Un modèle murin de nerf sciatique In Vivo Perineural invasion

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Cancer Research

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Summary

Nous décrivons un modèle murin in vivo de perineural invasion en injectant des cellules de cancer du pancréas syngénique dans le nerf sciatique. Le modèle permet de quantifier l’ampleur de l’invasion du nerf et prend en charge l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires de perineural invasion.

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Deborde, S., Yu, Y., Marcadis, A., Chen, C. H., Fan, N., Bakst, R. L., Wong, R. J. An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion. J. Vis. Exp. (134), e56857, doi:10.3791/56857 (2018).

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Abstract

Cellules cancéreuses envahissent les nerfs par un processus appelé perineural invasion (PNI), dans laquelle le cancer cellules prolifèrent et migrent dans le microenvironnement de nerf. Ce type d’invasion est exposé par une variété de types de cancer et le trouve très fréquemment dans le cancer pancréatique. La taille microscopique des fibres nerveuses au sein du pancréas de souris complique l’étude des PNI dans les modèles murins orthotopique. Nous décrivons ici un modèle hétérotopique in vivo du PNI, où nous injectons lignée cellulaire de cancer du pancréas syngénique Panc02-H7 dans le nerf sciatique murin. Dans ce modèle, les nerfs sciatiques des souris anesthésiés sont exposés et une injection de cellules cancéreuses. Les cellules cancéreuses envahissent les nerfs dans la partie proximale vers la moelle épinière du point d’injection. Les nerfs sciatiques envahies sont ensuite extraits et traités avec OCT pour le sectionnement gelé. H & E et immunofluorescence souillant de ces sections permettent de quantifier le degré d’invasion et les changements dans l’expression de la protéine. Ce modèle peut être appliqué à une variété d’études ÉIN compte tenu de sa polyvalence. Utilisant des souris avec différentes modifications génétiques et/ou de différents types de cellules cancéreuses permet pour l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires de la PNI et différents cancers. En outre, les effets d’agents thérapeutiques sur l’invasion de nerf peuvent être étudiés en appliquant le traitement de ces souris.

Introduction

Nerfs forment un micro-environnement tumoral spécifique qui stimule le cancer prolifération et la migration1,2,3. Perineural invasion (PNI) est le processus par l’intermédiaire de laquelle le cancer cellules envahissent dans et autour des nerfs. Il peut être considéré comme un itinéraire unique de métastases depuis l’invasion du cancer s’étend loin des sites d’origine le long des nerfs. PNI se trouve dans plusieurs types de cancer, notamment du pancréas, la prostate, la tête & cou, glandes salivaire, col de l’utérus et le cancer du côlon avec une incidence variant de 22 % à 100 %1,2. PNI est associée à la douleur et est corrélée avec un pronostic sombre et pire survie taux1,2.

Élaborer des modèles de perineural invasion est essentiel pour élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires de ce processus et de tester des agents thérapeutiques candidat pour diminuer la PNI. Méthodes in vitro d’étudier les interactions entre les cancers et les nerfs comprennent la co-culture de cellules cancéreuses avec nerf explants4, racine dorsale ganglions5,6,7ou des cellules spécifiques microenvironnement comme Schwann du nerf cellules de7. In vivo des approches, toutefois, sont plus physiologiquement pertinents, comprennent l’utilisation de modèles de souris cancer dont le cancer a été induite par ou transplanté et ont l’avantage de la comptabilité pour le microenvironnement toute nerveuse. Dans orthotopique modèles de cancer du pancréas ou de la prostate, PNI a été rapporté8,9,10 et l’incidence des PNI peut-être être enregistrée, mais en raison de l’exiguïté des nerfs dans les organes, il est difficile de voir le nerf ensemble et donc de quantifier l’ampleur du PNI. Le modèle que nous décrivons ici est un modèle in vivo des PNI dans laquelle le cancer, les cellules sont injectées dans le nerf sciatique de souris grâce à une intervention chirurgicale simple11. La greffe hétérotopique envahit dans le nerf vers la moelle épinière. La longueur de l’invasion de nerf du site d’injection à la moelle épinière peut être mesurée, ainsi que le volume du cancer dans le nerf. Ce qui est important, le nerf envahi peut également être collecté pour une variété de tests, y compris des analyses microscopiques et moléculaires. Une variété de cellules cancéreuses peut être testée, et les souris de l’hôte qui ont été génétiquement modifiés ou traités avec des composés spécifiques peuvent être utilisés aussi bien. Ce dosage puissant permet les cellules cancéreuses et le micro-environnement de l’hôte à modifier pour l’enquête sur les mécanismes de la PNI.

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Protocol

Toutes les procédures avec les sujets animaux ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme au Memorial Sloan Kettering Cancer Center et d’institutionnels animalier.

1. préparation des cellules cancéreuses

  1. Récolte des Panc02-H7 confluentes avec 0,25 % de trypsine pendant 5 min à 37 ° C. Recueillir les cellules dans un tube à centrifuger 15 mL.
    Remarque : Les cellules sont cultivées dans le ballon de T-225, qui contient environ 12 x 106 cellules / fiole à la confluence de 80 % et la trypsine 4 mL / flacon est utilisé.
  2. Centrifuger les cellules à x 900 g à 4° C pendant 5 min. laver les cellules de resuspendant de la cellule de granule dans 1 mL de PBS (par pipetage en haut et en bas deux fois) et transférer la suspension dans un tube de microtubes de 1,5 mL sur la glace.
  3. Centrifuger les cellules à x 900 g à 4° C pendant 5 min et éliminer le liquide surnageant sans déranger le culot. Conserver les cellules granulés sur la glace jusqu'à l’injection.

2. préparation de la souris et la chirurgie

Remarque : les souris C57BL/6J 8 semaines, mâles et femelles sont utilisés dans cette étude. Les conditions de chirurgie suit les règles IACUC de notre institution. Les instruments sont stérilisés, la surface de travail chirurgical est désinfectée, l’animal est désinfectée et le chirurgien porte des gants stériles.

  1. Le jour avant la chirurgie, anesthésier la souris à l’aide de 2 % isoflurane, puis enlever la fourrure sur la longueur du fémur sur la face dorsale avec un rasoir mince ou un détartrant chimique cheveux.
  2. Le jour de la chirurgie, anesthésier les souris à l’aide d’isofluorane de 2 % dans une chambre à induction. Confirmer l’anesthetization par un stimulus de pincée d’orteil et une absence de réponse.
  3. Pommade de vétérinaire sur les yeux pour éviter la sécheresse sous anesthésie.
  4. Placez la souris anesthésiée sur sa face ventrale et fixer doucement chaque branche avec du ruban adhésif hypoallergénique créent une légère tension dans la branche à doser. L’anesthésie est maintenue l’isoflurane envoyée via un vaporisateur de précision et de la coiffe.
  5. Nettoyer le site d’injection avec Betadine, puis à nouveau avec de l’alcool 70 %. Répétez cette procédure deux fois de plus. Assurez-vous qu’aucun cheveux dénoués ne restent sur le champ opératoire.
  6. Faire une incision de 1 cm avec petits ciseaux de 2 mm environ au-dessous et parallèles sur le fémur. Rétracter la peau avec une pince latéralement pour exposer les muscles dessous.
  7. Le nerf sciatique va profondément les muscles grand fessier et le biceps crural. Séparer ces deux muscles le long d’un plan aponévrotique avec petits ciseaux et exposer le nerf sciatique sous. Libérer le nerf des muscles environnants par dissection.
  8. Tirer 3 μl de cellules cancéreuses (environ 50 000 cellules) de l’extrait concentré dans une seringue de 10 μL.
    NOTE : Vous pouvez également dessiner 3 μl de PBS comme un contrôle.
  9. Placez une petite spatule métallique sous le nerf au point d’injection pour la prise en charge. Sous visualisation avec un microscope à dissection, introduire l’aiguille dans le nerf contre la base en métal, gardant que parallèle au nerf que possible lors de l’insertion de l’aiguille. Veillez à ne pas percer à travers le dos du nerf. Réduire au minimum la manipulation des nerfs autant que possible tout au long de ce processus.
  10. Injecter lentement dans le nerf, 5 s. Une formation d’une ampoule dans la zone d’injection indique une bonne injection. Puis laisser l’aiguille en place pour 3 s avant de retirer l’aiguille doucement. Garder l’aiguille en place pour 3 s minimise le reflux des cellules de nerf.
    NOTE : Injection peut être effectuée vers le distal nerf ou la moelle épinière. Il est important de rester cohérent au sein d’un ensemble d’expériences. Si les cellules se répandre à l’extérieur, l’animal ne doit pas être incluse dans l’analyse de l’expérience. Avec l’expérience, ces événements sont très rares.
  11. Retourner le nerf à sa position initiale. Couvrir le nerf avec les muscles du dessus. Traiter les souris avec une analgésie adéquate et puis fermez la peau avec les sutures de Nylon de 5-0.
  12. Placez votre souris seul dans une cage propre pour l’observation pendant la restauration, jusqu'à ce qu’il se réveille totalement de l’anesthésie.
    Remarque : Il faut 5-15 min pour l’animal de retrouver la pleine conscience. L’animal n’est pas laissée sans surveillance jusqu'à ce qu’il a repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal. L’animal n’est pas retourné à la compagnie des autres animaux jusqu'à ce que complètement guéri. Par la suite, évaluer la récupération au moins une fois toutes les 24 h pendant 72 h.

3. le nerf sciatique Extraction

  1. Jour post-opératoire #7, euthanasier les souris en CO2. Placez la souris sur sa face ventrale et stabiliser les branches distales à l’aide d’épingles.
  2. Enlever la peau sur la face dorsale de la branche injectée et le torse.
  3. Par dissection, exposer le nerf sciatique profond vers les muscles.
  4. Les voies de nerf entre l’ilium et le sacrum. Pour avoir accès au nerf à la région de la moelle épinière, séparer les deux os. Commencez par insérer les ciseaux fermés dans la zone étroite où se trouve le nerf sciatique et ouvrez les ciseaux tout en maintenant la souris. Être délicat et maintenir l’intégrité du nerf sciatique au cours de la dissection.
  5. Soigneusement disséquer le nerf sciatique dans la partie distale de l’extrémité du fémur et dans la partie proximale de la moelle épinière.
  6. Remarque : Les nerfs envahies sont extrêmement fragiles et sujettes à la rupture sous tension ou manipulation énergique.
  7. Récolter le nerf de la première coupe de son extrémité distale. Soulever délicatement le nerf tout en libérant de tissus adjacents. Couper le nerf à l’extrémité proximale, aussi près que possible à sa sortie de la colonne vertébrale.
  8. Enregistrez puis brut longueur d’invasion à l’aide d’un pied à coulisse. Cette estimation macroscopique est seulement indicative.

4. traitement et Quantification de nerf

  1. Incorporer le nerf disséqué en OCT composé. S’assurer de placer les nerfs longitudinalement et aussi à plat sur le fond du moule que possible.
  2. Indiquer sur la cassette de la partie proximale et distale du nerf en marquant la lettre P et D.
  3. Placez les nerfs embarqués sur le dessus de la glace sèche, si elles ne sont pas immédiatement sectionnés. Échantillon peut être conservé à-80 ° C pendant plusieurs semaines.
  4. Échantillons de section à l’aide d’un microtome Cryostat à 5 μm sections épaisseur et lieu sur lames de verre. Si possible, fixez 2 sections nerveuses par diapositive. Indiquer la partie proximale du nerf.
  5. Tacher les diapositives à l’aide de H & E coloration12.
  6. Numériquement scan sections nerveuses tachée avec un scanner de diapositives qui fournit des données numériques à haute résolution.
  7. À l’aide de logiciels d’imagerie, de quantifier la durée de l’invasion en cliquant sur le bouton de distance de mesure, zone d’invasion ou d’autres paramètres vous le souhaitez. Pour une bonne approximation de la longueur de l’invasion, utilisez plusieurs sections (2 à 4) du même nerf.

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Representative Results

Cette méthode décrit l’implantation chirurgicale de cellules de cancer du pancréas dans le nerf sciatique murin pour créer un modèle in vivo d’invasion du nerf quantifiables. La figure 1 illustre la localisation anatomique du nerf sciatique et le point d’injection. La figure 2 montre les deux nerfs sciatiques de souris nude. Un nerf de PBS injecté (à gauche) peut être comparé à un nerf injecté avec des cellules cancéreuses de MiaPaCa-2 (à droite). Le nerf injecté avec des cellules cancéreuses est infiltré par la tumeur et apparaît plus épais et plus sombre que le nerf injecté avec du PBS.

La figure 3 montre les différences quantifiables du nerf sciatique invasion par des cellules de cancer du pancréas Panc02H7 dans le type sauvage et souris NCAM KO. Souris NCAM KO sont souris dans lequel la molécule d’adhérence de cellules neurales molécule adhérence 1 est déficient13. Longueur et la zone d’invasion ont été quantifiés à l’aide de logiciels d’imagerie. Invasion a été trouvée considérablement réduite dans la NCAM KO souris7.

Figure 1
Figure 1 : Le nerf sciatique de la souris et le point d’injection. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Les deux disséqué les nerfs sciatiques d’une souris. Un PBS injecté nerf (à gauche) et un nerf injecté avec le cancer MiaPaCa-2 cellules (à droite) sont indiquées. Flèches noires montrent l’endroit de l’injection.  S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : H & E longitudinale sections de nerfs sciatiques, une injection de cellules cancéreuses Panc02H7 dans le type sauvage et souris KO NCAM. Les flèches blanches indiquent le site de l’injection et côté proximal de la moelle épinière. Les flèches noires indiquent la longueur de l’invasion avec les valeurs correspondantes (mm). Barre d’échelle : 5 (haut de la page images) et 0,2 mm (images du bas). Quantification de l’invasion du nerf, tel que mesuré par la longueur et la surface de l’invasion. Les données représentent la moyenne ± SD. n = 8 (NCAM1 WT), n = 7 (NCAM1 KO), ** P < 0,005, *** P < 0,0005 en utilisant le test t. (Résulte de Deborde et al., 20167). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons un modèle murin in vivo d’invasion péri-radiculaire qui permet la quantification du nerf sciatique invasion par des cellules de cancer du pancréas. Ce modèle permet l’étude des mécanismes moléculaires de l’invasion du nerf. Expériences réussies à l’aide de cette technique nécessitent une approche attentive à trois étapes essentielles du processus : 1) l’injection de cellules cancéreuses (étapes 2.7, 2.8), 2) l’extraction des nerfs envahies (étape 3.4) et 3) traitement des nerfs récoltés (étape 4.1).

L’injection doit se faire avec beaucoup de prudence pour éviter de percer à travers la paroi arrière du nerf, ce qui conduit à une perte des cellules cancéreuses. Une fois que l’aiguille est en place, l’injection devrait être faite à un rythme lent et régulier de plus de 5 s pour empêcher la force hydraulique de propulser le cancer des cellules trop loin en avant du point d’injection. Laisser l’aiguille dans le nerf après l’injection pour une supplémentaire 3 s minimisera la fuite de cellule arrière flux et le cancer. Lors de l’extraction du nerf sciatique, dissection doit être très douce comme le nerf sciatique envahi est très fragile. Invasion du cancer perturbe l’organisation cellulaire normale du nerf sciatique. Même si les nerfs ont envahi apparaissent épaissir de diamètre par rapport aux non-injecté ou non envahi nerfs, ils sont plus enclins à rompre avec la moindre étirement et la manipulation. Au cours de l’incorporation du nerf excisé en OCT pour le traitement, il est très important de s’assurer que le nerf est mis complètement à plat sur le moule. Cette étape permet la découpe de l’échantillon pour capturer toute la longueur du nerf pendant une analyse correcte. Tumeur solide sur le nerf doit souvent être coupé pour empêcher le segment de nerf proximal à la tumeur de soulever le nerf du fond du moule. Toute la longueur du nerf il faut poser complètement à plat contre le moule.

Nombreuses modifications peuvent être considérées lors de l’utilisation de ce protocole. Quand une petite spatule métallique n’est pas disponible pour être placé sous le nerf sciatique, la surface d’une paire de pinces large peut être utilisée à la place. Une pince peut servir à maintenir l’aiguille en place après la pose, même si les inconvénients de cette approche sont une vision diminuée de l’injection et le potentiel pour écraser le nerf si une force excessive. Une autre façon consiste à utiliser une pince fine pour soulever le nerf, puis en ouvrant la pince pour étirer les nerfs. Cette méthode est plus facile à exécuter et fournit la tension et stabilisation pendant l’injection, mais risque d’endommager le nerf avec un étirement excessif du nerf. L’injection peut se faire dans une ou l’autre direction proximale ou distale, mais nous avons trouvé que dans les deux cas, la direction de l’invasion du cancer est généralement vers la moelle épinière. Par conséquent, nous préférons injection distale pour minimiser encore plus de force hydraulique qui peut pousser les cellules cancéreuses vers la moelle épinière et confondre les mesures ultérieures de longueur d’invasion. Nous conseillons qu’il est important d’être cohérent dans le choix de l’orientation d’injection dans une série d’expériences.

Bien que nous présentons un modèle de greffe syngénique, une technique semblable peut servir pour les cellules cancéreuses humaines xénogreffes dans des souris immunodéficientes, avec seulement de légères variations. Xénogreffes chez la souris nude mai requis de plus longues périodes d’invasion du cancer pour obtenir des longueurs similaires d’invasion de nerf comme modèles syngéniques. Lignées cellulaires cancéreuses différent peuvent également être utilisées. PNI n’est pas répandue dans le cancer du pancréas, mais aussi de la tête et cou, de la prostate et cancers de la peau. Notre laboratoire a injecté avec succès des souris Nudes dans le nerf sciatique avec des lignées de cellules cancéreuses pancréatiques humaines MiaPaCa-2 et Panc17,14,15.

Les événements indésirables comprennent la déhiscence de la plaie, comme les souris parfois mâchent leurs points aboutissant à l’ouverture de la plaie. Dans ce cas, la blessure devra être ré-cousu. Nous vérifions la plaie tous les jours pour les 3 premiers jours post-opératoires. Les souris peuvent également marcher avec une légère boiterie après l’opération, probablement en raison de la douleur de l’intervention chirurgicale tant qu’invasion de leur nerf sciatique atteints de cancer. Ce n’est généralement pas assez grave pour nécessiter des médicaments contre la douleur.

Ce modèle a des limites. Certaine quantité d’étirements et de pincement du nerf pendant l’intervention peut créer des dommages-intérêts dans le nerf. En outre, il est difficile de contrôler le nombre exact des cellules entrant dans le nerf. En outre, ce modèle est limité à l’étude des cellules qui ont déjà envahi des nerfs. Il n’est pas un modèle pour étudier l’interaction des nerfs avec les cellules cancéreuses situées dans la tumeur primitive. L’inconvénient principal d’utiliser les nerfs sciatiques par rapport aux nerfs du tractus gastro-intestinal est que le nerf sciatique n’est pas un site métastatique du cancer du pancréas. La différence dans la composition et la nature des fibres nerveuses susceptibles d’influencer l’invasion. Cependant, l’accessibilité et la très petite taille des nerfs pancréatiques ne permettrait pas une telle étude.

Nos suggestions clées pour les débutants serait pour enlever les poils dans une vaste zone autour des sites d’incision prévue afin que les points de repère peuvent être facilement identifiés et pour s’assurer d’avoir une position stable avant de commencer à injecter. Après plusieurs injections, l’artiste interprète ou exécutant doit être en mesure d’obtenir 100 % des animaux avec invasion du nerf.

Ce modèle permet l’étude des interactions entre les cancers et les nerfs dans un modèle animal. Il peut être appliqué à un large éventail d’études oncologiques en utilisant des souris génétiquement modifiées, les cellules cancéreuses ou les deux. Traitements pharmacologiques contre l’invasion de la tumeur le long des nerfs peuvent également être testées en comparant la longueur et la surface de l’invasion entre les groupes de traitement et de contrôle. Ces différentes applications possibles font de ce modèle un outil extrêmement puissant et polyvalent pour étudier la PNI.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

Les auteurs remercient les services techniques fournis par le Fonds de cytologie moléculaire et de l’animalerie du Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Ce travail a été soutenu par les NIH subventions CA157686 (R.J. Wong) et P30 CA008748 (subvention d’appui Memorial Sloan Kettering Cancer Center).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS) Any Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL Falcon 352098 Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL Axygen MCT-150-C-S Step 1.2
Electric razor WAHL 9962 Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL Baxter 1001936060 Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape 3M Blenderm 70200419342 Step 2.3
Betadine Swapsticks PDI SKU 41350 Step 2.4
Webcol Alcohol Preps Covidien 5110 Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps) Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe Hamilton 80308 Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula Fisher Scientific S50823 Step 2.7
Dissecting microscope Step 2.7
Bupivacine, 1 g Enzo Life Sciences BML-NA139-0001 Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture Ethicon 698H Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound VWR 25608-930 Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds VWR 25608-916 Step 4.1

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References

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