Summary

Um método melhorado para coleta de líquido cefalorraquidiano de ratos anestesiados

Published: March 19, 2018
doi:

Summary

Este protocolo descreve uma técnica melhorada para a coleção abundante de líquido cerebrospinal (CSF), sem contaminação de sangue. Com a maior coleção de amostra e pureza, mais análises podem ser executadas usando o CSF para aprofundar nossa compreensão das doenças que afetam o cérebro e a medula espinhal.

Abstract

O líquido cefalorraquidiano (LCR) é um fluido corporal valioso para análise na pesquisa da neurociência. É um dos fluidos em contato mais próximo com o sistema nervoso central e assim, pode ser usado para analisar o estado doente do cérebro ou da medula espinhal sem acessar diretamente esses tecidos. No entanto, em ratos, é difícil de obter da cisterna magna devido a sua proximidade de vasos sanguíneos, que muitas vezes contaminar amostras. A área para a coleção do CSF em ratos também é difícil de dissecar a e muitas vezes apenas pequenas amostras são obtidas (máximo de 5 a 7 µ l ou menos). Este protocolo descreve, em detalhes, uma técnica que melhora na atuais métodos de coleção para minimizar a contaminação do sangue e permitir a coleção abundante de LCR (em média que 10-15 µ l podem ser coletados). Esta técnica pode ser usada com outros métodos de dissecação na recolha de tecidos de ratos, como isso não afeta quaisquer tecidos durante a extração do CSF. Assim, o cérebro e a medula espinhal não são afetados com esta técnica e permanecem intactos. Com a maior coleção de amostra do CSF e pureza, mais análises podem ser usadas com esta pesquisa de neurociência do fluido para mais ajuda e entendem melhor as doenças que afetam o cérebro e a medula espinhal.

Introduction

O CSF é um fluido corporal valioso para análise na pesquisa da neurociência. O CSF é feito principalmente do plasma sanguíneo, que contém poucas células (sem células vermelhas do sangue e apenas algumas células brancas do sangue) e é quase livre de proteína. É um dos fluidos em contato próximo com o sistema nervoso central (SNC) e pode passar muitos eletrólitos para fora do cérebro e da medula espinhal para o sistema periférico. Em humanos, CSF amostras podem ser coletadas para auxiliar no diagnóstico de doenças ou para fins de pesquisa em ensaios clínicos, como uma punção (ou punção lombar) é um procedimento invasivo, menor: o fluido CSF pode refletir as alterações no SNC sem ter que acessar diretamente estas tecidos. Assim, nos últimos anos, para fins de pesquisa, na clínica, amostras de CSF foram obtidas de pacientes de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer e outras demências1,2,3. Existem muitos ensaios de biomarcador que foram desenvolvidos usando amostras do CSF para potencialmente auxiliar no diagnóstico de doenças na clínica2,3. No entanto, existe muito debate sobre a fiabilidade destes ensaios para produzir resultados consistentes, sensíveis para diagnosticar especificamente doença4,5. Então, há uma grande necessidade para o desenvolvimento de melhores ensaios e alvos, que podem ser encontrados no CSF, para auxiliar na produção de uma norma técnica para diagnosticar doenças neurodegenerativas com maior sensibilidade e especificidade. Devido a importância potencial das amostras de CSF humanas na doença, a coleção de LCR de roedores em pesquisas de Neurociências também é de interesse.

Ratos são animais importantes em pesquisas biológicas e médicas e permitam o teste de potenciais compostos terapêuticos e estudos de prova de conceito antes de testes clínicos em humanos. No entanto, em camundongos é difícil obter amostras CSF devido a sua proximidade ao cérebro de um animal pequeno, como o método usual de coleção do CSF em camundongos é obtê-la através da cisterna magna, uma abertura entre o cerebelo e a superfície dorsal da medulla oblongata. Isso faz com que a dificuldade na coleta de amostras de CSF nesta área é difícil de dissecar a e na proximidade de vasos sanguíneos, aumentando o risco de contaminação das células do sangue. Devido a essas dificuldades, a maioria dos pesquisadores só podem obter uma pequena quantidade de LCR para análise (geralmente indicado como 5 a 7 µ l) e a contaminação das amostras do CSF por pilhas de sangue é uma preocupação primordial para análises6,7,8 , 9. contaminação de sangue pode obscurecer os resultados e não realmente refletem o estado do SNC. Além disso, amostra limitada coletada pode afetar a pesquisa como a quantidade habitual coletada de ratos é suficiente para apenas uma medição (em duplicado ou triplicado) utilizando ensaio imunoenzimático (ELISA). Assim, amostras de CSF são geralmente agrupadas de vários mouses para ter suficiente amostra para executar vários ensaios. Desenvolver um protocolo para a abundante, coleção incontaminada de LCR de ratos é muito desejada e será benéfica na melhoria da investigação neurociência usando roedores.

Neste protocolo, uma técnica para a abundante (uma média de 10-15 µ l) coleção de LCR de ratos anestesiados é descrita em detalhes e melhora em um método atualmente conhecido da coleção do CSF para minimizar a contaminação do sangue10. Um protocolo robusto para coleção CSF ajudarão no desenvolvimento dos ensaios baseados em CSF biomarcador, que poderia ser usado para auxiliar no diagnóstico de doenças, bem como melhorar a pesquisa para os mecanismos subjacentes a doenças que afectam o CNS.

Protocol

Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com as políticas da sociedade de neurociência (EUA) e comissões de ética de Fudan University (Shanghai, China). Este procedimento é para uma cirurgia não-sobrevivência. 1. instalação de aparelhos de coleção do CSF Puxe o vidro capilar (diâmetro interno de 0,75 mm, diâmetro externo 1,0 mm) usando um extrator de micropipeta (conforme mostrado no Liu et al . 10; capilar afiad…

Representative Results

Usando o procedimento descrito aqui (Figura 1 e Figura 2), o CSF imediatamente recolhido no capilar deve ser clara (Figura 2E), não rosa ou vermelho. Se houver uma rosa para coloração avermelhada para o fluido coletado no capilar, depois houve contaminação com sangue. Como um exemplo da aplicação da amostra do CSF coletados com esse …

Discussion

Este protocolo descreve, em detalhes, uma técnica que melhora na atual métodos10 da coleção do CSF para minimizar a contaminação do sangue e permitir a coleção abundante de LCR (em média ~ 10-15 µ l podem ser obtidos) dos ratos. Ao quebrar a ponta capilar, a ponta do capilar não deve ser muito pequena (como então o CSF será extraído muito lentamente) ou muito grande (vontade não ser fino o suficiente para recolher o CSF e tecido pode tornar-se alojou no capilar). Tenha cuidado quand…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Nacional Natural Science Foundation da China (81650110527, 81371400) e nacional chave básica pesquisa programa de China (2013CB530900).

Materials

Chloral hydrate (used as anesthetic) Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. 30037517 CAS number 302-17-0.
Dissecting scissors 66 vision technology 54002
Dissecting curved forceps 66 vision technology 53072
Dissecting straight forceps 66 vision technology 53070
Mouse adapter (with ear bars) Made in-house. N/A Similar equipment available from World Precision Instruments.
Dissecting microscope Meiji Labax Model 15381
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Magnetic base for micromanipulator Kanetec MB-K
Glass capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Sutter Instruments Model P-1000
Syringes (1ml) Tansoole 02024692 For 1ml.
Microtubes (1.5ml) Axygen MCT-150-C
Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free Calbiochem 539134
Human Aβ42 ELISA kit Invitrogen KHB3441
Piping (teflon tubing) World Precision Instruments MMP-KIT Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.
Mini centrifuge Tiangen Biotech OSE-MC8
Cotton buds Obtained from any household store/pharmacy. N/A

References

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Cite This Article
Lim, N. K., Moestrup, V., Zhang, X., Wang, W., Møller, A., Huang, F. An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice. J. Vis. Exp. (133), e56774, doi:10.3791/56774 (2018).

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