神経周囲浸潤のIn Vivoマウスの坐骨神経モデル

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Cancer Research

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Summary

坐骨神経に同系膵癌細胞を注入することによって浸潤の体内マウス モデルについて述べる。モデル神経浸潤の程度の定量化と浸潤細胞および分子メカニズムの調査をサポートしています。

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Deborde, S., Yu, Y., Marcadis, A., Chen, C. H., Fan, N., Bakst, R. L., Wong, R. J. An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion. J. Vis. Exp. (134), e56857, doi:10.3791/56857 (2018).

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Abstract

癌細胞浸潤 (PNI)、がん細胞が増殖し、神経の微小環境の移行と呼ばれるプロセスを介して神経に侵入します。このタイプの侵略は様々 な癌の種類は、展示し、膵臓癌の発見は非常に頻繁。マウスの膵臓の神経線維の微細なサイズは、直交異方性マウスモデルで難しい PNI の研究をレンダリングします。ここでは、マウスの坐骨神経に同系膵癌細胞株 Panc02 H7 を注入我々 PNI の生体内異所性モデルについて述べる.このモデルでは、麻酔下マウスの坐骨神経を公開され、がん細胞を注入します。挿入ポイントから脊髄に向かって近位の神経の癌細胞に侵入します。侵略の坐骨神経は抽出し、10 月冷凍区分のため処理します。H & E と以下の免疫蛍光染色は、蛋白質の表現の侵略の度に変化の定量化を許可します。このモデルは、その汎用性を与え PNI に関する研究各種に適用できます。PNI の細胞および分子メカニズムの調査のため、別のがんの種類によりさまざまな遺伝的変更および/または異なったタイプの癌細胞とマウスを使用します。さらに、これらのマウスに治療を適用することによって神経浸潤に対する治療薬の効果を学ぶことができます。

Introduction

神経は、がんの成長と移行1,2,3を刺激する特定の腫瘍微小環境を形成します。浸潤 (PNI) は、神経周辺を介して、がん細胞に侵入するプロセスです。それは、癌の浸潤が神経に沿って元のサイトから延びてので転移のユニークなルートとして考慮されるかもしれない。PNI は 22% から 1001,2に至るまで発生率と膵臓、前立腺、頭と首、唾液、子宮頚部、大腸癌を含むいくつかのがんの種類で発見されます。PNI 痛みに関連付けられ、予後不良と悪い生存率1,2と相関します。

神経周囲浸潤のモデルの開発は、このプロセスの細胞および分子メカニズムを明らかにし、梗数を減らす治療剤の候補物質をテストするのには不可欠です。癌と神経間相互作用を勉強の in vitro方法があります神経外植片4後根罹5,67、または特定のセル癌細胞の共培養神経からシュワンなど微小細胞7をです。生体内でのアプローチは、ただし、もっと生理学的に関連して、癌マウスモデルでがんが誘発または移植の使用を含む、会計全体の神経の微小環境の利点があります。同所性同種膵や前立腺癌、PNI のモデルはずっと報告された8,9,10 PNI の発生率が記録される可能性がありますがこれら器官の神経のサイズが小さいため参照してくださいすることは困難です。全体の神経とそのため梗数の程度を定量化します。ここで述べるモデルは単純な手術11を介してマウスの坐骨神経に注入される細胞の癌 PNI の体内モデルです。異所性移植は、脊髄へ神経内に侵入します。脊髄注射のサイトから神経の侵略の長さ測定される、神経中の癌のボリュームだけでなく。重要なは、侵略の神経は様々 なアッセイを顕微鏡、分子解析などのも収集できます。様々 な癌細胞をテストことができますと遺伝的に変更または特定化合物処理ホスト マウスを使用することもことがあります。この強力なアッセイとは、がん細胞とホスト微小環境 PNI のメカニズムを調査用に変更します。

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Protocol

すべての動物の主題のプロシージャは機関動物ケア、メモリアルスローンケタ リング癌センターで利用委員会によって承認されました。

1. がん細胞の調製

  1. 37 ° C で 5 分間 0.25% トリプシン サブ合流する Panc02 H7 セルを収穫します。15 mL 遠心管の細胞を収集します。
    注: セルは、80% の confluency と 4 mL のトリプシンでフラスコあたり約 12 × 106セル T-225 フラスコで育つ/フラスコを使用します。
  2. 5 分洗って再細胞による細胞 (でピペッティングを上下 2 回)、1 mL の PBS でペレット、氷の懸濁液を 1.5 mL 遠心チューブに転送のための 4 ° C で 900 g x で細胞を遠心します。
  3. 4 ° C、5 分で 900 g x で再び細胞を遠心し、ペレットを乱すことがなく上澄みを廃棄します。注射まで氷の上小球形にされた細胞を保ちます。

2. マウスや手術の準備

メモ: この研究では 8 週齢、男性と女性の c57bl/6 j マウス使用します。手術条件当院の IACUC 規則に従います。器具を滅菌、手術の作業面の消毒、動物の消毒、外科医は、滅菌手袋を着用します。

  1. 手術前に日に 2% イソフルランを使用してマウスを麻酔、薄いかみそりまたは化学毛の除去剤で背側の大腿骨の長さに沿う毛皮を取り外します。
  2. 手術の日、部屋に誘導 2 %isofluorane を用いたマウスを麻酔します。つま先ピンチ刺激と応答の欠如によって anesthetization を確認します。
  3. 麻酔下での乾燥を防ぐため目に獣医軟膏を適用します。
  4. 腹側に麻酔下のマウスを置き、ゆっくり注入するのには、手足に軽い張力を作成する低刺激性のテープで各のリムを保護します。麻酔はイソフルレン ノーズコーンと精度気化器を介して配信を使用して維持されます。
  5. その後、再び 70% アルコールで Betadine で注射部位をきれい。さらに 2 回繰り返します。手術野の緩い毛が残っていないことを確認します。
  6. 小さなハサミと大腿骨平行に下約 2 mm で 1 cm の切開を確認します。下にある筋肉を公開するために横方向にピンセットで皮膚を撤回します。
  7. 坐骨神経は、大殿筋と大腿二頭筋の筋への深い実行されます。小さなハサミで筋膜平面に沿ってこれらの 2 つの筋肉を分離し、下に坐骨神経を公開します。鈍的切離を使用して周囲の筋肉から神経を解放します。
  8. 10 μ L のシリンジにペレットから癌細胞 (約 50,000 細胞) の 3 μ L を描画します。
    注: 別の方法として、コントロールとして 3 μ L の PBS を描画します。
  9. サポートのために注射の時点で神経の下に小さな金属のヘラを配置します。解剖顕微鏡で観察、下で挿入時に可能な限り神経を並列として針を維持する、金属ベースに対して神経に針を挿入します。神経の背面を穿刺しないように注意します。このプロセス全体を通じて、できるだけ神経の処理を最小限に抑えます。
  10. 神経 5 以上にゆっくりと注入 s。噴射領域での球根の形成は良い注入を示します。3 のための場所で針を残してそっと針を削除する前に s。3 のための場所で針を維持する s 神経から細胞の逆流を最小限に抑えます。
    注: 末梢神経や脊髄に向かって注入が行えます。実験のセット内で一貫性を維持することが重要です。場合は、細胞は、外流出、実験における動物を含めない。経験と、これらのイベントは非常にまれです。
  11. 神経を元の位置に戻ります。覆っている筋肉と神経をカバーします。適切な鎮痛を持つマウスを治療し、5-0 ナイロン縫合糸で皮膚を閉じます。
  12. それは完全に麻酔から覚醒するまで、復旧中に観察のためきれいなケージで一人でマウスを配置します。
    注: それは完全な意識を取り戻すために動物のための 5-15 分かかります。それは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻したまで動物は放置しません。動物は他の動物を完全に回復するまでの会社に返されません。その後、少なくとも 72 時間のすべての 24 h の回復を評価します。

3. 坐骨神経抽出

  1. Postop 日 #7、CO2を持つマウスを安楽死させます。腹側にマウスを置き、ピンを使用して遠位四肢を安定します。
  2. 注入された手足と胴体の背側の皮膚を削除します。
  3. 鈍的切離を使用、深い筋肉に坐骨神経を公開します。
  4. 腸骨と仙骨の間の神経のコース。脊髄領域における神経へのアクセスを持っている、2 つの骨を区切ります。まず坐骨神経がある狭い領域で閉じたハサミを挿入し、マウスを押しながらはさみを開きます。繊細し、解剖中坐骨神経の整合性を維持します。
  5. 慎重に、大腿骨骨端を遠位と近位脊髄に坐骨神経を解剖します。
  6. 注: 侵略の神経は非常に壊れやすく、引張り破断や強制的な処理になりやすいです。
  7. 最初の遠位端を切断することによって神経を収穫します。隣接組織から解放しながら神経を慎重に持ち上げます。近位端、脊柱から出口にできるだけ近くで神経を切る。
  8. 記録し、ノギスを使用して侵入の総長さ。このマクロ的推定は示しています。

4. 神経処理と定量

  1. 10 月化合物に切り裂かれた神経を埋め込みます。神経を縦に配置することを確認して、できるだけモールドの底部の平らを確認します。
  2. カセットの P と D の文字をマークすることによって神経の近位および遠位側を示す
  3. 彼らはすぐに区分がない場合は、ドライの氷の上に埋め込まれた神経を配置します。サンプルは、数週間-80 ° C で保存可能性があります。
  4. クライオスタット ミクロトームを使用してスライド ガラスに 5 μ m の厚さと場所セクションでセクションのサンプル。可能であれば、合わせて 2 神経セクションごとにスライド。神経の近位側を示します。
  5. H & E 染色12を使用してスライドを染色します。
  6. デジタル高解像度デジタル データを提供するスライド スキャナーで汚された神経のセクションをスキャンします。
  7. 測定距離ボタンをクリックして侵略の長さを定量化するイメージング ソフトウェアを使用して、侵入、または他の領域はパラメーターを希望します。侵略の長さの良い推定、同じ神経の複数のセクション (2、4) を使用します。

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Representative Results

このメソッドは、定量化可能な神経浸潤の生体内でモデルを作成するマウスの坐骨神経に膵臓癌細胞の外科的移植について説明します。図 1は、坐骨神経の解剖学的位置と注射部位を示しています。図 2は、裸のマウスの 2 つの坐骨神経を示しています。(右) MiaPaCa 2 がん細胞を注入した神経に注入 PBS 神経 (左) が比較されるかもしれない。がん細胞を注入する神経は腫瘍が潜入しているし、表示が太くと PBS を注入した神経よりも暗い。

図 3は、野生型および NCAM KO マウスの膵がん細胞 Panc02H7 で坐骨神経浸潤の定量化可能な違いを示します。NCAM KO マウスは、接着分子神経細胞接着分子 1、欠乏13マウスです。侵略の長さや面積は、イメージング ソフトウェアを使用して定量化されています。侵略が見つかりました NCAM KO マウス7で大幅に減少。

Figure 1
図 1: マウスの坐骨神経と注射部位この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 2 つのマウスの坐骨神経の解剖します。PBS は、神経 (左) と MiaPaCa 2 がん細胞 (右) のとおり注射神経に注入されます。黒い矢印は、注射部位を示しています。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 野生型および NCAM KO マウスで Panc02H7 癌細胞と注入坐骨神経の H & E 縦セクション。白い矢印は、インジェクションや脊髄の近位側のサイトを示します。黒い矢印は、対応する値 (mm) と侵略の長さを示します。スケール バー: 5 mm (トップ画像) と 0.2 mm (下の画像)。神経浸潤、侵略の長さや面積によって測定される数量。データを表す平均 ± SD. n = 8 (NCAM1 WT)、n = 7 (NCAM1 島)、* * P < 0.005、* * * P < 0.0005 t 検定を用いたします。(に起因する Deborde et al.、20167)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

このプロトコルでは膵臓癌細胞による坐骨神経浸潤の定量化は、浸潤の体内マウス モデルをについて説明します。このモデルにより、神経浸潤の分子メカニズムの研究です。この技術を用いた実験の成功プロセスで 3 つの重要な手順に慎重なアプローチが必要: 2) 侵略神経 (ステップ 3.4) の抽出と収穫された神経 (手順 4.1) の処理 3) 癌細胞 (手順 2.7、2.8) の 1) の注入。

注射は、癌細胞の損失につながる神経の後ろの壁を刺さないように十分注意されるべきであります。一度針に場所は、注入されるべきゆっくりと着実なペースで以上 5 s 油圧力の推進、がんを防ぐために細胞もはるか前方の挿入ポイントから。追加 3 の注射後から神経に針を残して s バック流れと癌細胞の漏れを最小限に抑えます。坐骨神経の抽出時に、郭清は、侵略の坐骨神経は非常に壊れやすい、非常に穏やかなになりません。癌の浸潤は、坐骨神経の正常細胞組織を混乱させます。侵入した神経が表示されなくても非注射に比べて直径で厚くしたり、非侵略の神経よりもマイナーなストレッチングや操作を破壊する傾向があります。10 月に切除した神経の埋め込み処理、中に金型に、神経は完全に平らに置かれたことを保証するために非常に重要です。この手順により、適切な分析のための神経の全体の長さを取得するサンプルの区分のため。神経に腫瘍はしばしば調達金型の下端から神経から腫瘍に近位の神経セグメントを防ぐためにトリミングする必要があります。神経の全体の長さは、金型に対して完全に平らに配置する必要があります。

このプロトコルを使用している間の多くの変更が考えられます。坐骨神経の下に小さな金属のヘラがないとき広い鉗子のペアの表面を代わりに使用することができます。このアプローチの欠点は、インジェクションや過度の力を使用する場合、神経をクラッシュする可能性の低下の表示が、挿入後の場所で針を保持するために、鉗子は使えます。別の方法は、神経、神経をストレッチする鉗子を開くを持ち上げること微細鉗子を使用することです。このメソッドを実行する方が簡単ですと緊張と注入中に安定化の両方を提供しますが神経の過度のストレッチには、神経に損傷を与える可能性があります。近位または遠位の方向に注入を行うことができますが、我々 があること両方のケースで癌浸潤の方向通常脊髄に向かって。したがって、我々 は脊髄に向かってがん細胞をプッシュ可能性があり、侵略の長さの後の対策を混同する油圧力をさらに最小限に抑える遠位を注入することを好みます。好みの実験のセット内で噴射の方向に一致させることが重要だお勧めします。

同系移植のモデルを提案する、同様の手法のみわずかなバリエーションを持つ、免疫不全マウスに異種移植片のひと癌細胞の使用ことができます。裸のマウス異種移植片では、同系モデルのように神経浸潤のような長さをもたらす癌浸潤が必要長く可能性があります。異なるがん細胞も使えます。PNI は癌、膵臓の頭部および首、前立腺がん、皮膚がんについても普及しています。私たちの研究室が、ひと膵臓癌細胞株 MiaPaCa 2 と坐骨神経のヌードマウスおよび Panc17,14,15正常に挿入します。

えられる有害事象は、マウスは時折傷の開口部にその結果のステッチをかむ創傷裂開。その場合は、傷は、再縫合する必要があります。傷は、手術後の最初の 3 日間に毎日チェックします。マウスも歩いても若干ぐったりと術後、可能性が高いがんの坐骨神経の侵略と同様、両方の手術から痛みのため。これは通常鎮痛薬を必要とするほどではありません。

このモデルには、制限があります。ある程度ストレッチとプロシージャの間に神経の摘心の神経の損害を作成します。さらに、神経に入るセルの正確な数を制御することは困難です。さらに、このモデルは既に神経を侵攻している細胞の研究に限定されます。それは原発巣であるがん細胞の神経の相互作用を研究するモデルではありません。消化管の神経と坐骨神経を使っての主な欠点は、坐骨神経が膵臓癌の転移サイトではないことです。組成と神経線維の性質の違いが侵略に影響を与えます。しかし、アクセシビリティと膵神経の非常に小さなサイズとないような研究をしました。

初心者のための私たちのキーの提案は、ランドマークを簡単に識別できるように、予定切開部位周囲に広いエリアで髪を削除する、注入する前に安定したポジションを持つことを確認するでしょう。多くの注射後実行者は神経浸潤を動物の 100% を得ることができるはず。

このモデルは、癌と動物モデルの神経の相互作用を研究できます。それは、遺伝子改変マウスや癌細胞を用いた腫瘍研究の広い範囲に適用できます。神経に沿って浸潤に対する薬理学的治療は、治療と制御グループ間の侵略の長さや面積を比較することによってテストできます。これら異なるアプリケーション PNI を勉強するための非常に汎用性と強力なツールをこのモデルを作る。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

著者らは、分子細胞診施設、メモリアルスローンケタ リング癌センターの動物施設によって提供される技術サービスをご了承ください。この作品は、NIH 助成金 CA157686 (r. j. ウォン) と P30 CA008748 によって支持された (メモリアルスローンケタ リングがんセンター助成金)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS) Any Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL Falcon 352098 Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL Axygen MCT-150-C-S Step 1.2
Electric razor WAHL 9962 Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL Baxter 1001936060 Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape 3M Blenderm 70200419342 Step 2.3
Betadine Swapsticks PDI SKU 41350 Step 2.4
Webcol Alcohol Preps Covidien 5110 Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps) Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe Hamilton 80308 Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula Fisher Scientific S50823 Step 2.7
Dissecting microscope Step 2.7
Bupivacine, 1 g Enzo Life Sciences BML-NA139-0001 Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture Ethicon 698H Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound VWR 25608-930 Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds VWR 25608-916 Step 4.1

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References

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