Author Produced

المناولة والمعالجة من الذكور ثعبان (أنغيلا أنغيلا) للنضج الهرموني وتجميد الحيوانات المنوية

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

بروتوكولات لتجميد الحيوانات المنوية ونضوج ثعبان قد تحسنت خلال السنوات الأخيرة. توضح هذه المقالة بروتوكول أفضل متوفرة باستخدام تروج المشيمية البشرية (hCG) لتحريض نضوج والميثانول كريوبروتيكتانت.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Herranz-Jusdado, J. G., Kása, E., Kollár, T., Gallego, V., Peñaranda, D. S., Rozenfeld, C., Pérez, L., Horváth, Á., Asturiano, J. F. Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation. J. Vis. Exp. (131), e56835, doi:10.3791/56835 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

خلال السنوات الماضية، قد عملت مجموعات بحثية عديدة في تطوير وتحسين بروتوكولات جديدة للتعامل مع ثعبان والنضج. اعتبارا من بعد، أثبتت حقن أسبوعية تروج المشيمية البشرية (hCG) ماتوراتي الذكور بعد 5-6 أسابيع فقط من العلاج، وتنتج كميات كبيرة من الحيوانات المنوية عالية الجودة خلال عدة أسابيع. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام extenders مختلفة البروتوكولات تجميد الحيوانات المنوية، المنتجة والتبريد وذوبان مرات سابقا وصفت لثعبان. هنا، نحن إظهار أن الحل الموسع Tanaka´s يمكن استخدامها مباشرة للتسميد أو لنعد، مما يجعل غير الضرورية استخدام أنواع مختلفة من الحلول وتخفيف. وعلاوة على ذلك، يجعل استخدام الميثانول كريوبروتيكتانت هذا البروتوكول سهلة الاستخدام كما الميثانول سمية منخفضة وعدم تنشيط الحيوانات المنوية. الحيوانات المنوية لا تحتاج إلى أن cryopreserved فورا بعد إضافة كريوبروتيكتانت، ويمكن استخدامه بعد فترة طويلة يجري مذاب. وعلاوة على ذلك، أن عدد الحيوانات المنوية الحركة لا تزال مرتفعة بعد ذوبان الجليد على الرغم من أنها أقل من الحيوانات المنوية الطازجة. والهدف من هذا العمل لإظهار أفضل البروتوكول متاح لثعبان المناولة والنضج، وتجميد الحيوانات المنوية.

Introduction

على مدى السنوات ال 25 الماضية، وقد انخفض عدد ثعبان (أنغيلا أنغيلا) التوصل إلى الساحل الأوروبي اطراد 90% 1،،من23. وهناك العديد من العوامل التي تفسر هذا الانخفاض الحاد بما في ذلك التلوث، والالتهابات، وتدمير الإفراط في صيد الأسماك، والموئل. وكل هذا كان لها تأثير عميق على هذه الأنواع، مما أدى إلى إدراج ثعبان البحر الأوروبي في "الاتحاد الدولي" لصون الطبيعة (IUCN) قائمة ك 4الحرجة المهددة بالانقراض. ونتيجة لذلك، لا بد من تطوير تقنيات وبروتوكولات للتكاثر في الأسر.

نضوج ثعبان البحر الأوروبي في الأسر ويتحقق من خلال العلاج الهرموني 5،،من67 ولكن من الصعب إنتاج الأمشاج في كلا الجنسين لمزامنة 8. 10، توقيت النضج النهائي في الإناث على الرغم من أن تنمية جديدة الاندروجين يزرع أظهرت للتعجيل بتكون البويضات في الثعابين 9،لا يزال المتغير للغاية ويصعب التحكم في 11. ولذلك، التخزين القصير الأجل للحيوانات المنوية 12،،من1314 ونعد تقنيات ضرورية لإدارة التكاثر، مما يجعل مشيج المزامنة لا لزوم لها 8.

وقد وضعت تجميد الحيوانات المنوية ثعبان منذ عام 2003 15،16. تصميم الباحثين عدة بروتوكولات ناجحة باستخدام ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) أو الميثانول المنتجة 16،،من1718،،من1920. على الرغم من أن كلا البروتوكولين قد استخدمت بنجاح، استمرارية الخلية التي تم الحصول عليها من الحيوانات المنوية المذابة cryopreserved مع [دمس] أقل مع الميثانول 20،21. وعلاوة على ذلك، ثعبان البحر الحيوانات المنوية يتم تفعيلها على اتصال مع [دمس] ويتطلب معالجة الحيوانات المنوية أكثر مملة 19، وبالتالي الميثانول كريوبروتيكتانت أكثر ملاءمة للحيوانات المنوية ثعبان من [دمس].

هنا، والبروتوكول للتعامل مع المثلى والعلاج الهرموني من ثعبان البحر الأوروبي سيرد أدناه. وبالإضافة إلى ذلك، سوف يكون البروتوكول تجميد الحيوانات المنوية ثعبان أفضل استخدام الميثانول كريوبروتيكتانت وبروتوكول لتقييم نوعية الحيوانات المنوية في هذه الأنواع أيضا وصف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أقر جميع الإجراءات للعمل مع ثعبان الموصوفة في هذا البروتوكول "لجنة أخلاقيات التجريب الحيوان" في جامعة Politècnica دي València، وفقا للقوانين الإسبانية وقواعد تنظيمية لمراقبة التجارب و الإجراءات المتعلقة بالحيوانات الحية.

1-الأسماك الصيانة

  1. جلب الثعابين الأوروبية إلى مرفق بحوث ووضعها في الأحواض المائية 200 لتر مع نظام إعادة تدوير. استخدام الحرارة ومبردات للحفاظ على درجة حرارة ثابتة في 20 درجة مئوية.
  2. الحفاظ على الأسماك في ظروف مظلمة لتجنب الإجهاد22 ومع أي طعام أثناء التجربة.
  3. الحفاظ على الأسماك في المياه العذبة خلال أول 3 أيام. ثم تغيير 1/3 ماء والملء بمياه البحر كل يوم حتى وصلت إلى ملوحة من 37.0 ± 0.3 غ/ل.

2. العلاج الهرموني

ملاحظة: العلاج الهرموني يتكون من حقن أسبوعية تروج المشيمية البشرية (hCG) طوال المدة (تسعة أسابيع) بأسرها من التجربة.

  1. تعد قوات حرس السواحل الهايتية هرمون مسبقاً في تركيز 1 وحدة دولية/ميليلتر بتمييع هذا الهرمون في المحلول الملحي (0.9% كلوريد الصوديوم).
    ملاحظة: هذا الهرمون يمكن الحفاظ على المخفف بتركيز هذا لأكثر من أسبوع عند-18 درجة مئوية.
  2. لتخدير الأسماك، تحضير دلو ل 40 مرنة مع 5 لتر من الماء النظام.
    1. في قارورة 250 مل، تمييع 300 ملغ البنزوكائين في 100 مل إيثانول 70%.
    2. من أجل البنزوكائين المخفف في الدلو (التركيز النهائي 0.36 مم) وتخلط بشكل صحيح. هذا لتركيز البنزوكائين نهائي من 60 مغ/لتر.
    3. نقل الأسماك، كل على حدة، في الماء مع البنزوكائين وانتظر بضع ثوان حتى البنزوكائين سريان مفعول والأسماك يتم تخديره بشكل صحيح.
      ملاحظة: للتأكد من أن يتم تخديره من الأسماك، وضع السمك في موقف ضعيف والتحقق من أن يبقى في هذا الموقف.
  3. أن تول الهرمون وزن الأسماك وإعداد قوات حرس السواحل الهايتية الهرمون بجرعة 1.5 وحدة دولية/غرام أسماك، في أنبوب بلاستيكي 1.5 مل.
    1. ملء حقنه 1 مل مع قوات حرس السواحل الهايتية الهرمون من أنبوب بلاستيكي.
    2. ضع السمك أنيسثيتيزيد في موقف ضعيف ومع المساعدة أو المحاقن، حقن الهرمونات بعناية في منطقة داخل.
  4. إرجاع السمك للأحواض المائية ورصد حتى شُفي تماما.
    ملاحظة: الإدارة الهرمونية قد تجري أسبوعيا طوال التجربة. عادة، تبدأ ثعبان سبيرماتينج بعد 6-7 أسابيع من العلاج الهرموني.

3. أخذ عينات من الحيوانات المنوية

  1. للحصول على عينات ذات جودة أفضل، استخراج الحيوانات المنوية 24 ساعة بعد6،الإدارة الهرمونية23.
  2. تخدير السمك مع البنزوكائين كما هو موضح في الخطوة 2، 2.
  3. ضع السمك أنيسثيتيزيد في موقف ضعيف وتنظيف المنطقة التناسلية مع بخ ماء المقطر والجاف بعناية مع الورق، لتجنب تلوث البراز الموجودة في المنطقة التناسلية أو تنشيط الحيوانات المنوية عرضي بالاتصال مع مياه البحر من الأحواض المائية.
  4. وضع الأصابع على كلا الجانبين الجانبي من الأسماك، تدليك بعناية الضغط جانبياً من الزعانف الصدرية إلى المنطقة التناسلية قوة الحيوانات المنوية خارجاً.
    1. كرر التدليك حتى لا أكثر من الحيوانات المنوية يخرج من فتح الأعضاء التناسلية للإناث.
  5. جمع الحيوانات المنوية في أنابيب بلاستيكية 15 مل باستخدام مضخة فراغ.
  6. تمييع الحيوانات المنوية المستخرجة 01:10 في تعديل Tanaka´s الموسع حل24 (مم 137 كلوريد الصوديوم، 76.2 مم NaHCO3، في الماء المقطر) في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: ينبغي أن تبقى الحيوانات المنوية في الحل الموسع عند 4 درجة مئوية.

4. تقييم جودة الحيوانات المنوية

  1. تعد مياه البحر الاصطناعي13 (مم: كلوريد الصوديوم 354.7، مجكل2 52.4، كاكل2 9.9، غ2هكذا4 28.2، 9.4 بوكل، في الماء المقطر) مع 2% ألبومين المصل البقري (BSA) (w:v)، ضبط الأس الهيدروجيني إلى 8.2، أوسمولاليتي لموسم 1100 كيلوجرام، والحفاظ على ففي 4 درجة مئوية لتجنب النمو الجرثومي.
  2. افتح البرنامج لتحليل الحيوانات المنوية الحاسوب (CASA)، وحدد الوحدة النمطية الحيوانات المنوية الأسماك.
    1. انقر فوق خصائص لفتح إعداد النظام للبرنامج. هناك، تعيين خيارات الالتقاط في 60 صورة في الثانية الواحدة. حدد المرحلة السلبية البصريات، الدائرة ماكلير ومقياس X 10.
    2. ثم على التحليل القيم، حدد الأسماك حسب الأنواع و مجال الجزيئات أكبر من 2 ميكرومتر2 وأصغر من 20 ميكرومتر2.
    3. على المعلمات السرعة، تعيين إلى بطء عند الخلايا الانتقال بين 10 و 45 ميكرومتر/s، وتعيين إلى متوسط عند الانتقال بين 45 و 100 ميكرومتر/s وتعيين إلى السريع عندما تتحرك أسرع من 100 ميكرومتر/s.
      ملاحظة: تعتبر اسم المني بسرعة أبطأ من 10 ميكرون/s.
    4. قم بتحديد القيم التقدمية 80 ٪ من الاستقامة (STR) وحفظ الخصائص.
    5. انقر فوق الحقل التقاط (سيتم فتح نافذة مع الصور مباشرة من الكاميرا).
      ملاحظة: يتم تشكيل نظام تحليل الحيوانات المنوية الحاسوب مجهر وكاميرا وبرنامج تحليل صورة.
  3. في قاعة الفرز، وضعت 4 ميليلتر من مياه البحر الاصطناعي وإضافة 0.5 ميليلتر من حل الحيوانات المنوية (الحيوانات المنوية تضعف في حل موسع).
    1. التركيز الصورة مع المجهر بتكبير X 10 في مرحلة سلبية. 15 s بعد التنشيط، انقر فوق التقاط-من الفيديو في برنامج تحليل الحيوانات المنوية الحاسوب.
    2. تحليل كل عينة في تتبع وتحديد العينات مع حركية أعلى من 70% لنعد.
      ملاحظة: من المهم جداً لتحديد فقط جودة الحيوانات المنوية لنجاح هذا البروتوكول للواسمات.

5. طريقة تجميد الحيوانات المنوية

  1. تحضير النيتروجين السائل في وقت مبكر (حوالي 2.5 لتر) في 34 سم × 34 سم × 30 سم و 5 سم مربع الستايروفوم سميكة.
    ملاحظة: الاحتفاظ بمستوى النتروجين السائل من 4-5 سم الارتفاع في جميع الأوقات.
    1. بناء هيكل عائم قبل تجميد الحيوانات المنوية. استخدام 2 قطعة من البوليسترين (20 سم × 5 سم) وربطها بأنابيب بلاستيكية 2، ووضع الهيكل على النتروجين السائل. ويلزم هذا الهيكل تطفو فوق النتروجين السائل الارتفاع تقريبي 3 سم فوق السطح (الشكل 1).

Figure 1
الشكل 1 . التخطيطي رسم هيكل عائم يستخدم لتجميد مسبقاً على النتروجين السائل. الهيكل يتكون من قطعتين من الكثافة السكانية المنخفضة الستايروفوم من 20 سم × 4 سم × 5 سم متصلة بأنابيب بلاستيكية من 14 سم. وتوضع القش عبر أنابيب بلاستيكية في 3 سم على النتروجين السائل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

  1. إعداد الحل نعد بخلط الحيوانات المنوية، والحل الموسع الميثانول في نسبة 1:8:1 في 1.5 مل البلاستيكية أنابيب ويقلب بلطف.
  2. مع المساعدة من ماصة، إضافة ميليلتر 480 الحل للواسمات في القش ميليلتر 500 وإذا لزم الأمر، وضع علامة عليها بإغلاق أحد طرفي مع نمذجة الطين.
  3. وضع القش على جهاز عائم على ارتفاع 3 سم على النتروجين السائل لمدة 3 دقائق. ثم، ضع القش في النيتروجين السائل.
  4. بعد 10-15 دقيقة، نقل القش في صهريج لتخزين نيتروجين سائل باستخدام الملقط طويلة والاحتفاظ بها غارقة في النتروجين السائل في جميع الأوقات. وهنا، يمكن تخزين الحيوانات المنوية إلى أجل غير مسمى.

6-جمود الأسلوب

  1. إعداد مربع الستايروفوم مع النيتروجين السائل كما هو موضح في الخطوة 5، 1، وإعداد حمام مائي باستخدام كوب 3 لتر بماء الصنبور في 40 درجة مئوية.
  2. نقل القش مع الحيوانات المنوية المجمدة من خزان التخزين في المربع الستايروفوم مع النتروجين السائل باستخدام الملقط طويلة.
    1. وضع كل سترو في حمام مائي في درجة 40 مئوية 13 ثانية.
    2. صب الحيوانات المنوية في أنبوب بلاستيكي 1.5 مل بقطع نهايات مغلقة من القش مع المقص.
  3. تحليل عدد الحيوانات المنوية الحركة باستخدام نظام تحليل الحيوانات المنوية الحاسوب كما هو موضح في الخطوة 4، 1.
  4. تبقى 100 ميليلتر من الحيوانات المنوية لتحليل جدوى المني مع سيتوميتير تدفق.

7-التدفق الخلوي

  1. استخدام أدوات فلورسنت تتضمن يوديد propidium (PI)، وهو مركب نيون أحمر بقع نواة الخلايا الميتة، ومجمع فلورسنت غشاء بيرمينت نووية، أن الأخضر بقع نواة الخلايا الحية.
    1. إعداد الحل المصبوغة الفلورية الخضراء باذابته من الحل الأسهم (1 ملم) 01:10 في المتوسط Tanaka´s لإيجاد حل عملي من 100 ميكرومتر.
    2. عدم تمييع الحل بي. الحل الأسهم 2.4 ملم.
  2. لكل عينة، تأخذ 50 ميليلتر من الحيوانات المنوية الطازجة أو المذابة وإضافة 0.5 ميليلتر من الفلورية الخضراء تلطيخ العامل الحل (التركيز النهائي 1 ميكرومتر) و 2 ميليلتر من حل PI (تركيز نهائي 100 ميكرومتر).
  3. احتضان هذه العينات تحتوي على الصبغات (PI وتلطيخ الفلورية الخضراء) في الظلام لمدة 5 دقائق.
    1. تمييع هذه العينات في 500 ميليلتر من Tanaka´s الموسع حل وتحليل مع cytometer التدفق.
  4. قم بتشغيل سيتوميتير تدفق وإنشاء بروتوكول جديد يحتوي على قطع مالا يقل عن 2: SS تسجيل سجل مقابل خ ومقابل FL1 FL3.
    ملاحظة: كلا، يمكن متحمس يوديد تلطيخ و propidium نيون مع الضوء المرئي الطول الموجي الأخضر. عندما تلتزم بالحمض النووي، هي انبعاث هذه الأصباغ الفلورية أقصى 516 نيوتن متر و 617 شمال البحر الأبيض المتوسط، على التوالي.
    1. ضبط الفولتية من أشعة الليزر المختلفة: SS = 199؛ خ م = 199؛ FL1 = 377؛ FL3 = 372
    2. قم بإعداد الاتفاق الحصول على إعدادات لإحداث أقصى = 5000 أو 15 ثانية (يجب أن يكون التركيز النهائي للعينة حوالي 1 مليون من خلايا/مل). قراءة العينة باستخدام تدفق المنخفض .
    3. حدد وضع القراءة أنبوب واحد ثابت وضع الموقف.
    4. وضع العينة في العدد الصحيح دائري
    5. قراءة العينة (الضغط على F9) وحفظ البيانات إلى ملف excel (ضغط F7) لمزيد من التحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الحيوانات المنوية من الثعابين 18 مع عدد الحيوانات المنوية حركة 70 في المائة أو أعلى من ذلك، اختير لهذه الدراسة. أظهرت النتائج انخفاضا في جميع بارامترات نوعية بعد ذوبان الجليد مقارنة مع تلك من الحيوانات المنوية الطازجة (الجدول 1 و الشكل 2). نتائج الحركة (يعني ± S.E.M.، n = 18) أظهرت حركية مجموع أعلى وحركة تقدمية في الحيوانات المنوية الطازجة من مجموع حركية وحركية التقدمية التي وجدت في عينات الحيوانات المنوية بعد ذوبان الجليد.

تم العثور على نفس النمط في تحليل الخلايا المنوية سريعة، حيث قدمت العينات المجمدة-إذابة نسبة أقل من الخلايا سريعة من نماذج جديدة. وباﻹضافة إلى ذلك، خفضت سرعات الحيوانات المنوية الخلية تقاس أيضا في عينات بعد ذوبان.

وأظهرت النتائج أيضا، أن بقاء الخلية بعد ذوبان الجليد قدمت تخفيضاً في الخلايا المنوية الحية 23 ± 3.1 في المائة (يعني ± S.E.M.، n = 18) من عينات جديدة لإذابة المجمدة (الجدول 1 و الشكل 2).

Figure 2
الشكل 2 . حركية وسرعة المنحنية الخطوط وبيانات الخلية بقاء الحيوانات المنوية الطازجة والحيوانات المنوية المذابة (بعد تجميد). وكان cryopreserved الحيوانات المنوية عن 24 ساعة قبل يجري مذاب. القيم المعروضة هي وسائل ± S.E.M. للحيوانات المنوية من عينات 18. تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة بين العينات المذابة والطازجة (الاختبار t; p < 0.05). حركية المعلمة أشارت إلى أن النسبة المئوية لمجموع المني متحركة، المنحنية الخطوط السرعة أشارت إلى متوسط سرعة المني على طول مسار منحنى الأضلاع، وبقاء الخلية أشارت إلى أن النسبة المئوية للمني على قيد الحياة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الخلايا سريعة + متوسطة1 (%) 70.7 ± 2.8 2.1* 27.5 ±
السرعة المنحنية الخطوط (VCL؛ ميكرومتر/s) 118.8 ± 2.8 1.8* 101.5 ±
سرعة الخط المستقيم (VSL؛ ميكرومتر/s) 53.3 ± 1.9 1.3* 45.6 ±
مسار متوسط السرعة (برنامج عمل فيينتيان؛ ميكرومتر/s) 73.3 ± 2.1 1.3* 62.0 ±
الضرب عبر التردد (هرتز) 27.9 ± 0.3 27.1 ± 0.6
بقاء الخلية (% من الخلايا على قيد الحياة) 97.7 ± 0.3 2.8* 73.8 ±
1 الخلايا إظهار السرعة المنحنية الخطوط أعلاه 40 ميكرومتر/s.

الجدول 1. ملخص نتائج معلمات مختلفة تم تحليلها مع نظام تحليل الحيوانات المنوية الحاسوب من عينات جديدة والمذابة. كانت cryopreserved العينات المذابة سابقا ح 24. كافة القيم المعروضة كما يعني ± S.E.M. (n = 18). تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة بين العينات المذابة والطازجة (الاختبار t; p < 0.05). كانت المعلمات تم تحليلها: متحركة المني يعرف بأنه النسبة المئوية لمجموع الخلايا متحركة؛ الحركة التقدمية يعرف بأنه النسبة المئوية للمني التي تسبح إلى الأمام في خط مستقيم أساسا؛ الخلايا سريعة ومتوسطة المعرفة كنسبة مئوية من المني سرعتها المنحنية الخطوط متوسط فوق 40 ميكرومتر/ثانية؛ السرعة المنحنية الخطوط المحددة كمتوسط سرعة المني من خلال مساره منحنى الأضلاع؛ قياس سرعة خط مستقيم يعرف بأنه متوسط سرعة المني من موضع المكتشف الأول إلى موقفها الأخير في خط مستقيم؛ مسار متوسط السرعة المحددة كمتوسط السرعة للمني على طول مساره متوسط المكانية؛ ضرب التردد عبر يعرف المعدل المتوسط الذي يعبر مسار الحيوانات المنوية منحنى الأضلاع رأسه مساره المسار المتوسط؛ بقاء الخلية المحددة كنسبة مئوية من المني على قيد الحياة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويصف هذا البروتوكول عملية كاملة لنعد ثعبان نضوج والمناولة والحيوانات المنوية. تربية الشروط الموضحة هنا الأمثل للنضج السريع وإنتاج كميات كبيرة من الحيوانات المنوية عالية الجودة في هذه الأنواع 6،7،25. نجاح هذا البروتوكول للواسمات وعن الاستخدام المحتمل للاخصاب بعد ذوبان الجليد تعتمد إلى حد كبير على نوعية جديدة من الحيوانات المنوية 26. ولذلك، يتم انتقاء الحيوانات المنوية عالية الجودة ذات أهمية كبيرة. علما بأن الحيوانات المنوية ذاتية نوعية التقييم يعتمد على المهارات والإدراك والتدريب للباحث الذي يقوم بتقييم العينات 5،،من2728 ويمكن أن يؤدي إلى تقديرات نوعية مختلفة جداً اعتماداً على باحث 29. لذلك، ينصح استخدام تحليل الحيوانات المنوية الحاسوب لتحديد عينات ذات جودة أفضل لنعد.

نتائج نوعية الحيوانات المنوية بعد ذوبان المعروضة هنا أظهرت انخفاضا في بارامترات حركية، والسرعة، وبقاء الخلية. وهذا يتسق مع المراجع المتاحة، على الرغم من وجود اختلاف كبير بين الأنواع 26،30. على سبيل المثال، في دراسة مع سمك السلمون الأطلسي (Salmo سالار)، تم تجميد الحيوانات المنوية الطازجة مع حركية من 70-95% استخدام المنتجة مختلفة ([دمس] والميثانول). عدد الحيوانات المنوية الحركة بعد ذوبان الجليد كان أقل بكثير من العينات الطازجة، مع قيم حركية في البروتوكول أفضل من 8.2 في المائة، ولكن معدل الإخصاب باستخدام الحيوانات المنوية المذابة كان يصل إلى 42.8 في المائة، مما يمثل 95% من عنصر التحكم (الحيوانات المنوية الطازجة) 31. وفي دراسة مختلفة مع الحيوانات المنوية من المحيط الأطلسي سمك الهلبوت (هيبوجلوسوس هيبوجلوسوس)، تم العثور على لا انخفاض كبير في عدد الحيوانات المنوية الحركة بعد تجميد ومعدل التسميد باستخدام الحيوانات المنوية المذابة وكان ما يزيد على 95% 32.

في ثعبان، أظهرت الدراسات السابقة أيضا انخفاضا في عدد الحيوانات المنوية الحركة بعد تجميد صرف النظر عن كريوبروتيكتانت استخدام 16،18. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت cryopreserved الحيوانات المنوية من ثعبان ذات نوعية مماثلة بنجاح للاخصاب 8. في هذه الدراسة، أستوريانو et al. [دمس] كريوبروتيكتانت. الاستخدام [دمس] على بعض العيوب التلاعب منذ هذه كريوبروتيكتانت ينشط الحيوانات المنوية ويحتاج ذلك أن تجمد فورا عند إضافة [دمس]. أيضا، يحتاج إلى التلقيح بالحيوانات المنوية المذابة ستجري مباشرة بعد ذوبان الجليد. انخفاض الرقم الهيدروجيني الحيوانات المنوية جزئيا يمكن أن يحل هذه المشكلة 19، ولكن البروتوكول أكثر حساسية من البروتوكول المعروضة هنا مع الميثانول كريوبروتيكتانت.

وقد أظهرت الدراسات عدة نتائج إيجابية باستخدام الميثانول كريوبروتيكتانت. على سبيل المثال، في دراسة أجريت مع ثعبان السمك الياباني (أنغيلا japonica) استخدام بروتوكول مشابهة جداً لتلك المعروضة هنا، مع 10 ٪ الميثانول كريوبروتيكتانت، المؤلفون بنجاح يخصب البيض باستخدام الحيوانات المنوية الطازجة و cryopreserved. في هذه الدراسة، حصلوا على معدلات التسميد 17% مع لا اختلافات كبيرة بين الحيوانات المنوية الطازجة و cryopreserved 33.

أثبت البروتوكول المعروضة هنا للحفاظ على نوعية الحيوانات المنوية كافية بعد ذوبان الجليد، وإظهار خصائص الحيوانات المنوية مماثلة بعد ذوبان الجليد من البروتوكولات باستخدام الموسعات المختلفة والمنتجة، ولكن مع مزايا سهولة التعامل قبل و بعد للواسمات. من المهم جداً أن تتبع بدقة التبريد وذوبان مرات الموصوفة هنا، فضلا عن استخدام الحيوانات المنوية عالية الجودة. في الدراسات المستقبلية، وسيتم اختبار تجارب التسميد باستخدام هذا البروتوكول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

هذا المنشور كان يموله أفق 2020 البحث الاتحاد الأوروبي في والابتكار برنامج إطار المنحة ماري سكلودوفسكا-كوري لا 642893 (إعجاب)، مكتب التكلفة (تكلفة العمل فا 1205، أقواجاميتي)، ومركز البحوث للتميز- 1476-4/2016/فكة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 AQUACEN 3394ESP Benzocaine
NaCl Avantor  3624-19
Syringe BD Plastipak 305501 Syringe 1 mL
FC500 Beckman Coulter Flow cytometer
Air pump 100 EHEIM 4011708370032 Modified for suction
Eppendorf 1.5 Eppendorf 175508 Plastic tubes 1.5 mL
Falcon tubes Falcon 175747 Plastic tubes 15 mL
Flexible bucket Fiel 1040101 40 L, Black color.
Ethanol Guinama SL Mg96270
Cyopreservation straws  IMV Technologies 14550 500 µL straws
Live/Dead Sperm Viability Kit Invitrogen L7011 Cytometer Kit
Modelling clay JOVI Art 30 4 different colors
Precision scale PCB KERN & Sohn GmbH PCB35002 Digital scale
Saline solution Vitulia 0.9% Laboratorios Ern, S.A. C.N. 999790.8 Saline solution
Forceps Levantina de Lab. SL 3710025 30 cm metal forceps
Scissors Levantina de Lab. SL 3700014 Scissors 14cm
Ovitrelle (r-hCG) Merck SL EMEA/H/C/000320 Human chorionic gonadotropin
Nikon Eclipse 80i Nikon Microscope
CaCl2 Panreac Quimica SAU 2112211210
Na2SO4 Panreac Quimica SAU 3257091611
NaHCO3 Panreac Quimica SAU 1416381210
782M Camera Proiser 782M Camera for CASA
ISAS v1 Proiser ISAS v1 CASA software
SpermTrack-10 Proiser SpermTrack-10 Countig chamber for CASA
Beaker Pyrex 3L PYREX 2110668 Glass beaker 3L
Flask Pyrex 250 GL-45 PYREX 21801365 Glass flask 250 mL
KCl Scharlab SL PO02000500
Methanol Scharlab SL ME03061000
MgCl2 Scharlab SL MA00370500
BSA Sigma Aldrich 05482 Bovine serum albumina
Styrofoam box 34x34x30 cm and 5cm thick

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. ICES_Working_Group_on_Eels. Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. 246 (2011).
  2. Moriarty, C. European Catches of Elver of 1928-1988. Int. Rev. Hydrobiol. 75, (6), 701-706 (1990).
  3. Dekker, W. The fractal geometry of the European eel stock. ICES J. Mar. Sci. 57, (1), 109-121 (2000).
  4. Jacoby, D., Gollock, M. Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. (2014).
  5. Asturiano, J. F., et al. Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality. Theriogenology. 66, (4), 1012-1020 (2006).
  6. Pérez, L., et al. Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment. J. Fish Biol. 57, (6), 1488-1504 (2000).
  7. Gallego, V., et al. Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation. Aquaculture. 354, 7-16 (2012).
  8. Asturiano, J. F., Sørensen, S. R., Pérez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity. Reprod. Domestic Anim. 51, (4), 485-491 (2016).
  9. Di Biase, A., et al. Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development. Aquaculture. 479, 508-515 (2017).
  10. Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment. Aquaculture. 437, 111-119 (2015).
  11. Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality. Aquaculture. (2016).
  12. Ohta, H., Izawa, T. Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa. Aquaculture. 142, (1-2), 107-118 (1996).
  13. Peñaranda, D. S., et al. European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage. Reprod. Domestic Anim. 45, (3), 407-415 (2010).
  14. Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa. Aquaculture. 198, (3), 339-351 (2001).
  15. Asturiano, J., et al. Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm. Fish Physiol. Biochem. 28, (1), 501-502 (2003).
  16. Asturiano, J., et al. Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm. Fish Physiol. Biochem. 30, (3), 283-293 (2004).
  17. Szabó, G., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants. Acta. Biol. Hung. 56, (1-2), 173-175 (2005).
  18. Müller, T., et al. Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla. J World Aquac Soc. 35, (2), 225-231 (2004).
  19. Peñaranda, D. S., Pérez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants. Cryobiology. 59, (2), 119-126 (2009).
  20. Marco-Jiménez, F., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants. Cryobiology. 53, (1), 51-57 (2006).
  21. Asturiano, J. F., et al. Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology. Reprod. Domestic Anim. 42, (2), 162-166 (2007).
  22. Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light. Isr. J. Aquac. 64, (2012).
  23. Ohta, H., et al. Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica. Fish Physiol. Biochem. 17, (1), 163-169 (1997).
  24. Tanaka, S., et al. Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel. J. Fish Biol. 60, (1), 139-146 (2002).
  25. Gallego, V., et al. Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen. Reprod. Fertil. Dev. 27, (3), 529-543 (2015).
  26. Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. (2016).
  27. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130, (4), 425-433 (2001).
  28. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234, (1-4), 1-28 (2004).
  29. Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57, (1), 149-179 (2002).
  30. Magnotti, C., et al. Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species. Rev. Aquacult. (2016).
  31. Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domagała, J. Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets. Theriogenology. 76, (2), 300-311 (2011).
  32. Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. Aquac. Int. 16, (6), 561-572 (2008).
  33. Müller, T., et al. Japanese eel (Anguilla japonica Temminck & Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples. J. Appl. Ichthyol. 33, (3), 550-552 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics