibilidade que os níveis de Aβ, medidos a partir do CSF recolhido neste protocolo são menor do que a descrita por outros estudos, mas os capilares de vidro são necessários para punção através da dura-máter do mouse para coletar o CSF. Além de medir Aβ, outras proteínas de interesse também podem ser medidas usando o CSF coletado.

Enquanto o método publicado anteriormente CSF coleção por Liu et al . 10 era destinado a coleta contínua de LÍQUOR de ratos vivos, o método descrito aqui é para a coleta de LCR de ratos para ser sacrificados para análise e coleta de tecido. Assim, esta técnica pode ser usada juntamente com outros métodos de dissecação para coleta de tecido do mouse como não afeta o cérebro e a medula espinhal e após a coleta do CSF (isto é, depois de 10-30 min para ~ 10-15 µ l do CSF), o mouse ainda deve estar respirando e sob anestesia. Portanto, outros tecidos, tais como sangue, cérebro, medula espinhal e fígado são ainda viáveis para coleta e análise bioquímica. Embora o Liu et al. método CSF recolhidos muito rapidamente (10 min por mouse para 3-7 µ l do CSF), o método descrito aqui leva mais tempo, mas pode coletar mais CSF10. Outro método para coleta de CSF também tem sido descrito por Maia et al . 11 ambos os Liu et al. e métodos de Maia et al descrevem coletar CSF dos ratos por mão capilares de vidro ou gel de carregador dicas e punção para a cisterna magna. O método descrito aqui é diferente, fixando o capilar para um micromanipulador. Isso garante que o capilar é mantido imóvel e diminui a contaminação do sangue durante a coleta do CSF. O micromanipulador também permite maior precisão e exatidão em perfurar a cisterna magna para obter CSF. Embora o método de et al Maia também foi capaz de obter 15-20 µ l de LCR por rato, requer puncionando a cisterna magna repetidamente à mão com pontas de carregador de gel, que pode aumentar o risco de contaminação por sangue ou tecido. Além disso, o Maia et al . método pode diminuir a pressão no cérebro com cada punção sequencial da cisterna magna, para que haja menos CSF cobrada cada vez. O método descrito aqui envolve apenas uma punção e deixando o capilar na cisterna magna para coletar mais CSF como ele recargas com CSF enquanto o mouse está sob anestesia. Assim, o protocolo descrito aqui continuamente coleta CSF e minimiza a possível contaminação de repetidas punções para a cisterna magna, bem como o rompimento do tecido circundante.

Com a maior coleção de amostra do CSF e pureza, mais análises podem ser usadas com este fluido para outro auxílio na pesquisa de neurociência. É bem conhecida entre os pesquisadores que a coleção da CSF de ratos pode ser tedioso e somente uma amostra limitada pode ser obtida (geralmente indicado como um máximo de 5 a 7 µ l6,7,8,9). Na literatura, não existem muitos detalhadas protocolos publicados para extração do CSF e este protocolo melhora em um método previamente publicados10 para minimizar a contaminação do sangue, mantendo a coleção abundante de LCR. CSF tem muitas aplicações em pesquisas de neurociência e como um dos fluidos mais próximos para os tecidos do SNC, é uma amostra valiosa para pesquisa. Ele foi anteriormente identificado que um rato adulto tem um volume total de 40 µ l de CSF12. Assim, o presente protocolo é capaz de obter 25% e, possivelmente, mais do montante total de LCR em um rato adulto. Além dos camundongos C57BL/6 e APP/PS1 do linhagens puras, a estirpe outbred imprimindo a região de controle (ICR) ratos também tem sido usados para coletar com êxito CSF usando este protocolo. CSF de ratos de várias idades (4 a 18 meses) tem sido recolhida com sucesso usando este protocolo. Assim, não deve haver nenhuma dificuldade na coleta de CSF de diferentes cepas ou idades de ratos com esse método. Este protocolo detalhado será esperançosamente usado por muitos para melhorar o desenvolvimento de ensaios de CSF e outras técnicas de análise para auxiliar na pesquisa para entender as doenças neurodegenerativas que afetam o cérebro e a medula espinhal.

É fundamental que a cabeça do rato ser fixado firmemente, para que ela não se move durante a dissecção e coleção CSF (secção 3 do protocolo). O local para a punção inicial para a cisterna magna é importante para a obtenção de CSF abundante, não-contaminada. O capilar não deve ser inserido perto demais para qualquer vasos sanguíneos para evitar a contaminação da amostra coletada. Além disso, o ajuste do capilar é fundamental para coleção ideal do CSF. O uso do micromanipulador permite ajustes finos ser feita sem muito perturbar o tecido circundante e contaminando o CSF. Usando os controles bem do micromanipulador, o capilar pode ser lentamente movido dentro ou para fora para permitir a CSF flua para fora do mouse e em capilar para coleção.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Nacional Natural Science Foundation da China (81650110527, 81371400) e nacional chave básica pesquisa programa de China (2013CB530900).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloral hydrate (used as anesthetic) Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. 30037517 CAS number 302-17-0.
Dissecting scissors 66 vision technology 54002
Dissecting curved forceps 66 vision technology 53072
Dissecting straight forceps 66 vision technology 53070
Mouse adapter (with ear bars) Made in-house. N/A Similar equipment available from World Precision Instruments.
Dissecting microscope Meiji Labax Model 15381
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Magnetic base for micromanipulator Kanetec MB-K
Glass capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Sutter Instruments Model P-1000
Syringes (1ml) Tansoole 02024692 For 1ml.
Microtubes (1.5ml) Axygen MCT-150-C
Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free Calbiochem 539134
Human Aβ42 ELISA kit Invitrogen KHB3441
Piping (teflon tubing) World Precision Instruments MMP-KIT Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.
Mini centrifuge Tiangen Biotech OSE-MC8
Cotton buds Obtained from any household store/pharmacy. N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer's Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
  2. Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol. 6, (3), 131-144 (2010).
  3. Schoonenboom, N. S. M., et al. Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort. Neurology. 78, (1), 47-54 (2012).
  4. Molinuevo, J. L., et al. The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer's disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer's Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer's Dement. 10, (6), 808-817 (2014).
  5. Fagan, A. M. CSF biomarkers of Alzheimer's disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design. Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).
  6. Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS. Anal. Bioanal. Chem. 404, (10), 2895-2900 (2012).
  7. Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol. Dis. 17, (3), 516-523 (2004).
  8. Schelle, J., et al. Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition. Alzheimer's Dement. (2016).
  9. You, J. -S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid. Proteomics. 5, (1), 290-296 (2005).
  10. Liu, L., Duff, K. A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse. J. Vis. Exp. (21), (2008).
  11. Maia, L. F., et al. Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein. Sci. Transl. Med. 5, (194), 194re2 (2013).
  12. Oshio, K. Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1. FASEB J. (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics