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हैंडलिंग और हार्मोनल परिपक्वता और शुक्राणु Cryopreservation के लिए पुरुष यूरोपीय ईल (एंगुइला एंगुइला) का उपचार

Developmental Biology

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Summary

यूरोपीय मछली परिपक्वता और शुक्राणु cryopreservation के लिए प्रोटोकॉल पिछले वर्षों में सुधार किया गया है । यह आलेख cryoprotectant के रूप में परिपक्वता और मेथनॉल उत्प्रेरण के लिए मानव chorionic गोनॉडोट्रॉफिन (एचसीजी) का उपयोग कर उपलब्ध सबसे अच्छा प्रोटोकॉल का वर्णन करता है ।

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Herranz-Jusdado, J. G., Kása, E., Kollár, T., Gallego, V., Peñaranda, D. S., Rozenfeld, C., Pérez, L., Horváth, Á., Asturiano, J. F. Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation. J. Vis. Exp. (131), e56835, doi:10.3791/56835 (2018).

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Abstract

पिछले वर्षों के दौरान, कई अनुसंधान समूहों के विकास और यूरोपीय मछली हैंडलिंग और परिपक्वता के लिए नए प्रोटोकॉल के सुधार पर काम कर रहा है । अभी तक के रूप में, मानव chorionic गोनॉडोट्रॉफिन के साप्ताहिक इंजेक्शन (एचसीजी) maturate पुरुषों के उपचार के सिर्फ 5-6 सप्ताह के बाद साबित कर दिया है, कई हफ्तों के दौरान उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु के उच्च मात्रा में उत्पादन । इसके अलावा, शुक्राणु cryopreservation प्रोटोकॉल अलग extenders, cryoprotectants और ठंडा और गल बार का उपयोग कर पहले यूरोपीय मछली के लिए वर्णित किया गया है । यहां, हम बताते है कि तनाका ´ एस भरनेवाला समाधान सीधे निषेचन के लिए या cryopreservation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, समाधान और कमजोर पड़ने के विभिंन प्रकार के अनावश्यक उपयोग कर । इसके अलावा, एक cryoprotectant के रूप में मेथनॉल का उपयोग इस प्रोटोकॉल मेथनॉल कम विषाक्तता है और शुक्राणु को सक्रिय नहीं करता है के रूप में उपयोग करने के लिए आसान बनाता है । शुक्राणुओं को cryoprotectant के जोड़ के तुरंत बाद cryopreserved जाने की जरूरत नहीं होती है और इसे गल जाने के बाद लंबे समय तक इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, शुक्राणु गतिशीलता अभी भी गल के बाद उच्च हालांकि यह ताजा शुक्राणु की तुलना में कम है । इस काम का उद्देश्य यूरोपीय मछली हैंडलिंग, परिपक्वता, और शुक्राणु cryopreservation के लिए सबसे अच्छा उपलब्ध प्रोटोकॉल दिखाने के लिए है ।

Introduction

पिछले 25 वर्षों से यूरोपीय तट पर पहुंचने वाले यूरोपीय ईल (एंगुइला एंगुइला) की संख्या में ९०% 1,2,3तक तेजी से कमी आई है । वहां कई कारकों है कि प्रदूषण, संक्रमण, मछली पकड़ने और आवास विनाश सहित इस कठोर गिरावट की व्याख्या कर रहे हैं । इस सब के सब इस प्रजाति पर गहरा असर पड़ा है, प्रकृति के संरक्षण के लिए अंतर्राष्ट्रीय संघ पर यूरोपीय मछली के शामिल किए जाने के लिए अग्रणी (आईयूसीएन) सूची के रूप में महत्वपूर्ण खतरे में 4। नतीजतन, तकनीक और कैद में प्रजनन के लिए प्रोटोकॉल के विकास के लिए आवश्यक हैं ।

कैद में यूरोपीय मछली की परिपक्वता हार्मोनल उपचार द्वारा हासिल की है 5,6,7 लेकिन दोनों लिंगों में gametes का उत्पादन 8सिंक्रनाइज़ करने के लिए मुश्किल है । हालांकि नए एण्ड्रोजन प्रत्यारोपण के विकास के 9ईल में oogenesis में तेजी लाने के लिए दिखाया गया है,10, महिलाओं में अंतिम परिपक्वता के समय अभी भी उच्च चर और 11को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है. इसलिए, कम शुक्राणु की अवधि के भंडारण 12,13,14 और cryopreservation तकनीक प्रजनन प्रबंधन के लिए आवश्यक हैं, gamete तुल्यकालन अनावश्यक 8बना रही है ।

यूरोपीय मछली शुक्राणु के Cryopreservation २००३ 15,16के बाद से विकसित किया गया है । कई शोधकर्ताओं ने या तो dimethyl sulfoxide (DMSO) या मेथनॉल के रूप में cryoprotectants 16,17,18,19,20का उपयोग कर सफल प्रोटोकॉल डिज़ाइन किया गया । हालांकि दोनों प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, DMSO के साथ गल शुक्राणु cryopreserved की प्राप्त सेल व्यवहार्यता मेथनॉल 20,21के साथ की तुलना में कम है । इसके अलावा, मछली शुक्राणु DMSO के साथ संपर्क पर सक्रिय है और अधिक थकाऊ शुक्राणु हेरफेर 19की आवश्यकता है, इसलिए मेथनॉल DMSO से यूरोपीय मछली शुक्राणु के लिए एक अधिक उपयुक्त cryoprotectant है ।

यहां, इष्टतम हैंडलिंग और यूरोपीय मछली के हार्मोनल उपचार के लिए प्रोटोकॉल के नीचे वर्णित किया जाएगा । इस के अलावा, सबसे अच्छा यूरोपीय मछली शुक्राणु cryopreservation एक cryoprotectant और इस प्रजाति में शुक्राणु की गुणवत्ता के आकलन के लिए एक प्रोटोकॉल के रूप में मेथनॉल का उपयोग कर प्रोटोकॉल भी वर्णित किया जाएगा ।

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Protocol

यूरोपीय मछली इस प्रोटोकॉल में वर्णित के साथ काम करने के लिए सभी प्रक्रियाओं Universitat Politècnica de València में पशु प्रयोग की नैतिकता की समिति द्वारा अनुमोदित किया गया, स्पेनी कानूनों और प्रयोगों को नियंत्रित करने विनियमों के बाद और लाइव जानवरों पर प्रक्रियाओं ।

1. मछली रखरखाव

  1. एक अनुसंधान सुविधा के लिए यूरोपीय मछली लाओ और उंहें एक २०० एल aquaria में एक परिसंचरण प्रणाली के साथ डाल दिया । एक निरंतर 20 डिग्री सेल्सियस तापमान बनाए रखने के लिए थर्मोस्टेट और कूलर का प्रयोग करें ।
  2. अंधेरे परिस्थितियों में मछली रखने के लिए22 तनाव से बचने के लिए और प्रयोग के दौरान कोई भोजन के साथ ।
  3. पहले 3 दिनों के दौरान ताजे पानी में मछली रखें । फिर पानी की 1/3 बदलने के लिए और समुद्री जल के साथ फिर से भरना हर दूसरे दिन के एक लवणता तक पहुंचने तक ३७.० ± ०.३ g/L

2. हार्मोनल ट्रीटमेंट

नोट: हार्मोनल उपचार मानव chorionic गोनॉडोट्रॉफिन के साप्ताहिक इंजेक्शन के होते हैं (एचसीजी) पूरे अवधि (नौ सप्ताह) प्रयोग के दौरान.

  1. खारा समाधान (०.९% NaCl) में हार्मोन कमजोर द्वारा 1 IU/µ एल की एकाग्रता पर पहले से एचसीजी हार्मोन तैयार करें ।
    नोट: हार्मोन-18 डिग्री सेल्सियस से अधिक एक सप्ताह के लिए इस एकाग्रता में पतला संरक्षित किया जा सकता है ।
  2. मछली anesthetize करने के लिए, प्रणाली पानी की 5 एल के साथ एक ४० एल लचीला बाल्टी तैयार करते हैं ।
    1. एक २५० मिलीलीटर कुप्पी में, benzocaine के ३०० मिलीग्राम ७०% इथेनॉल के १०० मिलीलीटर में पतला ।
    2. बाल्टी में पतला benzocaine डालो (अंतिम एकाग्रता ०.३६ mM) और ठीक से मिलाएं । यह ६० मिलीग्राम/एल के एक अंतिम benzocaine एकाग्रता के लिए है ।
    3. मछली हस्तांतरण, व्यक्तिगत रूप से, benzocaine के साथ पानी में और कुछ सेकंड प्रतीक्षा जब तक benzocaine प्रभाव लेता है और मछली ठीक से anesthetized है ।
      नोट: पुष्टि करने के लिए कि मछली anesthetized है, एक लापरवाह स्थिति में मछली जगह और जांच है कि यह अभी भी उस स्थिति में रहता है ।
  3. हार्मोन प्रबंधन करने के लिए, मछली तौलना और एक १.५ मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में, मछली के १.५ IU/जी की एक खुराक पर एचसीजी हार्मोन तैयार करते हैं ।
    1. एक 1 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब से एचसीजी हार्मोन के साथ सिरिंज भरें ।
    2. लापरवाह स्थिति में और सहायता या सिरिंज के साथ anesthetized मछली प्लेस, intraperitoneal क्षेत्र में ध्यान से हार्मोन इंजेक्षन.
  4. aquaria के लिए मछली लौटें और यह पूरी तरह से बरामद जब तक निगरानी ।
    नोट: हार्मोनल प्रशासन प्रयोग भर में साप्ताहिक आयोजित किया जाना है । आम तौर पर, यूरोपीय मछली हार्मोनल उपचार के 6-7 सप्ताह के बाद spermating शुरू करते हैं ।

3. शुक्राणु नमूना

  1. सबसे अच्छी गुणवत्ता के नमूनों को प्राप्त करने के लिए, हार्मोनल प्रशासन6,23के बाद शुक्राणु 24 एच निकालने ।
  2. २.२ चरण में बताए अनुसार मछली को benzocaine के साथ Anesthetize ।
  3. लापरवाह स्थिति में anesthetized मछली प्लेस, आसुत जल की एक धार के साथ जननांग क्षेत्र को साफ और कागज के साथ ध्यान से शुष्क, मल जननांग क्षेत्र या aquaria से समुद्री जल के साथ संपर्क द्वारा आकस्मिक शुक्राणु सक्रियण में मौजूद संक्रमण से बचने के लिए ।
  4. मछली के दोनों पार्श्व पक्षों पर उंगलियां रखकर, मालिश ध्यान से जननांग क्षेत्र के लिए कवच पंख से बाद में दबाव के लिए शुक्राणु बाहर बल ।
    1. मालिश दोहराएं जब तक कोई और शुक्राणु जननांग खोलने से बाहर आता है ।
  5. एक वैक्यूम पंप का उपयोग कर 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों में शुक्राणु ले लीजिए ।
  6. पतला में निकाले शुक्राणु 1:10 संशोधित तनाका ´ एस भरनेवाला समाधान में24 (१३७ mm NaCl, ७६.२ mm NaHCO3, आसुत जल में) 4 º c ।
    नोट: भरनेवाला समाधान में शुक्राणु 4 º सी पर बनाए रखा जाना चाहिए

4. शुक्राणु गुणवत्ता मूल्यांकन

  1. कृत्रिम समुद्री जल13 (मिमी में तैयार: NaCl ३५४.७, MgCl2 ५२.४, CaCl2 ९.९, Na2इसलिए4 २८.२, KCl ९.४, आसुत जल में) 2% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) (w:v) के साथ, समायोजित पीएच को ८.२, परासरणीयता को ११०० mOsm/ यह 4 º c पर बैक्टीरियल विकास से बचने के लिए ।
  2. कंप्यूटर की सहायता शुक्राणु विश्लेषण (CASA) के लिए सॉफ्टवेयर खोलें और मछली शुक्राणु मॉड्यूल का चयन करें ।
    1. सॉफ़्टवेयर का सिस्टम सेटअप खोलने के लिए गुण पर क्लिक करें । वहां, प्रति सेकंड ६० छवियों पर कब्जा विकल्प सेट । चुनें नकारात्मक चरण प्रकाशिकी, Makler चैंबर और 10x पैमाने ।
    2. फिर विश्लेषण मूल्यों पर, प्रजातियों और कणों क्षेत्र के रूप में मछली का चयन से बड़ा 2 µm2 और छोटे से 20 µm2
    3. वेग पैरामीटर पर, सेट करने के लिए धीमा जब कोशिकाओं के बीच ले जाएं 10 और ४५ µm/s, जब ४५ और १०० µm/s के बीच चलती है और जब तेजी से करने के लिए सेट करने के लिए सेट मध्यम से १०० µm/
      नोट: वेग के साथ शुक्राणु से धीमी 10 µm/एस immotile माना जाता था ।
    4. का चयन करें प्रगतिशील मूल्यों के रूप में ८०% की सीधी (STR) और गुणों को बचाने के ।
    5. कैप्चर फ़ील्ड (कैमरे से लाइव छवियों वाली विंडो खोली जाएगी) पर क्लिक करें ।
      नोट: कंप्यूटर की सहायता से शुक्राणु विश्लेषण प्रणाली एक खुर्दबीन, एक कैमरा और एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के द्वारा बनाई गई है ।
  3. मतगणना कक्ष पर, कृत्रिम समुद्री जल के 4 µ एल डाल दिया है और शुक्राणु समाधान (भरनेवाला समाधान में पतला शुक्राणु) के ०.५ µ एल जोड़ें ।
    1. नकारात्मक चरण में 10x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के साथ छवि ध्यान केंद्रित । 15 एस सक्रियण के बाद, कंप्यूटर में शुक्राणु विश्लेषण सॉफ्टवेयर की सहायता से कैप्चर-वीडियो पर क्लिक करें ।
    2. तपसिल में हर नमूने का विश्लेषण और cryopreservation के लिए एक गतिशीलता से अधिक ७०% के साथ नमूने का चयन करें ।
      नोट: यह बहुत ही इस cryopreservation प्रोटोकॉल की सफलता के लिए उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

5. शुक्राणु ठंड विधि

  1. एडवांस लिक्विड नाइट्रोजन (लगभग २.५ एल) में एक ३४ सेमी x ३४ सेमी x 30 सेमी और 5 सेमी मोटी स्टायरोफोम बॉक्स में तैयार करें ।
    नोट: हर समय 4-5 सेमी ऊंचाई के तरल नाइट्रोजन का स्तर बनाए रखें ।
    1. शुक्राणु पूर्व फ्रीज करने के लिए एक अस्थायी संरचना का निर्माण । polystyrene (20 सेमी x 5 सेमी) के 2 टुकड़े का प्रयोग करें, उंहें 2 प्लास्टिक ट्यूबों के साथ बांध, और संरचना तरल नाइट्रोजन पर जगह है । इस संरचना के लिए सतह पर 3 सेमी की अनुमानित ऊंचाई पर तरल नाइट्रोजन पर नाव की जरूरत है (चित्रा 1) ।

Figure 1
चित्र 1 . अस्थाई तरल नाइट्रोजन पर पूर्व ठंड के लिए इस्तेमाल किया संरचना का योजनाबद्ध ड्राइंग । संरचना 20 सेमी x 4 सेमी x 5 सेमी की कम घनत्व स्टायरोफोम के दो टुकड़े के होते है 14 सेमी की प्लास्टिक ट्यूबों के साथ जुड़े । तिनके प्लास्टिक ट्यूबों पर तरल नाइट्रोजन पर 3 सेमी पर रखा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. शुक्राणु, भरनेवाला समाधान और मेथनॉल के अनुपात में १.५ मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों में 1:8:1 के मिश्रण से cryopreservation समाधान तैयार है और धीरे हलचल ।
  2. एक पिपेट की मदद के साथ, ५०० µ एल तिनके में cryopreservation समाधान के ४८० µ एल जोड़ने और यदि आवश्यक हो, उंहें मॉडलिंग क्ले के साथ एक छोर बंद करके निशान ।
  3. 3 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन पर 3 सेमी की ऊंचाई पर चल डिवाइस पर पुआल रखो । फिर, भूसे को तरल नाइट्रोजन में लगाएं ।
  4. 10-15 मिनट के बाद, एक तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक में तिनके लंबे संदंश का उपयोग कर हस्तांतरण और उंहें तरल नाइट्रोजन में हर समय जलमग्न रहते हैं । यहां, शुक्राणु अनिश्चित काल तक संग्रहित किया जा सकता है ।

6. गल विधि

  1. ५.१ चरण में वर्णित के रूप में तरल नाइट्रोजन के साथ एक स्टायरोफोम बॉक्स तैयार करें, और ४० º c पर नल के पानी के साथ एक 3 एल चोंच का उपयोग कर एक पानी स्नान तैयार
  2. भंडारण टैंक से तरल नाइट्रोजन के साथ लंबे संदंश का उपयोग कर स्टायरोफोम बॉक्स में जमे हुए शुक्राणु के साथ तिनके हस्तांतरण ।
    1. 13 एस के लिए ४० º c पर एक पानी स्नान में प्रत्येक भूसे रखो ।
    2. एक १.५ मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में शुक्राणु कैंची के साथ भूसे के बंद सिरों को काटने से डालो ।
  3. शुक्राणु विश्लेषण गतिशीलता के रूप में ४.१ कदम में बताया कंप्यूटर की सहायता शुक्राणु विश्लेषण प्रणाली का उपयोग कर ।
  4. एक प्रवाह cytometer के साथ शुक्राणु की व्यवहार्यता का विश्लेषण करने के लिए शुक्राणु के १०० µ एल रखें ।

7. फ्लो Cytometry

  1. propidium आयोडाइड (PI) युक्त एक फ्लोरोसेंट किट का प्रयोग करें, जो एक लाल फ्लोरोसेंट यौगिक है कि दाग मृत कोशिकाओं के नाभिक, और एक झिल्ली-permeant परमाणु फ्लोरोसेंट यौगिक, कि हरी दाग रहने वाली कोशिकाओं के नाभिक ।
    1. यह स्टॉक समाधान (1 मिमी) 1:10 तनाका ´ एस माध्यम में १०० µ एम के एक काम समाधान करने के लिए से कमजोर द्वारा हरी फ्लोरोसेंट धुंधला समाधान तैयार करें ।
    2. PI समाधान को पतला नहीं है । शेयर समाधान २.४ मिमी पर है ।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए, ताजा या गल शुक्राणु के ५० µ एल लेने के लिए और हरी फ्लोरोसेंट धुंधला काम समाधान (अंतिम एकाग्रता 1 µ एम) और PI समाधान के 2 µ एल के ०.५ µ एल जोड़ने (अंतिम एकाग्रता १०० µ एम) ।
  3. 5 मिनट के लिए अंधेरे में रंजक (PI और हरी फ्लोरोसेंट धुंधला) युक्त नमूनों की मशीन ।
    1. तनाका ´ एस भरनेवाला समाधान के ५०० µ एल में नमूनों को पतला और प्रवाह cytometer के साथ विश्लेषण ।
  4. प्रवाह cytometer चालू करें और एक नया प्रोटोकॉल बनाएं जिसमें कम से 2 प्लॉट हों: SS लॉग vs FS लॉग एंड FL1 vs FL3.
    नोट: दोनों, हरी फ्लोरोसेंट धुंधला और propidium आयोडाइड दृश्य-तरंग दैर्ध्य प्रकाश के साथ उत्साहित किया जा सकता है । जब डीएनए के लिए बाध्य, इन रंजक के अधिकतम प्रतिदीप्ति उत्सर्जन क्रमशः ५१६ एनएम और ६१७ एनएम हैं ।
    1. अलग पराबैंगनीकिरण के वोल्टेज समायोजित करें: SS = १९९; FS = १९९; FL1 = ३७७; FL3 = ३७२
    2. अधिकतम घटनाओं के लिए प्राप्ति सेटिंग्स जीए सेट करें = ५००० या 15 s (नमूने की अंतिम एकाग्रता कक्षों की लगभग १,०००,०००/ निंन प्रवाह का उपयोग करके नमूना पढ़ें ।
    3. पठन मोड एकल ट्यूब निश्चित स्थिति मोडका चयन करें ।
    4. नमूने को कैरोसल की सही संख्या में रखें
    5. नमूना पढ़ें (F9 दबाकर) और एक एक्सेल फ़ाइल के लिए एकत्र डेटा (F7 दबाकर) को बचाने के लिए और अधिक विश्लेषण ।

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Representative Results

७०% या उससे अधिक के शुक्राणु गतिशीलता के साथ 18 ईल से शुक्राणु, इस अध्ययन के लिए चुना गया था. परिणामों के ताजा शुक्राणु (तालिका 1 और चित्रा 2) से उन लोगों की तुलना में गल के बाद सभी गुणवत्ता मानकों में कमी दिखाई । गतिशीलता परिणाम (मतलब ± S.E.M., n = 18) एक उच्च कुल गतिशीलता और कुल गतिशीलता और प्रगतिशील गतिशीलता के बाद गल शुक्राणु के नमूनों में पाया से ताजा शुक्राणु में एक प्रगतिशील गतिशीलता दिखाया ।

इसी पैटर्न में तेजी से शुक्राणु कोशिकाओं के विश्लेषण में पाया गया, जहाँ जमे-गल नमूनों ने ताजे नमूनों की तुलना में तेज कोशिकाओं का कम अनुपात प्रस्तुत किया. इसके अलावा इसके बाद गल चुके नमूनों में शुक्राणु कोशिका वेग मापी भी कम पाई गई ।

इसके अलावा, परिणाम दिखाया है कि कोशिका व्यवहार्यता के बाद गल 23 ± ३.१% की लाइव शुक्राणु कोशिकाओं में कमी प्रस्तुत (± S.E.M., एन = 18) ताजा से जमे हुए-गल नमूनों (तालिका 1 और चित्रा 2) ।

Figure 2
चित्र 2 . गतिशीलता, वक्रीय वेग और ताजा शुक्राणु और गल शुक्राणु की कोशिका व्यवहार्यता डेटा (cryopreservation के बाद). शुक्राणु गल जाने से पहले 24 ज के लिए cryopreserved था । प्रस्तुत मूल्यों का अर्थ है ± 18 नमूनों से शुक्राणुओं की S.E.M. । तारांकन और ताज़ा नमूनों (t-test; p < 0.05) के बीच महत्वपूर्ण अंतर इंगित करता है । पैरामीटर गतिशीलता कुल gram शुक्राणु के प्रतिशत का संकेत दिया, वक्रीय वेग एक वक्रीय पथ के साथ शुक्राणु के औसत वेग का संकेत दिया, और कोशिका व्यवहार्यता जिंदा शुक्राणु के प्रतिशत का संकेत दिया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तेज़ + मध्यम कक्ष1 (%) ७०.७ ± २.८ २७.५ ± २.१ *
वक्रीय वेग (VCL; µm/ ११८.८ ± २.८ १०१.५ ± १.८ *
सीधी रेखा वेग (VSL; µm/ ५३.३ ± १.९ ४५.६ ± १.३ *
औसत पथ वेग (VAP; µm/ ७३.३ ± २.१ ६२.० ± १.३ *
धड़कन क्रॉस आवृत्ति (हर्ट्ज) २७.९ ± ०.३ २७.१ ± ०.६
कोशिका व्यवहार्यता (जीवित कोशिकाओं का%) ९७.७ ± ०.३ ७३.८ ± २.८ *
1 ४० µm/एस ऊपर वक्रीय वेग दिखा कोशिकाओं.

तालिका 1. ताजा और गल नमूनों से कंप्यूटर की सहायता शुक्राणु विश्लेषण प्रणाली के साथ विश्लेषण विभिंन मापदंडों के परिणामों का सारांश । गल चुके नमूनों को पहले cryopreserved 24 ज. सभी मान के रूप में प्रस्तुत अर्थ ± S.E.M. (n = 18) । तारांकन और ताज़ा नमूनों (t-test; p < 0.05) के बीच महत्वपूर्ण अंतर इंगित करता है । विश्लेषण पैरामीटर थे: gram शुक्राणु कुल gram कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में परिभाषित; प्रगतिशील गतिशीलता शुक्राणु के प्रतिशत के रूप में परिभाषित किया है कि एक अनिवार्य रूप से सीधी रेखा में आगे तैरना; ४० µm/एस के ऊपर एक औसत वक्रीय वेग के साथ शुक्राणु के प्रतिशत के रूप में परिभाषित फास्ट और मध्यम कोशिकाओं; वक्रीय वेग अपने वक्रीय पथ के माध्यम से एक spermatozoon के औसत वेग के रूप में परिभाषित; सीधी रेखा वेग एक सीधी रेखा में अपनी अंतिम स्थिति के लिए पहली बार पता लगाया स्थिति से मापा एक spermatozoon के औसत वेग के रूप में परिभाषित; औसत पथ वेग अपने स्थानिक औसत पथ के साथ एक spermatozoon के औसत वेग के रूप में परिभाषित; धड़कन क्रॉस आवृत्ति औसत दर है जिस पर वक्रीय शुक्राणु सिर पथ अपने औसत मार्ग गति पार के रूप में परिभाषित; सेल व्यवहार्यता जिंदा शुक्राणु के प्रतिशत के रूप में परिभाषित किया ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल यूरोपीय मछली परिपक्वता, हैंडलिंग और शुक्राणु cryopreservation के लिए पूरी प्रक्रिया का वर्णन । यहां वर्णित पशुपालन की स्थिति तेजी से परिपक्वता और उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु की उच्च मात्रा के उत्पादन के लिए इस प्रजाति में 6,7,25के लिए इष्टतम हैं । इस cryopreservation प्रोटोकॉल की सफलता और सड़ के बाद निषेचन के लिए अपने संभावित उपयोग ताजा शुक्राणु की गुणवत्ता पर बहुत निर्भर करता है 26। इसलिए उच्च कोटि के शुक्राणुओं का चयन काफी महत्व का होता है । ध्यान दें कि व्यक्तिपरक शुक्राणु गुणवत्ता मूल्यांकन कौशल, धारणा और शोधकर्ता जो नमूनों 5,27,28 का मूल्यांकन करता है और बहुत अलग गुणवत्ता के आधार पर अनुमान के लिए नेतृत्व कर सकते है के प्रशिक्षण पर निर्भर करती है शोधकर्ता 29. इसलिए, कंप्यूटर की सहायता शुक्राणु विश्लेषण का उपयोग अत्यधिक cryopreservation के लिए सबसे अच्छी गुणवत्ता के नमूनों का चयन करने के लिए सिफारिश की है ।

पोस्ट-गल शुक्राणु की गुणवत्ता के परिणाम यहां प्रस्तुत गतिशीलता, वेग, और सेल अस्तित्व के मापदंडों में कमी दिखाई । इस उपलब्ध ग्रंथ सूची के अनुरूप है, भले ही वहां प्रजातियों के बीच महान भिंनता 26,30मौजूद हैं । उदाहरण के लिए, अटलांटिक सामन (Salmo सालार) के साथ एक अध्ययन में, ७०-९५% की एक गतिशीलता के साथ ताजा शुक्राणु अलग cryoprotectants (DMSO और मेथनॉल) का उपयोग कर जमे हुए थे । गल के बाद शुक्राणु गतिशीलता ताजा नमूनों की तुलना में काफी कम था, गतिशीलता मूल्यों के साथ ८.२% का सबसे अच्छा प्रोटोकॉल में, अभी तक निषेचन की दर से सड़ शुक्राणु का उपयोग ४२.८% है, जो नियंत्रण (ताजा शुक्राणु) के ९५% का प्रतिनिधित्व के रूप में उच्च के रूप में था 31। अटलांटिक हलिबेट (Hippoglossus Hippoglossus) के शुक्राणु के साथ एक अलग अध्ययन में, शुक्राणु गतिशीलता में कोई उल्लेखनीय कमी cryopreservation और निषेचन की दर के बाद पाया गया था गल शुक्राणु का उपयोग कर ९५% ३२से अधिक था ।

यूरोपीय मछली में, पिछले अध्ययन भी शुक्राणु गतिशीलता में कमी cryopreservation स्वतंत्र रूप से cryoprotectant का इस्तेमाल किया 16,18के बाद दिखाया । इसके अलावा, इसी तरह की गुणवत्ता के यूरोपीय मछली से cryopreserved शुक्राणु सफलतापूर्वक निषेचन के लिए इस्तेमाल किया गया है 8। उस अध्ययन में, Asturiano एट अल. cryoprotectant के रूप में DMSO इस्तेमाल किया । DMSO के उपयोग के बाद से इस cryoprotectant शुक्राणु सक्रिय कुछ हेरफेर नुकसान है और इसलिए DMSO के अलावा पर तुरंत जम जाने की जरूरत है । इसके अलावा, गल शुक्राणु के साथ गर्भाधान तुरंत गल के बाद आयोजित किए जाने की जरूरत है । शुक्राणु पीएच की कमी आंशिक रूप से इस समस्या को हल कर सकते है 19, लेकिन प्रोटोकॉल और अधिक नाजुक प्रोटोकॉल से cryoprotectant के रूप में मेथनॉल के साथ यहां प्रस्तुत किया है ।

कई अध्ययनों से पता चला है सकारात्मक परिणाम cryoprotectant के रूप में मेथनॉल का उपयोग । उदाहरण के लिए, एक जापानी मछली (एंगुइला बिही) के साथ किए गए एक अध्ययन में एक बहुत ही प्रोटोकॉल का उपयोग यहां प्रस्तुत एक के लिए, cryoprotectant के रूप में 10% मेथनॉल के साथ, लेखक सफलतापूर्वक ताजा और cryopreserved शुक्राणु का उपयोग अंडे निषेचित । इस अध्ययन में, वे 17% की निषेचन दर ताजा और cryopreserved शुक्राणु के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर के साथ प्राप्त ३३

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को पिघलने के बाद पर्याप्त शुक्राणु की गुणवत्ता को बचाने के लिए साबित कर दिया है, और विभिंन extenders और cryoprotectants का उपयोग कर प्रोटोकॉल से गल के बाद इसी तरह शुक्राणु विशेषताओं दिखाने के लिए, लेकिन आसान से निपटने के लाभ के साथ पूर्व और पद-cryopreservation । यह बहुत ही सही ठंडा और गल बार यहां वर्णित के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उच्च गुणवत्ता वाले शुक्राणु का उपयोग का पालन महत्वपूर्ण है । भविष्य के अध्ययनों में, निषेचन परीक्षण इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर परीक्षण किया जाएगा ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस प्रकाशन यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम मैरी Sklodowska के तहत वित्त पोषित-क्यूरी अनुदान समझौते नहीं ६४२८९३ (प्रभावित), लागत कार्यालय (लागत लड़ाई एफए १२०५, AQUAGAMETE), और उत्कृष्टता के अनुसंधान केंद्र- 1476-4/2016/FEKUT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 AQUACEN 3394ESP Benzocaine
NaCl Avantor  3624-19
Syringe BD Plastipak 305501 Syringe 1 mL
FC500 Beckman Coulter Flow cytometer
Air pump 100 EHEIM 4011708370032 Modified for suction
Eppendorf 1.5 Eppendorf 175508 Plastic tubes 1.5 mL
Falcon tubes Falcon 175747 Plastic tubes 15 mL
Flexible bucket Fiel 1040101 40 L, Black color.
Ethanol Guinama SL Mg96270
Cyopreservation straws  IMV Technologies 14550 500 µL straws
Live/Dead Sperm Viability Kit Invitrogen L7011 Cytometer Kit
Modelling clay JOVI Art 30 4 different colors
Precision scale PCB KERN & Sohn GmbH PCB35002 Digital scale
Saline solution Vitulia 0.9% Laboratorios Ern, S.A. C.N. 999790.8 Saline solution
Forceps Levantina de Lab. SL 3710025 30 cm metal forceps
Scissors Levantina de Lab. SL 3700014 Scissors 14cm
Ovitrelle (r-hCG) Merck SL EMEA/H/C/000320 Human chorionic gonadotropin
Nikon Eclipse 80i Nikon Microscope
CaCl2 Panreac Quimica SAU 2112211210
Na2SO4 Panreac Quimica SAU 3257091611
NaHCO3 Panreac Quimica SAU 1416381210
782M Camera Proiser 782M Camera for CASA
ISAS v1 Proiser ISAS v1 CASA software
SpermTrack-10 Proiser SpermTrack-10 Countig chamber for CASA
Beaker Pyrex 3L PYREX 2110668 Glass beaker 3L
Flask Pyrex 250 GL-45 PYREX 21801365 Glass flask 250 mL
KCl Scharlab SL PO02000500
Methanol Scharlab SL ME03061000
MgCl2 Scharlab SL MA00370500
BSA Sigma Aldrich 05482 Bovine serum albumina
Styrofoam box 34x34x30 cm and 5cm thick

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