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처리와 치료의 남성 유럽 뱀장어 (앵귈라 앵귈라) 호르몬 성숙 및 정자 Cryopreservation

Developmental Biology

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Summary

유럽 장 어 성숙 및 정자 cryopreservation 프로토콜 지난 수 년에 걸쳐 개선 되었습니다. 이 문서는 성숙과 메탄올 cryoprotectant로 유도 대 한 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG)을 사용 하 여 사용할 수 있는 최상의 프로토콜을 설명 합니다.

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Herranz-Jusdado, J. G., Kása, E., Kollár, T., Gallego, V., Peñaranda, D. S., Rozenfeld, C., Pérez, L., Horváth, Á., Asturiano, J. F. Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation. J. Vis. Exp. (131), e56835, doi:10.3791/56835 (2018).

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Abstract

지난 년 동안 여러 연구 그룹 개발 및 유럽 장 어 처리 및 성숙에 대 한 새로운 프로토콜의 개선에 노력 하고있다. 로 서 아직, 인간 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG)의 주간 주사 치료, 몇 주 동안 높은-품질의 높은 볼륨 생산의 단지 5-6 주 후 남성 maturate를 입증 해야 합니다. 또한, 정자 cryopreservation 프로토콜 다른 extender를 사용 하 여, cryoprotectants 및 냉각 시간을 녹고 있다 이전 설명 유럽 장 어에 대 한. 여기, 우리가 보여줍니다 수정 또는 cryopreservation, Tanaka´s 익스텐더 솔루션 직접 사용 될 수 있다 솔루션 및 희석의 다른 종류의 사용을 불필요 한 만들기. 또한, 메탄올의 사용은 cryoprotectant로 만드는이 프로토콜 사용 하기 쉬운 메탄올은 낮은 독성과 정자를 활성화 하지 않습니다. 정자는 cryoprotectant 추가 직후 cryopreserved 필요 하지 않습니다 그리고 그것은 오래 되 고 해 동 후 사용할 수 있습니다. 또한, 정자 운동 성은 비록 그것이 신선한 정자 보다 낮은 녹고 후 여전히 높다입니다. 이 작품의 목표 처리, 성숙 및 정자 cryopreservation 유럽 장 어에 대 한 가장 사용할 수 있는 프로토콜을 표시 하는 것입니다.

Introduction

지난 25 년 동안 유럽 뱀장어 (앵귈라 앵귈라) 유럽 해 안에 도착의 수는 꾸준히 90 1,2,3감소. 오염, 감염, overfishing, 서식 지 파괴 등이 급격 한 하락을 설명 하는 몇 가지 요인이 있다. 이 모든 중요 한 멸종 위기 4자연 보존 (IUCN) 목록은 국제 연합에 유럽 장 어의 포함에 지도 하는이 종에 깊은 영향을 했다. 따라서, 기술 및 포로에 복제에 대 한 프로토콜의 개발은 필요 합니다.

포로에서 유럽 장 어의 성숙 호르몬 치료 5,,67 에 의해 이루어집니다 하지만 남녀 모두에서 gametes의 생산 8동기화 할 어렵습니다. 새로운 안 드로 겐 임 플 란 트의 개발 oogenesis 뱀장어 9,에 있는 가속을 보이고 있다 하더라도10, 여성에서 마지막 성숙의 타이밍은 여전히 매우 변수 하 고 11를 제어 하기 어려운. 따라서, 기술의 정자 12,,1314 및 cryopreservation 단기 저장 복제 관리, 생식 체 동기화 불필요 한 8를 만들기 위해 필요 하다.

유럽 장 어 정자의 cryopreservation 2003 15,16이후 개발 되었습니다. 몇몇 연구원은 성공적인 프로토콜 cryoprotectants 16,17,18,,1920디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 또는 메탄올을 사용 하 여 설계 되었습니다. 두 프로토콜 성공적으로 사용 되었습니다, 하지만 해 동된 정자 DMSO와 cryopreserved의 얻은 세포 생존 능력에 메탄올 20,21보다 낮은 것입니다. 또한, 장 정자 DMSO와 접촉을 활성화 하 고 더 지루한 정자 조작 19필요 하, 그러므로 메탄올 DMSO 보다 유럽 장 어 정자에 대 한 더 적합 한 cryoprotectant 이다.

여기, 아래 최적의 처리 및 유럽 장 어의 호르몬 치료에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이것 이외에,이 종에서 정자 품질 평가 대 한 프로토콜은 cryoprotectant로 메탄올을 사용 하 여 최고의 유럽 장 어 정자 cryopreservation 프로토콜도 설명 됩니다.

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Protocol

이 프로토콜에서 설명 하는 유럽 장 어와 함께 작업 하기 위한 모든 절차는 위원회의 윤리의 동물 실험 Universitat Politècnica de València, 스페인 법률 및 규정 제어 실험에 의해 승인 및 살아있는 동물에 절차입니다.

1. 물고기 유지 보수

  1. 연구 시설에 유럽 뱀장어를 가져오고 재순환 시스템 200 L 수족관에 넣어. 20 ° C에서 일정 한 온도 유지 하기 위해 온도 쿨러를 사용 합니다.
  2. 실험 기간 동안 물고기 음식와 스트레스22 를 피하기 위해 어두운 조건에서 유지.
  3. 첫 3 일 동안 신선한 물에서 물고기를 유지. 다음 물 1/3을 변경 하 고 해 수 37.0 ±의 염 분을 도달할 때까지 매일 리필 0.3 g/l.

2. 호르몬 치료

참고: 호르몬 치료는 실험의 전체 기간 (9 주)을 통해 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG)의 주간 주사의 구성 되어 있습니다.

  1. 1 IU / µ L의 농도에서 미리 hCG 호르몬 호르몬 생리 식 염 수에 희석 하 여 준비 (0.9 %NaCl).
    참고: 호르몬 보존 될 수 있습니다-18 ° c.에 1 주일 이상에 대 한이 농도에 희석
  2. Anesthetize 물고기, 시스템 물 5 l 40 L 유연한 물통을 준비 합니다.
    1. 250 mL 플라스 크에 300mg benzocaine 70% 에탄올 100ml에 희석.
    2. 양동이에 희석된 benzocaine를 부 어 (최종 농도 0.36 m m)와 적절히 섞어. 이것은 60 mg/l.의 최종 benzocaine 농도 대 한
    3. Benzocaine와 물으로, 물고기를 개별적으로 전송 하 고는 benzocaine 적용 됩니다 물고기 제대로 마 취 될 때까지 몇 초를 기다립니다.
      참고: 물고기 취 것인지 물고기 부정사 자리에 놓고 그것은 여전히 그 자리에에서 유지 하는 확인 하십시오.
  3. 호르몬 관리, 무게 물고기 고 물고기, 1.5 mL 플라스틱 튜브에서의 1.5 IU/g의 복용량에 hCG 호르몬을 준비.
    1. 플라스틱 튜브에서 hCG 호르몬을 1 mL 주사기를 채우십시오.
    2. 복 지역에서 신중 하 게 호르몬을 주입, 부정사 위치와 도움 또는 주사기 마 취 물고기를 놓습니다.
  4. 물고기는 수족관에 반환 하 고 완전히 복구 될 때까지 그것을 모니터링 합니다.
    참고: 호르몬 관리는 실험 내내 매주 실시 하는. 일반적으로, 유럽 뱀장어는 호르몬 치료의 6-7 주 후 spermating를 시작합니다.

3. 정자 샘플링

  1. 최고의 품질 샘플을 얻기 위해 호르몬 관리6,23후 정자 24 h를 추출 합니다.
  2. 2.2 단계에 설명 된 대로 benzocaine와 물고기를 anesthetize.
  3. 부정사 위치에 마 취 물고기를 배치, 증류수의 물 총으로 성 기 영역을 청소 하 고 종이 수족관에서 해 수와 접촉 하 여 배설물 오염 음부 나 실수로 정자 활성화를 방지 하려면 신중 하 게 건조.
  4. 물고기의 측면 양쪽에 손가락을 배치, 신중 하 게 누르면 옆으로 가슴 지 느 러 미에서 성 기 영역을 밖으로 정자를 마사지.
    1. 마사지를 반복 하 여 더 더 정자 생식 기 오프닝에서 나온다.
  5. 15 mL 플라스틱 튜브 진공 펌프를 사용 하 여 정자를 수집 합니다.
  6. 4 º C에서 수정된 Tanaka´s 익스텐더 솔루션24 (137 m m NaCl, 76.2 m m NaHCO3, 증류수에)에서 추출한 정자 1시 10분 희석.
    참고: extender 솔루션에 정자 4 º C에서 유지 되어야 합니다.

4. 정자 품질 평가

  1. 인공 해 수13 준비 (mm에서: NaCl 354.7, MgCl2 52.4, CaCl2 9.9, 나24 28.2, KCl 9.4, 증류수에) 2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) (w:v), pH 8.2, osmolality 1100 mOsm/kg를 조정 하 고 유지 그것은 박테리아의 성장을 피하기 위해 4 º C에서.
  2. 컴퓨터 기반 정자 분석 (카사)에 대 한 소프트웨어를 열고 물고기 정자 모듈을 선택 합니다.
    1. 소프트웨어의 시스템 설치 프로그램을 열려면 속성 클릭 하십시오. 거기, 초당 60 이미지에서 캡처 옵션을 설정 합니다. 선택 부정적인 단계 광학, Makler 챔버와 10 배 규모.
    2. 다음 분석 값에 종 및 입자 영역 2 µ m2 보다 크고 20 µ m2보다 작은 물고기 를 선택 합니다.
    3. 속도 매개 변수를 설정 느린 때 셀 10 그리고 45 µ m/s 사이 이동, 45, 100 µ m/s 사이 이동할 때 보통 으로 설정 빠른 100 µ m/s 보다 빠르게 이동 하는 경우.
      참고: 10 µ m/s 보다 느린 속도와 정 충 immotile 간주 됐다.
    4. 직진도 (STR)의 80%로 진보적인 가치를 선택 하 고 속성을 저장 합니다.
    5. 캡처 필드 (카메라에서 라이브 이미지 창이 열립니다)를 클릭 하십시오.
      참고: 컴퓨터 기반 정자 분석 시스템 현미경, 카메라 및 이미지 분석 소프트웨어에 의해 형성 된다.
  3. 세 실에 인공 해 수의 4 µ L를 넣어 하 고 정자 솔루션 (정자 익스텐더 솔루션에 희석)의 0.5 µ L를 추가 합니다.
    1. 이미지에 부정적인 단계에 10 배 확대 현미경 초점. 15 활성화 후 s 클릭 캡처-비디오에서 컴퓨터 기반 정자 분석 소프트웨어에서.
    2. Cryopreservation 70% 보다 높은 운동 성을 가진 triplicate 선택 샘플에서 모든 샘플을 분석 합니다.
      참고: 그것은 매우이 cryopreservation 프로토콜의 성공에 대 한 높은-품질 정자만을 선택 하는 것이 중요입니다.

5. 정자 동결 방법

  1. 34 cm x 34 cm x 30 cm 및 5 cm 두꺼운 스티로폼 상자에서에서 사전에 액체 질소 (약 2.5 L)를 준비 합니다.
    참고: 항상 액체 질소의 4-5 cm 높이의 레벨을 유지 합니다.
    1. 전 정자를 동결 부동 구조 구축. 폴리스 티 렌 (20 cm x 5 cm)의 2 개를 사용 하 여, 2 플라스틱 튜브와 함께 그들을 바인딩할 하 고 액체 질소에 구조를 놓습니다. 이 구조는 표면 (그림 1)에 3 cm의 대략적인 높이에 액체 질소를 통해 플 로트 해야 합니다.

Figure 1
그림 1 . 미리 이상의 액체 질소 냉동에 사용 되는 부동 구조 그리기 도식. 구조는 낮은 밀도 20 cm x 4 cm x 5의 스티로폼의 두 부분으로 구성 됩니다 cm 14 c m의 플라스틱 튜브와 연결. 빨 대는 액체 질소에 3 cm에 플라스틱 튜브를 통해 배치 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 정자, 익스텐더 솔루션 및 메탄올 1의 비율로 혼합 하 여 cryopreservation 솔루션 준비: 8:1 1.5 mL 플라스틱에서 튜브, 부드럽게 저 어.
  2. 피 펫의 도움으로 500 µ L 빨 대에 cryopreservation 솔루션의 480 µ L을 추가 하 고 필요 하다 면, 클레이 모델링 한 끝을 폐쇄 하 여 표시 합니다.
  3. 3 분 액체 질소에 3 cm의 고도에 떠 있는 장치에 빨 대를 넣어. 그런 다음 액체 질소에 빨 대를 놓습니다.
  4. 10-15 분 후 긴 집게를 사용 하 여 액체 질소 저장 탱크에 빨 대를 전송 하 고 항상 액체 질소에 빠져들 유지 합니다. 여기, 정자는 무기한으로 저장할 수 있습니다.

6. 해 동 방법

  1. 5.1, 단계에서 설명한 대로 액체 질소로 스티로폼 상자를 준비 하 고 준비 물 목욕 40 º C에서 수돗물 3l 비 커를 사용 하 여.
  2. 긴 집게를 사용 하 여 액체 질소 저장 탱크 스티로폼 상자에 냉동된 정자를 빨 대 전송.
    1. 13 40 º C에서 물 목욕으로 각 빨 대를 넣어 s.
    2. 가 위로 빨 대의 닫힌된 끝을 절단 하 여 1.5 mL 플라스틱 관으로 정자를 붓는 다.
  3. 4.1 단계에 설명 된 대로 컴퓨터 기반 정자 분석 시스템을 사용 하 여 정자의 운동 성 분석.
  4. 교류 cytometer와 정 충의 생존 능력을 분석 하는 정자의 100 µ L를 유지.

7. Cytometry

  1. Propidium 요오드 화물 (PI), 죽은 세포의 핵을 얼룩 빨간 형광 화합물 이며 녹색 살아있는 세포의 핵 얼룩 막 permeant 핵 형광 성 화합물을 포함 하는 형광 키트를 사용 합니다.
    1. 100 µ M의 작업 솔루션 Tanaka´s 매체에 재고 솔루션 (1mm) 1시 10분에서 그것을 diluting 하 여 녹색 형광 얼룩 솔루션을 준비 합니다.
    2. PI 솔루션을 희석 하지 마십시오. 2.4 m m 재고 솔루션이입니다.
  2. 각 샘플에 대 한 신선한 또는 해 동 정자의 50 µ L 고 작업 솔루션 (최종 농도 1 µ M)를 착 색 하는 녹색 형광의 0.5 µ L을 추가 하 고 PI 솔루션 (최종 농도 100 µ M)의 2 µ L.
  3. 5 분 동안 어둠 속에서 염료 (PI와 녹색 형광 성 얼룩)를 포함 하는 샘플을 품 어.
    1. Tanaka´s 익스텐더 솔루션의 500 µ L의 샘플을 희석 하 고 교류 cytometer 분석.
  4. 교류 cytometer 설정 하 고 적어도 2 음모를 포함 하는 새로운 프로토콜을 만들: SS 대 FS 로그 및 FL1 vs FL3 로그.
    참고: 두, 녹색 형광 얼룩이 지 고 propidium 요오드 화물 보이는 파장 빛으로 흥분 수 있습니다. DNA에 바인딩된 경우,이 염료의 최대 형광 방출은 516 및 617 nm, 각각.
    1. 다른 레이저의 전압 조정: SS = 199; FS = 199; FL1 377; = FL3 = 372
    2. 최대 이벤트 수집 설정 협정 설정 = 5000 또는 15 s (샘플의 최종 농도 약 1 백만 셀/mL의 해야 함). 은 흐름을 사용 하 여 샘플을 읽기.
    3. 읽기 모드 단일 튜브 고정 위치 모드를선택 합니다.
    4. 회전 목마의 오른쪽 숫자에 샘플을 넣어
    5. (F 9를 누르면) 샘플을 읽고 고 추가 분석에 대 한 (f 7을 누르면) excel 파일에 수집 된 데이터를 저장 합니다.

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Representative Results

70% 이상, 정자 운동 성 가진 18 뱀장어에서 정자는이 연구에 대 한 선정 됐다. 결과 신선한 정자 (표 1 그림 2)에서 그에 비해 녹고 후 모든 품질 매개 변수에서 감소를 보였다. 운동 성 결과 (± S.E.M., 의미 n = 18) 총 운동 성 및 진보적인 운동 후 해 동 정자 샘플에서 발견 보다 신선한 정자에 더 높은 총 운동 성 및 진보적인 운동 성을 보였다.

같은 패턴은 냉동-해 동 샘플 신선한 샘플 보다 빠른 셀의 낮은 비율을 제시 빠른 정자 세포의 분석에서 발견 되었다. 또한, 정자 세포 속도 측정 후 녹고 샘플에서 또한 감소 되었다.

또한, 결과 3.1 %23 ±의 살아있는 정자 세포에 감소 제시 녹고 후 세포 생존 능력을 보여주었다 (± S.E.M., 의미 n = 18) 냉동-해 동 신선한 샘플 (표 1그림 2)에서.

Figure 2
그림 2 . 운동 성, 곡선 속도 및 신선한 정자와 (cryopreservation) 후 해 동된 정자의 세포 생존 데이터. 정자 해 동 되 고 전에 24 h에 대 한 cryopreserved 이었다. 제시 하는 값은 수단 ± 18 샘플에서 정자의 S.E.M.입니다. 별표 표시 해 동 하 고 신선한 샘플 사이의 중요 한 차이점 (t-검정; p < 0.05). 매개 변수 운동 성 총 운동 정 충, 곡선 속도 곡선 궤적을 따라 정 충의 평균 속도 표시 그리고 세포 생존 능력 살아 정 충의 비율의 비율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

빠른 + 중간 셀1 (%) 70.7 ± 2.8 27.5 ± 2.1*
곡선 속도 (VCL; µ m/s) 118.8 ± 2.8 101.5 ± 1.8*
직선 속도 (VSL; µ m/s) 53.3 ± 1.9 45.6 ± 1.3*
평균 경로 속도 (VAP; µ m/s) 73.3 ± 2.1 62.0 ± 1.3*
주파수 (Hz) 크로스 치고 27.9 ± 0.3 27.1 ± 0.6
세포 생존 능력 (살아있는 세포의 %) 97.7 ± 0.3 73.8 ± 2.8*
1 셀 40 µ m/s 이상의 곡선 속도 보여주는.

표 1입니다. 다른 매개 변수에서 신선 하 고 해 동 샘플 컴퓨터 기반 정자 분석 시스템으로 분석의 결과의 요약. 해 동된 샘플 24 h에 대 한 cryopreserved 이전 했다. ± S.E.M. 의미를 제시 하는 모든 값 (n = 18). 별표 표시 해 동 하 고 신선한 샘플 사이의 중요 한 차이점 (t-검정; p < 0.05). 분석된 매개 변수 했다: 총 운동 세포;의 백분율로 정의 운동 정 충 진보적인 운동 성 정 충의 백분율로 정의 하는 본질적으로 직선; 앞으로 수영 40 µ m/s; 위의 평균 곡선 속도와 정 충의 백분율로 정의 하는 빠르고 중간 셀 곡선 궤도; 통해 정자의 평균 속도으로 정의 된 곡선 속도 직선 속도 직선; 그것의 마지막 위치를 첫 번째 검색 된 위치에서 측정 하는 정자의 평균 속도로 정의 공간 평균 궤도;에 따라 정자의 평균 속도로 정의 평균 경로 속도 평균 속도는 곡선 정자 머리 궤적의 평균 경로 궤적; 십자가로 정의 교차 주파수 구타 세포 생존 능력 살아 정 충의 비율로 정의입니다.

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Discussion

이 프로토콜 유럽 장 어 성숙, 처리 및 정자 cryopreservation에 대 한 완전 한 프로세스를 설명합니다. 여기에 설명 된 농업 조건 빠른 성숙 및이 종 6,,725에 높은-품질의 높은 볼륨의 생산을 위한 최적의 있습니다. 이 cryopreservation 프로토콜 및 해빙 후 수정에 대 한 그것의 잠재적인 사용의 성공 신선한 정자 26의 품질에 따라 크게 의존. 따라서, 높은-품질의 선택은 매우 중요. 주관적 정자 품질 평가 기술, 지 각 및 샘플 5,,2728 평가 연구원의 훈련에 따라 고 수에 따라 매우 다른 품질 의견 연구원 29 따라서, 컴퓨터 기반 정자 분석의 사용이 좋습니다 cryopreservation에 대 한 최고의 품질 샘플 선택 하.

결과 발표 후 녹고 정자 품질 여기 운동 성, 속도, 및 세포 생존의 매개 변수에서는 감소를 보여주었다. 이것은 거기 존재 하는 종 26,30사이의 큰 변화 하더라도 사용 가능한 참고 문헌 일치 합니다. 예를 들어, 대서양 연어 (salar Salmo) 연구, 70-95%의 운동 성 가진 신선한 정자 다른 cryoprotectants (DMSO와 메탄올)를 사용 하 여 고정 했다. 녹고 후 정자의 운동 성 운동 성 값을 8.2%의 최상의 프로토콜에 신선한 샘플에 비해 크게 낮은 아직 해 동된 정자를 사용 하 여 수정 율은 42.8%, 컨트롤 (신선한 정자) 31의 95%로 높은. 다른 연구에서 대서양 넙치 (Hippoglossus hippoglossus)의 정자로, 정자 운동에 상당한 감소 cryopreservation 후 발견 및 해 동된 정자를 사용 하 여 수정 율은 95% 이상 32.

유럽 장 어에서 이전 연구 또한 감소에서에서 보여주었다 정자 운동 성 후 cryopreservation는 cryoprotectant 별도로 사용 16,18. 또한, 비슷한 품질의 유럽 장 어에서 cryopreserved 정자 수정 8성공적으로 사용 되었습니다. 그 연구에서 Asturiano 그 외 여러분 은 cryoprotectant로 DMSO를 사용. DMSO의 사용이이 cryoprotectant 정자를 활성화 하 고 따라서 DMSO의 추가 시 즉시 냉동 해야 이후 조작 단점도 있다. 또한, 해 동 정자와 수정을 녹고 후 즉시 실시 해야 합니다. 정자 pH의 감소 부분적으로 19의이 문제 해결할 수 있지만 프로토콜은 cryoprotectant로 메탄올와 여기에 제시 된 프로토콜 보다 더 섬세 한.

몇몇 학문은 cryoprotectant로 메탄올을 사용 하 여 긍정적인 결과 나타났습니다. 예를 들어, 여기, 10% 메탄올, cryoprotectant로 제시 하는 것 매우 유사한 프로토콜 사용 하 여 일본 장 어 (앵귈라 japonica)와 함께 실시 한 연구에서 저자 성공적으로 수정 된 계란 신선 하 고 cryopreserved 정자를 사용 하 여. 이 연구에서는 그들은 신선 하 고 cryopreserved 정자 33사이 상당한 차이가 17%의 수정 율을 얻었다.

녹고, 후 충분 한 정자의 품질을 보존 하 고 다른 extender cryoprotectants를 사용 하 여 프로토콜 보다 하지만 쉽게 처리 사전의 장점을 녹고 후 유사한 정자 특성을 표시 하려면 여기에 제시 된 프로토콜 입증 했다 고 후 cryopreservation입니다. 냉각 및 여기서 설명 하는 시간을 해빙으로 양질의 정자를 사용 하 여 정확 하 게 따르도록 매우 중요 하다. 미래 연구, 수정 재판이이 프로토콜을 사용 하 여 테스트 됩니다.

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Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgments

이 게시는 유럽 연합의 수평선 2020 연구에 의해 투자 되었다 및 혁신 프로그램 마리 Sklodowska 퀴리 부여 계약 없음 642893 (감동), 비용 사무실 (비용 액션 FA 1205, AQUAGAMETE), 그리고 우수 연구 센터- 1476-4/2016/FEKUT입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AQUACEN BENZOCAÍNA +D2A2:D24 AQUACEN 3394ESP Benzocaine
NaCl Avantor  3624-19
Syringe BD Plastipak 305501 Syringe 1 mL
FC500 Beckman Coulter Flow cytometer
Air pump 100 EHEIM 4011708370032 Modified for suction
Eppendorf 1.5 Eppendorf 175508 Plastic tubes 1.5 mL
Falcon tubes Falcon 175747 Plastic tubes 15 mL
Flexible bucket Fiel 1040101 40 L, Black color.
Ethanol Guinama SL Mg96270
Cyopreservation straws  IMV Technologies 14550 500 µL straws
Live/Dead Sperm Viability Kit Invitrogen L7011 Cytometer Kit
Modelling clay JOVI Art 30 4 different colors
Precision scale PCB KERN & Sohn GmbH PCB35002 Digital scale
Saline solution Vitulia 0.9% Laboratorios Ern, S.A. C.N. 999790.8 Saline solution
Forceps Levantina de Lab. SL 3710025 30 cm metal forceps
Scissors Levantina de Lab. SL 3700014 Scissors 14cm
Ovitrelle (r-hCG) Merck SL EMEA/H/C/000320 Human chorionic gonadotropin
Nikon Eclipse 80i Nikon Microscope
CaCl2 Panreac Quimica SAU 2112211210
Na2SO4 Panreac Quimica SAU 3257091611
NaHCO3 Panreac Quimica SAU 1416381210
782M Camera Proiser 782M Camera for CASA
ISAS v1 Proiser ISAS v1 CASA software
SpermTrack-10 Proiser SpermTrack-10 Countig chamber for CASA
Beaker Pyrex 3L PYREX 2110668 Glass beaker 3L
Flask Pyrex 250 GL-45 PYREX 21801365 Glass flask 250 mL
KCl Scharlab SL PO02000500
Methanol Scharlab SL ME03061000
MgCl2 Scharlab SL MA00370500
BSA Sigma Aldrich 05482 Bovine serum albumina
Styrofoam box 34x34x30 cm and 5cm thick

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. ICES_Working_Group_on_Eels. Report of the 2011 Session of the Joint EIFAAC/ICES Working Group on Eels. 246 (2011).
  2. Moriarty, C. European Catches of Elver of 1928-1988. Int. Rev. Hydrobiol. 75, (6), 701-706 (1990).
  3. Dekker, W. The fractal geometry of the European eel stock. ICES J. Mar. Sci. 57, (1), 109-121 (2000).
  4. Jacoby, D., Gollock, M. Anguilla anguilla. The IUCN red list of threatened species. Version 2014.2. (2014).
  5. Asturiano, J. F., et al. Effects of hCG as spermiation inducer on European eel semen quality. Theriogenology. 66, (4), 1012-1020 (2006).
  6. Pérez, L., et al. Induction of maturation and spermiation in the male European eel: assessment of sperm quality throughout treatment. J. Fish Biol. 57, (6), 1488-1504 (2000).
  7. Gallego, V., et al. Study of the effects of thermal regime and alternative hormonal treatments on the reproductive performance of European eel males (Anguilla anguilla) during induced sexual maturation. Aquaculture. 354, 7-16 (2012).
  8. Asturiano, J. F., Sørensen, S. R., Pérez, L., Lauesen, P., Tomkiewicz, J. First Production of Larvae Using Cryopreserved Sperm: Effects of Preservation Temperature and Cryopreservation on European Eel Sperm Fertilization Capacity. Reprod. Domestic Anim. 51, (4), 485-491 (2016).
  9. Di Biase, A., et al. Co-treatment with androgens during artificial induction of maturation in female eel, Anguilla anguilla: Effects on egg production and early development. Aquaculture. 479, 508-515 (2017).
  10. Lokman, P., Wylie, M. J., Downes, M., Di Biase, A., Damsteegt, E. L. Artificial induction of maturation in female silver eels, Anguilla australis: The benefits of androgen pre-treatment. Aquaculture. 437, 111-119 (2015).
  11. Mylonas, C. C., Duncan, N. J., Asturiano, J. F. Hormonal manipulations for the enhancement of sperm production in cultured fish and evaluation of sperm quality. Aquaculture. (2016).
  12. Ohta, H., Izawa, T. Diluent for cool storage of the Japanese eel (Anguilla japonica) spermatozoa. Aquaculture. 142, (1-2), 107-118 (1996).
  13. Peñaranda, D. S., et al. European Eel Sperm Diluent for Short-term Storage. Reprod. Domestic Anim. 45, (3), 407-415 (2010).
  14. Ohta, H., Kagawa, H., Tanaka, H., Unuma, T. Control by the environmental concentration of ions of the potential for motility in Japanese eel spermatozoa. Aquaculture. 198, (3), 339-351 (2001).
  15. Asturiano, J., et al. Media and methods for the cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm. Fish Physiol. Biochem. 28, (1), 501-502 (2003).
  16. Asturiano, J., et al. Physio-chemical characteristics of seminal plasma and development of media and methods for the cryopreservation of European eel sperm. Fish Physiol. Biochem. 30, (3), 283-293 (2004).
  17. Szabó, G., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) sperm using different extenders and cryoprotectants. Acta. Biol. Hung. 56, (1-2), 173-175 (2005).
  18. Müller, T., et al. Cryopreservation of sperm of farmed European eel Anguilla anguilla. J World Aquac Soc. 35, (2), 225-231 (2004).
  19. Peñaranda, D. S., Pérez, L., Gallego, V., Jover, M., Asturiano, J. F. Improvement of European eel sperm cryopreservation method by preventing spermatozoa movement activation caused by cryoprotectants. Cryobiology. 59, (2), 119-126 (2009).
  20. Marco-Jiménez, F., et al. Cryopreservation of European eel (Anguilla anguilla) spermatozoa: effect of dilution ratio, foetal bovine serum supplementation, and cryoprotectants. Cryobiology. 53, (1), 51-57 (2006).
  21. Asturiano, J. F., et al. Effect of sperm cryopreservation on the European eel sperm viability and spermatozoa morphology. Reprod. Domestic Anim. 42, (2), 162-166 (2007).
  22. Mordenti, M., Di Biase, A., Sirri, R., Modugno, S., Tasselli, A. Induction of Sexual Maturation in Wild Female European Eels (Anguilla anguilla) in Darkness and Light. Isr. J. Aquac. 64, (2012).
  23. Ohta, H., et al. Artificial induction of maturation and fertilization in the Japanese eel, Anguilla japonica. Fish Physiol. Biochem. 17, (1), 163-169 (1997).
  24. Tanaka, S., et al. Long-term cryopreservation of sperm of Japanese eel. J. Fish Biol. 60, (1), 139-146 (2002).
  25. Gallego, V., et al. Subpopulation pattern of eel spermatozoa is affected by post-activation time, hormonal treatment and the thermal regimen. Reprod. Fertil. Dev. 27, (3), 529-543 (2015).
  26. Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. (2016).
  27. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 130, (4), 425-433 (2001).
  28. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234, (1-4), 1-28 (2004).
  29. Verstegen, J., Iguer-Ouada, M., Onclin, K. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57, (1), 149-179 (2002).
  30. Magnotti, C., et al. Cryopreservation and vitrification of fish semen: a review with special emphasis on marine species. Rev. Aquacult. (2016).
  31. Dziewulska, K., Rzemieniecki, A., Czerniawski, R., Domagała, J. Post-thawed motility and fertility from Atlantic salmon (Salmo salar L.) sperm frozen with four cryodiluents in straws or pellets. Theriogenology. 76, (2), 300-311 (2011).
  32. Babiak, I., Bolla, S., Ottesen, O. Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. Aquac. Int. 16, (6), 561-572 (2008).
  33. Müller, T., et al. Japanese eel (Anguilla japonica Temminck & Schlegel, 1846) propagation using cryopreserved sperm samples. J. Appl. Ichthyol. 33, (3), 550-552 (2017).

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