Vaskemiddel uten lynraske rekonstituering membran proteiner i Lipid Bilayers bruker Fusogenic komplementære-ladet Proteoliposomes.

Biochemistry
 

Summary

Her presenterer vi to lynraske protokoller for rekonstituering membran proteiner i fusogenic proteoliposomes og blanding av slike proteoliposomes målet lipid bilayers vaskemiddel uten levering av disse membran proteiner i den postfusion bilayer. Kombinasjonen av disse metodene kan raskt og enkelt kontrollert montering av komplekse multi-komponent membran systemer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Galkin, M. A., Russell, A. N., Vik, S. B., Berry, R. M., Ishmukhametov, R. R. Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.. J. Vis. Exp. (134), e56909, doi:10.3791/56909 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vaskemidler er uunnværlig for levering av membran proteiner i 30-100 nm små unilamellar vabler, mens mer komplekse, større modell lipid bilayers er mindre kompatibel med vaskemidler.

Her beskriver vi en strategi for å omgå denne grunnleggende begrensningen ved hjelp fusogenic motsatt belastet liposomer bærer en membran proteiner av interesse. Fusjonen mellom slike blemmer skjer innen 5 minutter i en lav ioniske styrke buffer. Positivt ladede fusogenic liposomer kan brukes som enkel transport vektorer for vaskemiddel uten levering av membran proteiner i biomimetic målet lipid bilayers, som er negativt ladet. Vi viser også hvordan Rekonstituer membran proteiner i fusogenic proteoliposomes med en rask 30-minutter-protokoll.

Kombinere disse to tilnærmingene, viser vi en rask montering av en elektronet transportkjeden som består av to membran proteiner fra E. coli, en primær proton pumpe bo3-oksidase og F1Fo ATP syntase, i membraner av blemmer av ulike størrelser, fra 0,1 til > 10 mikron, i tillegg til ATP produksjonen av denne kjeden.

Introduction

Functionalization av kunstig lipid bilayers med membran proteiner er et viktig skritt i samlingen av membran modellsystemer. Den enkleste modellen, proteoliposomes (PL), består av små (30-200 nm diameter) unilamellar blemmer (SUV, også kalt liposomer), med proteiner integrert i deres membraner. PL er tradisjonelt dannet i to trinn1. Første, preformed SUV er blandet med en membran proteiner av interesse og et vaskemiddel i en konsentrasjon over kritiske micelle konsentrasjonen (CMC). Andre fjernes vaskemiddel med ulike dialyse, "bio-perler" eller gel filtrering teknikker, forlater protein i membranen. Sistnevnte tilnærming er mye raskere (~ 30 min1) og er derfor best til rekonstituering skjøre og følsom membran proteiner, mens første metodene er begrenset av vaskemiddel fjerning hastigheten som tar mange timer og kan føre til en betydelige tap av aktivitet og tap av strukturelle integriteten til proteiner. Functionalization av større blemmer (store unilamellar blemmer, LUV, opp til 1 µm diameter) av denne tilnærmingen er mer utfordrende som vesicle størrelsen blir redusert etter vaskemiddel fjerning og det er ikke mulig for gigantiske unilamellar blemmer (GUV, > 1 µm), som de er ustabil vaskemidler (men se Johnson et al. 2 for langsom 2D-krystallisering av membran proteiner i store bilayers). Alternative tilnærminger for GUV membran functionalization3,4,5 eksisterer men er arbeidskrevende, tidkrevende, og fortsatt kreve et vaskemiddel i konsentrasjoner under CMC. Mer komplekse eller skjøre lipid modeller (for eksempel slippverktøy Hydrogel Bilayers6 og 3D utskrivbar slippverktøy grensesnittet Bilayer-basert kunstig vev7) kan ikke tolerere vaskemidler. Raskt voksende syntetisk biologi programmer8,avhengig9,10 kritisk av functionalization for slike komplekse membran strukturer. Derfor er en enkel og robust metode tillater rask og forsiktig levering av membran proteiner i målet skjøre bilayers høyt prioritert i feltet.

Et alternativ, vaskemiddel uten protein leveringsmetode er vesicle fusion, der samspill blemmer membraner samle inn på intakt postfusion bilayer, mens intravesicular vandig innholdet bli blandet, uten å være utgitt i eksterne miljø. Vesicle fusion er aktivert og drevet ved conformational rearrangements innen utfyllende fusogenic agenter (noen proteiner11,12 og peptider13 eller spesialtilpassede DNA14) i den kontakter bilayers, eller Coulombic vekselsvirkningene mellom lipid bilayers dannet complementarily ladet kationisk og anionic lipider15,16, eller kationisk bilayers og negativt ladde proteiner17.

Den tidligere tilnærmingen krever tilstedeværelse av fusogenic agenter i samspill membraner før fusion, er relativt langsom (~ 30 min til nå halv-maksimale fusion12,18), men kan brukes på både naturlig og kunstig membraner.

En fordel av tilnærming med fusogenic lipider (figur 1) er at det gjør mye raskere membran blanding (~ 1 min halv-maksimale, og 5-10 minutter å fullføre reaksjonen). I tillegg styres omfanget av fusion av i) en enkel å formulere relative innhold ladet lipider i fusogenic bilayers, og ii) ionic og generelt, osmotisk styrke reaksjon mediet (salter på over 50 mM og, for eksempel sukrose15 er vist å stoppe fusion), eller en kombinasjon av begge. For å starte fusion, er motsatt ladet fusogenic blemmer blandet i en lav (vanligvis 10-20 mM salt) ionic styrke medium for 5-10 min. En relativ ulempe metoden er at kationisk lipider kan utøve en negativ effekt på funksjonaliteten til membran proteiner i kationisk proteoliposomes før fusion, spesielt i lav ioniske styrke, men denne effekten er reversibel og motvirket av en naturlig lipid sammensetning av post fusion membranen og sin tilbake til normal ioniske styrke medium.

Protocol

1. forberedelse av fusogenic SUV og LUV

  1. Utarbeidelse av fusogenic lipid blanding
    1. Klargjør lager løsninger av nøytrale, kationisk, anionic og fluorescerende lipider i kloroform på 25-50 mg/mL (for eksempel nøytral DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), kationisk etyl-PC (1,2- dimyristoleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine), anionic POPA (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphate), og fluorescerende cholesteryl-Bodipy-FL12, henholdsvis) ved veiing passende mengder av tørr lipider og smelte dem i 100% kloroform (forsiktig! Gjøre dette under avtrekksvifte), eller fortynne kommersielt tilgjengelig kloroform aksjer av lipider med kloroform.
      Merk: Både naturlige lipid ekstrakter og ren syntetisk lipider kan brukes og demonstrere lignende resultater.
    2. Mix 2.5 mg en kationisk og 2,5 mg en nøytral lipid på kloroform lager (1.1.1) i et hetteglass.
      Merk: Dette trinnet gir 5 mg kationisk lipid blandingen i kloroform, som inneholder 50% vekt brøkdel av kationisk lipider. Ved behov kan du legge til 0,5% vekt brøkdel av en fluorescerende lipid i blandingen.
    3. Bland 1 mg av anionic og 4 mg av nøytrale lipider i kloroform aksjer (1.1.1) i et hetteglass. Dette gir 5 mg anionic lipid blanding som inneholder 20% vekt brøkdel av anionic lipider.
    4. Fordampe kloroform under en strøm av nitrogen å danne et tynt lag av tørr lipid.
    5. Fjerne de gjenværende kloroform under vakuum for 10 min.
      Merk: Dette trinnet tar tradisjonelt mye lengre (1-12 h), men vi fant at lengre behandling gir ingen åpenbare forbedring i koblingen Egenskaper av SUV.
    6. Hydrat tørr lipid filmen ved å legge til 0,5 mL buffer A (100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM MOPPER, pH 7.4) hvert hetteglass og etterlot seg å stå ved romtemperatur for 30 min og deretter vortex til lipid filmen er helt løsrevet fra overflaten av glass og b ecomes en homogen lipid suspensjon. Dette bør ta 20-40 s.
  2. Dannelsen av SUV og LUV ved ekstrudering
    1. Montere en ekstrudering systemet (se Tabellen for materiale) med to 1 mL sprøyter med ett av følgende filtere polykarbonat pore størrelser: 100 eller 200 nm skjemaet SUV og 400 eller 800 nm skjemaet LUV.
    2. Overføre lipid suspensjon sprøyter til.
    3. Extrude suspensjon av passerer det gjennom filteret 21 ganger, som vises andre steder18,19.
      Merk: Et ulikt antall passeringer er nødvendig for å minimere overføring til vesicle løsning av store lipid klumper fast til filteret siden mot opprinnelige lipid suspensjon.
    4. Overføre vesicle løsning til 1,5 mL microcentrifuge rør.

2. dannelsen av Fusogenic GUV av invertert emulsjon metoden

Merk: Denne fremgangsmåten er illustrert i figur 2.

  1. Utarbeidelse av lipid-i-olje løsning
    1. Bland en kloroform lager (se trinn 1.1.1) en nøytral lipid (2 mg) og en anionic lipid (0,5 mg) med 1 mL av hexadecane i 1,5-mL microcentrifuge tube.
    2. Fordampe kloroform fra blandingen under konstant miksing og oppvarming til 80 ° C i 30 min holder røret åpen. Lukk røret og la avkjøles til romtemperatur.
  2. Dannelsen av en lipid monolayer på lipid-i-olje/vandig buffer grensesnittet
    1. Sted 200 µL av lipid-i-olje løsningen på 0,5 mL buffer B (20 mM KCl, 0,1 mM MgCl2, 10 mM MOPPER pH 7.4) i en 1,5 mL sentrifuge rør. Merk den konvekse formen av fase separasjon grensen på grunn av overflatespenningen misforholdet mellom olje og vandig bufferen (figur 2A).
    2. Vent til fase separasjon grensen flater, som er veiledende lipid monolayer formasjon på den. Dette tar vanligvis 30-60 minutter ved romtemperatur.
  3. Utarbeidelse av en vann-i-olje emulsjon
    1. Forberede en løsning av en vannløselig ikke-ioniske polysakkarid buffer B, med en tetthet høyere enn tettheten av vann (f.eks 15% Ficoll-400 (w/v), med tetthet 1.05 g/mL)
      Merk: Hvis en kan legge til fluorescerende vannløselige fargestoffer bufferen for bedre visualisering av GUV, og eventuelle andre ønskede vandig innholdet i GUVs.
    2. Overføre 0,5 µL av ovennevnte blanding slik separat 1.5-mL sentrifuge med 100 µL av lipid-i-olje løsningen fra 2.1.2.
    3. Sonicate (44 kHz 14 W) blandingen for 30 s i en ultralyd vannbad. Så kraftig vortex for 45 min å danne en vann-i-olje emulsjon, der hver dråpe vil være belagt av en lipid monolayer (figur 2B).
  4. Konvertering av vann-i-olje emulsjon i GUV
    1. Plasser den resulterende emulsjonen på lipid-i-olje/vandig grensesnittet, og umiddelbart sentrifuge røret i en bord sentrifuge 10.000 x g i 2 minutter. Den resulterende pellet av GUV skal tydelig (figur 2C).
    2. Cool røret til 4 ° C i kjøleskap å størkne lipid-i-olje blanding (figur 2D, hexadecane stivner under 18 ° C), forsiktig fjerne frosne olje, og deretter trekke den vandige fasen.
      Merk: for å lette olje fjerning fryse en wire bøyd i form av et anker ble brukt.
    3. Resuspend GUV pellet i 50 µL frisk bufferen B overføring til en frisk tube, og kontroller under fluorescens mikroskop med en 100 X nedsenking oljeobjektiv (figur 2E).

3. overvåking Vesicle Fusion kobolt-Calcein metode

  1. Utarbeidelse av en gel-filtrering tyngdekraften kolonne.
    1. Suge ~ 10 g av en gel-filtrering harpiks (f.eks superfine sephadex G-50) i 100 mL deionisert vann, og la svu over natten.
    2. Pakke 3 mL av harpiks inn et engangs plast gravitasjon flow kolonne, vask den med ultrapure vann og equilibrate med buffer C (100 mM KCl, 10 mM MOPPER, pH 7.4) i romtemperatur.
  2. Utarbeidelse av SUV+ eller SUV0 lastet med kobolt-calcein.
    1. Forberede en løsning som inneholder 1 mM calcein, 1 mM CoCl2, 98 mM NaCl, 10 mM MOPPER, deretter bringe pH 7,4.
      Merk: Essensen av metoden er det gratis fluorescerende calcein danner et ikke-fluorescerende kompleks med Co2 +. Det blir fluorescerende igjen etter tillegg av EDTA, har høyere affinitet for Co2 +, fortrenger calcein fra kobolt-calcein komplekset (figur 3A).
    2. Legg til 500 µL av denne løsningen i en tørr film av kationisk eller nøytral lipider forberedt som beskrevet i 1.1.
    3. Forberede 100 nm SUV ved ekstrudering som beskrevet i 1.2.
    4. Pellets ekstrudert SUV 1.000.000 x g for 20 min i en bord-ultracentrifuge og resuspend i 1 mL av buffer C. Gjenta pelleting og rørets tre ganger. Bruk 0,6 mL bufferen C for den siste rørets.
      Merk: Disse trinnene fjerner de fleste av de eksterne kobolt-calcein.
    5. Fjerne de gjenværende eksterne kobolt-calcein ved SUV passerer en engangs gravitasjon-flow kolonne lastet med gel-filtrering harpiks equilibrated med buffer C som trinn 3.1.2.
      Merk: Vi vanligvis forkaste første milliliter volumet av gjennomflytsenhet og samle den andre milliliter, som inneholder eksterne kobolt-calcein gratis SUV.
  3. Utarbeidelse av SUV- lastet med EDTA
    1. Forberede løsning 10 mm EDTA, 80 mM NaCl, 10 mM MOPPER, pH 7.4.
    2. Legg til 500 µL av denne løsningen i en tørr film av anionic lipider forberedt som beskrevet i 1.1.
    3. Klargjør SUV- ved ekstrudering som beskrevet i 1.2.
    4. Pellets og resuspend SUV- som beskrevet i 3.2.4.
    5. Fjern gjenværende EDTA ved passerer kolonnen gel-filtrering som beskrevet i 3.2.5 SUV- .
  4. Forbereder SUV fusion
    1. Fortynne SUV0, SUV+og SUV- med buffer D (1 mM MOPPER, pH 7.4) med 0.2 mM CoCl2 og ønsket konsentrasjonen av KCl. Bruk 5 µL av hver type SUV per 1 mL av buffer D.
    2. Inkuber blandingen for minst 1 time.
      Merk: Dette trinnet vil redusere bakgrunnen fluorescens nivået ved å blokkere calcein som er overflaten-bundet til SUV+.
  5. Vesicle fusion
    1. Starte fusjonsreaksjonen ved å blande 1 mL av SUV+ eller SUV0 med 1 mL av SUV (utvannet i buffer D som beskrevet ovenfor) i en 2-mL fluorimeter cuvette og skjerm øke fluorescens av calcein 480 nm eksitasjon og 510 nm utslipp (Figur 3B).
    2. Vent til reaksjonen kommer til ferdigstillelse.
    3. Legg en blanding av vaskemiddel Triton X-100 og EDTA (0,05% siste konsentrasjon og 7 mM henholdsvis) å frigi calcein av blemmer og få maksimal fluorescens signalet.
    4. Bestemme omfanget av fusion definert som prosent av maksimal fluorescens etter vaskemiddel tillegg som vist i Figur 3 c.

4. rask rekonstituering membran proteiner i Fusogenic Proteoliposomes

Merk: Denne fremgangsmåten er illustrert i figur 4A.

  1. Forberede en gravitasjon flow kolonne med gel-filtrering harpiks som beskrevet i 3.1, og equilibrate det med buffer A ved romtemperatur.
    Merk: Alle ytterligere manipulasjoner må gjøres strengt på ≤ 4 ° C, med mindre annet er angitt, minimere tap av protein aktivitet.
  2. Justere konsentrasjon av renset membran protein til 0,7 mg/mL ved å fortynne den med samme utvinning bufferen for protein isolasjon.
  3. Mix 140 µL av protein med 300 µL av preformed SUV, 160 µL buffer A og 60 µL av 10% cholate i Buffer A; Dette gir 1:30 protein: lipid vekt forhold i et siste 660 µL volum.
  4. Forsiktig risting blandingen på en rocking plattform i 15 min.
    Merk: Følgende gjøres ved romtemperatur.
  5. Passerer blandingen gjennom gel-filtrering harpiks, og samle grumset brøker som inneholder proteoliposomes.
  6. Pellets proteoliposomes med et bord ultracentrifuge på 400 000 x g i 15 min.
  7. Forkaste nedbryting som inneholder ikke-rekonstituert protein, og resuspend pellet i 1 mL av fersk buffer A.
  8. Bestemme proteininnholdet i PL og nedbryting bruker Amido svart metoden20.
  9. Bestemme avkastningen av rekonstituering, som vanligvis er rundt 50-70%.
    Merk: Trinn 4.6-4.8 kan eventuelt erstattes av passerer PL løsning gjennom 1 mL av Ni-NTA harpiks pakket inn i en engangs tyngdekraften kolonne og vasket med Buffer A som beskrevet i 3.1.2. Slike bestått vil skille ikke-rekonstituert protein, som fortrinnsvis bindes til harpiks, fra PL, mest som vil være i gjennomflytsenhet.

5. funksjonelle tester av Protein aktivitet i Proteoliposomes

Merk: Begge proteiner som er brukt i denne studien er kraftig proton pumper, som pumpe H+ i proteoliposomes på tillegg av deres underlag (Coenzyme Q1 for bo3-oksidase og ATP F1Fo, henholdsvis), dermed bygge en proton gradient over membranen (ΔpH). Ved vellykket co rekonstituering ved fusion, kan slik forsuring observeres som en nedgang i fluorescens en pH-sensitive sonde ACMA (9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridine)12,15, som brukes rutinemessig for slike oppgaver ( Figur 4B C). I tillegg substrat-spesifikk aktivitet av proteiner (Coenzyme Q1 oksidasjon av bo3-oksidase22 og ATP hydrolyse av F1Fo23,24) kan overvåkes spektrofotometrisk bruker ulike metoder. Her viser vi ATP hydrolyse aktivitet av F1Fo PL bruker en ATP regenererende analysen (Figur 4 d), hvor to enzymer (pyruvate kinase (PK) og laktat dehydrogenase (LDH) opprettholde en konstant konsentrasjon av ATP som følger. PK resirkulerer ATP ved å konvertere ADP produsert av F1Fo tilbake i ATP på bekostning av dens substrat phosphoenolpyruvate (PEP). Pyruvate, som er et produkt av denne reaksjonen, konverteres til laktat av LDH på bekostning av NADH, oksidasjon som kan bli overvåket som reduserer optisk densitet ved 340 nm.

  1. Utarbeidelse av kjemikalier
    1. Forberede 1 mM ACMA aksjer i etanol.
    2. Forberede en 1 mM lager av nigericin (eller noen andre uncoupler) i etanol.
    3. Forberede 25 mM Coenzyme Q1 aksjer i etanol og 1 M DTT lager i buffer A.
    4. Forberede et lager av 100 mM ATP i Buffer A, og justere sine pH 7,4.
    5. Forberede aksjer ATP regenererende systemkomponenter i Buffer A: 100 mM PEP, 1 mM NADH og løsninger PK og LDH på konsentrasjon av ~ 500-1000 enheter/mL.
  2. Coenzyme Q1 oksidasjon-drevet proton pumpe av bo3-oksidase PL
    1. Legge til 20 µL av PL fluorimeter søppel med 2 mL buffer A i nærvær av 0,5 µM ACMA, og vente til stabilt signal 430 nm eksitasjon og 515 nm utslipp.
    2. Legge til 40 µM Coenzyme Q1 cuvette.
    3. Starte proton pumpe ved å legge til 2 mM DTT PL (figur 4B).
      Merk: DTT reduserer oksidert Coenzyme Q1 og gjør det tilgjengelig for bo3-oksidase.
    4. Spre dannet ΔpH ved å legge til 2 µM uncoupler (for eksempel nigericin). ACMA fluorescens signal bør raskt tilbake til nesten det opprinnelige nivået.
      Merk: Det skal ingen ACMA slukke ved tillegg av underlaget, hvis uncoupler reaksjonsblandingen først.
  3. ATP hydrolyse-drevet proton pumpe av F1FoPL
    1. Legge til 40 µL av PL fluorimeter søppel som beskrevet i 5.2.
    2. Starte proton pumpe ved å legge til 0.2 mM ATP PL (figur 4C).
    3. Spre ΔpH som beskrevet i 5.2.4.
  4. ATP hydrolyse av F1FoPL og dens stimulering av uncoupler
    1. Legge til 40 µL av PL til spektrofotometer søppel med 2 mL buffer A, som inneholder 1 mM ATP, 0.2 mM NADH, 2 mM PEP, og 15 µL hver PK og LDH.
    2. Følg reaksjonen ved å måle absorbansen reduksjon av NADH på 340 nm. 3-4 min senere, legger 2 µM uncoupler til cuvette å løslate backpressure av ΔpH på ATP hydrolyse. Reaksjonshastighet bør øke umiddelbart.
      Merk: PL passert gjennom Ni-NTA harpiks som beskrevet i 4.10 vil demonstrere den sterkeste stimulering av uncoupler (Figur 4 d, røde trace), mens eluate er knapt stimulert (blå trace).

6. testing påvirker Lipid miljø og ioniske styrke funksjonaliteten til membran proteiner i Fusogenic Proteoliposomes

  1. Vurdere proton pumpe av 40 µL av PL+, PL- og PL0 med ACMA slukke analysen i 2 mL buffer D med 1 mM MgCl2 og 20 (figur 5, panelet A) eller 100 mM KCl (Panel B) som beskrevet i 5.2 eller 5.3 (figur 5 rød, svart og blå spor).
  2. Sikring 40 µL av PL+ med samme volum på LUV- i 2 mL bufferen D med 20 mM KCl, og test for ACMA slukke (grønn trace).
  3. Kjøre kontroll eksperimenter som i trinn 2 ved å blande, for eksempel belaste PL og SUV av samme (grå trace).
    Merk: Proton pumpe bør forbedres ved postfusion PL.

7. levering av membran proteiner i LUV og GUV av Fusogenic Proteoliposomes

  1. Sikring 50 µL av PL+ med 50 µL av 800 nm LUV- i 1 mL av buffer D supplert med 1 mM MgCl2og 20 mM KCl i 5 minutter.
  2. Pellets blemmer på 6000 x g i 5 min, og forkaste supernatant som inneholder Ureagert PL+. Resuspend pellet i 1 mL av buffer D supplert med 1 mM MgCl2 og 100 mM KCl og gjentar pelleting og resuspending to ganger mer.
  3. Kjør ACMA slukke analysen som beskrevet i 5.2 eller 5.4.
  4. Kjøre kontroll eksperimenter, som i trinn 1-3, kombinasjoner av komplementære ladet blemmer i høy salt (200 mM KCl), ikke-fusogenic blemmer og bare tomme LUV- uten PL+.
    Merk: Proton pumpe av postfusion LUV bør være oppdaget bare når complementarily ladet blemmer ble brukt som vist i figur 6.

8. montering av elektronet transportkjeden fra enkeltkomponenter i membraner av LUV og GUV ATP produksjonen av denne kjeden.

Merk: En skjematisk i denne fremgangsmåten er illustrert i figur 7A. ATP produseres i dette eksperimentet vil bli registrert av luciferin-luciferase systemet, der konvertering av syntetisk ATP i pyrophosphate og forsterker av luciferase etterfølges av lys utslipp registrert med en luminometer. Vi anbefaler å bruke en enkelt-rør luminometer, i stedet for den mindre sensitive microplate luminometers.

  1. Mix 3 µL av bo3-oksidase PL+ og 5 µL av F1Fo PL+ dannet som beskrevet i punkt 4.
  2. Sikring dem med 3 µL LUV eller GUV- (dannet som beskrevet i del 2) i 800 µL bufferen D supplert med 20 mM KCl og 1 mM MgCl2 i 5 min.
  3. Bruker høy konsentrasjon aksjer, Legg KCl og MOPS til 100 mM og 50 mM endelige konsentrasjon å postfusion membraner.
    Merk: Ved post fusion LUV, dette trinnet vil hindre deres hevelse på grunn av osmotisk forskyvningen mellom eksterne (buffer A) og intravesicular (bufferen D) salter konsentrasjon.
    1. Eventuelt pellets postfusion membraner som beskrevet i 7.2 skille Ureagert SUV+og resuspend pellet i 800 µL bufferen A.
  4. Forberede 200 µL av en luciferin-luciferase-ADP cocktail med 400 µM ADP, 50 µM luciferin og 2,5 µg luciferase buffer A
  5. Legg cocktail til postfusion blanding fra Step8.3.
  6. Legge til 40 µM av oksidert Coenzyme Q1og utløse energigivende av postfusion membraner bo3-oksidase ved å legge til 2 mM DTT. Vente 1 min.
  7. Starte ATP syntese ved å legge til 5 mM kalium fosfat (KPjeg, pH 7.4) energi blemmer, og oppdage ATP produksjonen med en luminometer (figur 7B). Kjør reaksjonen for ~ 3 minutter.
    Merk: ATP syntese reaksjon fortsetter i 5-7 min til uttømming av oksygen fortært av bo3-oksidase og luciferase.
  8. Legge ATP referanse standard (0,5 nmol ATP) til reaksjonsblandingen to ganger. Mål ATP produseres.
  9. Få den faktiske mengden ATP produseres i reaksjonen ved å dele signalet fra ATP syntese reaksjon av ATP referanse standard signalet. Juster denne verdien til den totale mengden F1Fo brukes i reaksjonen, og endelig express frekvensen av ATP syntese i µmol ATP / (mg F1Fo* min).

Representative Results

Bruk av fusogenic komplementære ladet proteoliposomes for rask vaskemiddel uten levering av membran proteiner i målet bilayer membraner inkluderer tre trinn (figur 1): A, dannelsen av fusogenic SUV fra lipid blandinger med høy innholdet i ladet lipider; disse SUV kan eventuelt ha en intravesicular load; B, konvertering av fusogenic SUV i PL ved hjelp av vår raske membran protein rekonstituering; C, fusjon av fusogenic PL med målet bilayers i en lav-salt medium, etterfulgt av tillegg av høyt saltinnhold stoppe fusjonsreaksjonen. Ved store blemmer (D), en å foretrekke strategi er å levere membran proteiner i anionic målet bilayer, som gir en bedre lipid miljø for aktivitet av membran proteiner (drøftet videre i teksten).

GUV formasjon protokollen invertert emulsjon metode utheves i detalj i figur 2. Vi foretrekker å bruke hexadecane i lipid-olje blanding på grunn av sin relativt høy (18 ° C) frysetemperatur, som tillater enkel fjerning av befestet olje etter GUV pelleting.

Figur 3 viser vesicle fusion hjelp kobolt-calcein-EDTA-metoden. Fusion er sett bare når komplementære ladet blemmer brukes i lav salt buffere, mens høyere salt konsentrasjoner (> 50 mM14) eller bruk av ikke-fusogenic blemmer demonstrere ingen fusion.

Denne rask protokollen av rekonstituering membran proteiner i fusogenic SUV er illustrert i figur 4A. Bruker denne protokollen, viser vi raskt rekonstituering for primære proton pumpe bo3-oksidase og F1Fo ATP syntase PL og vurdering av deres bestemt aktivitet i disse membranene. Det er viktig å nevne at avkastningen av protein rekonstituering avhenger ikke for en lipid brukes15 og er ca 50-75%25,12, og at etter rekonstituering i PL, kan protein lagres i minst tre dager, selv ved romtemperatur uten åpenbare tap av protein aktivitet. Denne prosedyren gir også enveis retningen på ATP syntase, der mer enn 95% av det har sin hydrofile moiety F1 orientert utover15,26.

Figur 5 viser at proton pumpe aktivitet av F1Fo (Panel A) og bo3-oxidase (Panel B) i kationisk lipider er redusert og følsom for lav ioniske styrke, i forhold til anionic og nøytrale lipid miljø, men Denne effekten er begrenset i postfusion membraner etter fusing PL+ med anionic LUV-.

Figur 6 viser levering av F1Fo ATP syntase i membraner av store blemmer. I dette eksperimentet, PL+ og 800 nm LUV- ble smeltet i 20 mM KCl for 5 min og reaksjon produktet var pelleted for å fjerne Ufiksert PL+, resuspended og assayed for proton pumpe. Kontroll viste ingen proton pumpe når LUV0 i stedet for LUV- ble brukt i fusjonsreaksjonen (svart trace) eller tom LUV- alene var assayed (blå trace).

Rask montering av en fungerende elektronet transportkjeden i membraner av store blemmer med fusogenic PL vises i figur 7. Vi brukte F1Fo SUV+ og bo3 SUV+ for fusjon med 800 nm LUV-, og vist ATP produksjonen av denne kjeden i postfusion blemmer av fortløpende legge Coenzyme Q1 og DTT til energi membraner, og deretter legge fosfat utløse ATP syntese av F1Fo.

Figure 1
Figur 1: oppfatning av lynraske vaskemiddel uten levering av membran proteiner i målet lipid bilayers via blanding av unilamellar blemmer dannet av komplementære ladet lipider. (A) dannelsen av kationisk og anionic fusogenic liten unilamellar blemmer (SUV+, SUV-) Alternativt lastet med intravesicular Last. (B) konvertering av fusogenic SUV i fusogenic proteoliposomes (PL) av rekonstituering membran proteiner. (C) vaskemiddel-gratis levering av membran proteiner i postfusion membraner med fusogenic PL. (D) å foretrekke strategi for levering av membran proteiner i membraner av store blemmer, illustrert av fusjonen mellom 100 nm PL+ og 800 nm LUV-. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: GUV formasjon protokoll med en invertert emulsjon metode. (A) dannelsen av en lipid monolayer på grensen mellom olje-lipid blanding og vann. (B) dannelsen av en invertert (vann-i-olje) emulsjon. (C) GUV dannelsen av passerer emulsjonen gjennom olje-vann grensen gjennom sentrifugering. (D) kjøling av rør under < 18 ° C å stivne og fjerne oljen. (E) A fluorescerende mikroskopi bilde av en GUV inneholder fluorescerende lipid (1% vekt brøkdel cholesteryl-Bodipy-FL12) i sin membran (grønn) og en polar fluorophore (1 mM Sulforhodamine 101) i vesicle's lumen (rød). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Lipid blemmer fusion studerte med metoden kobolt-calcein-EDTA. (A) skjematisk av metoden der gratis calcein frigjøres fra et ikke-fluorescerende kobolt-calcein kompleks av EDTA. (B) Fusion SUV i ulike KCl konsentrasjoner. (C) utgivelsen av den intravesicular calcein ved tillegg av EDTA og Triton X-100 vaskemiddel til postfusion vesikler vises i B som beskrevet i teksten. Fusion omfanget (%) for rød spor beregnes ved maksimal bakgrunn-korrigert fusion signalet (1 - 2) i bakgrunn-korrigert maksimal signal etter utgivelsen av innkapslede calcein (3-2) og multiplisere med 100. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Superrask rekonstituering bo3-oksidase og F1Fo fusogenic proteoliposomes og protein aktivitet mål i slike proteoliposomes. (A) skjematisk av rekonstituering-protokollen. (B) Coenzyme Q1 oksidasjon drevet proton pumpe av bo3-oksidase i PL målt med ACMA slukke (forklart i teksten). (C) ATP hydrolyse-drevet proton pumpe av F1Fo i PL målt med ACMA slukke (forklart i teksten). (D) ATP hydrolyse av F1Fo i PL målt med ATP-regenerere system (forklart i teksten), og dens stimulering av uncoupler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: påvirkning av lipid miljø og ioniske styrke på aktiviteten på membran proteiner. Proton pumpe av F1Fo (A) og bo3-oxidase (B) i kationisk PL (rød trace), anionic PL (blå trace), nøytrale PL (svart trace) og kationisk PL smeltet sammen med anionic LUV (grønn trace) i 20 og 100 mM KCl. Control spor ( grå) viser ingen endring i proton pumpe av F1Fo PL- på blande med SUV-. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Levering av F1Fo ATP syntase i membraner av 800 nm LUV- via sammensmelting med PL+. (A) skjematisk av eksperimentet: PL+ og 800 nm LUV- ble smeltet i 1 mM MOPPER (pH 7.4), 1 mM MgCl2, 20 mM KCl for 5 min, pelleted for å fjerne Ufiksert PL og resuspended i samme bufferen. (B) Proton pumpe av postfusion LUV (rød trace). Kontroll viste ingen ACMA slukker når PL0 ble blandet med LUV- (svart trace), eller tom LUV- alene var assayed (blå trace). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: 5-min vaskemiddel uten montering av en elektronet transportkjeden i membraner av 800 nm LUV- via sammensmelting med PL+. (A) skjematisk av eksperimentet: 100 nm F1Fo PL+ og 100 nm bo3-oksidase PL+ var smeltet sammen med LUV-, som beskrevet i figur 6. Fusion ble stoppet ved å legge KCl og MOPS til 100 og 50 mM, henholdsvis. Membraner ble blandet med ADP-luciferin-luciferase cocktail og energized med tillegg av DTT og Q1, som beskrevet i teksten. ATP produksjonen ble startet av 1 mM fosfat (Pjeg) og overvåket sanntid med luciferase-luciferin system som beskrevet i teksten. (B) ATP syntese av postfusion blemmer (rød trace). Kontroll eksperimenter viste ingen ATP produksjonen når PL+ ble blandet med LUV- i høy salt (grå) eller PL0 ble blandet med LUV- (svart). ATP syntese er beregnet som forklart i teksten (trinn 8,8-8,9). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Følgende par spørsmål må vurderes for suksessen til denne eksperimentelle tilnærming:

Valg av lipid betalt for proteoliposomes og mål bilayers: Kationisk lipider finnes ikke i naturen, mens anionic lipider er rikelig i biologiske membraner nå, for eksempel ~ 25, 35 og 20% i indre membran av E. coli, plasma membran av gjær S. cerevisiaeog indre mitokondrie membraner av mange arter, henholdsvis27,28,29. Det ville være rimelig å forvente at funksjonaliteten til membran proteiner i PL+ påvirkes av styrken til en positiv kostnad av bilayer, som igjen vil avhenge av en relativ innholdet i kationisk lipid i bilayer og eksterne ioniske styrke. Derfor er det viktig å adressere eksperimentelt i hvilken grad funksjonaliteten til membran proteiner av interesse vil avhenge for kationisk lipid miljøet. Her viser vi at både F1Fo ATP syntase og bo3-oksidase er følsomme for kationisk lipid miljø, men vi klarte å modulere og reversere denne effekten ved å plassere proteiner i PL+ og levere dem til anionic aksepterer bilayers, og deretter øker ioniske styrke reaksjon mediet etter fusion er ferdig.

Valg av et bestemt kationisk lipid: De fleste kommersielt tilgjengelige kationisk lipider er av ikke-triacylglyceride natur; Derfor må en potensiell kandidat lipid bli testet for kompatibilitet med membran proteiner av interesse. Vi fant tidligere15 som ATP syntase brukt i denne studien viste sitt beste ytelse i PL+ dannet av etyl-PC, som har den høyeste strukturelle likheten å de naturlige triacylglyceride lipider, i DOTAP (ikke-triacylglyceride lipid) PL+ dette proteinet var mindre aktive.

Vesicle fusion analyser: Sant vesicle fusion (når intravesicular flytende innholdet blander) må være differensiert fra mellomliggende hemi-fusion stater, når blemmer følge hverandre uten blanding vandig innholdet, men lett blande innholdet deres eksterne eller begge lipid brosjyrer30. Ved suboptimal lipid blandinger eller visse betingelser viser blemmer også uttalt flytende innhold lekkasje under fusion31. Minimal konsentrasjoner av ladet lipider i fusogenic blandinger aktivere sant fusion må finne eksperimentelt for hver lipid arter, men generelt er det funnet at membraner med mindre enn 10% belastet lipider gjengis ikke-fusogenic 32.

Mens forming fusogenic SUV i nærvær av multi-valent ioner, er det viktig ikke å blande oppositely ladet komponenter, som dette kan føre til umiddelbar klumper og samling av lipider av disse ioner. For eksempel mens forbereder SUV metoden kobolt-calcein-EDTA, er det viktig å unngå blande en kationisk lipid blanding med EDTA å forhindre tilstopping av polykarbonat filteret klumpet seg komponentene.

Det er også viktig å nevne at metoden kobolt-calcein-EDTA samtidig veldig følsom og praktisk for sanntids fusion overvåking, kan fortsatt undervurdere omfanget av fusion på grunn av 1) selv slukke av fluorescens av gratis calcein inne postfusion blemmer, som forventes å nå 1 mM, mens selv slukke terskelen er rapportert å være rundt 20 µM33og 2) overflate-bundet kobolt-calcein, som forblir bundet til SUV+ selv etter passerer gjennom gel-filtrering harpiks og farger blemmer til en lys oransje farge, mens SUV0 har en lys oransje farge. Merk også at utgivelsen av den bundne kobolt-calcein på tillegg av vaskemiddel Triton X-100 i nærvær av EDTA genererer mye sterkere signaler for SUV+ (Figur 3 c, røde spor) enn SUV0 (grå trace).

Perspektiver: vi forventer at rask tilnærminger beskrevet her kan sterkt forenkle og forsere montering av komplekse membraner for behov av nye syntetisk biologi programmer. Våre membran protein rekonstituering protokollen tar bare en halv time til rekonstituering skjøre stort membran proteiner kjent for å være følsomme for lange dialyse-baserte rekonstituering teknikker, mens denne fusogenic tar bare 5-10 minutter å levere slike proteiner i store lipid bilayers. Her viser vi fordelene av disse metodene ved å manipulere E. coli F1Fo ATP syntase, som er et eksempel på en skjør protein. Det er laget av 23 underenheter og kan lett miste sin integritet hvis utsatt for suboptimal forhold (for eksempel varme) under/etter solubilization, men brukes i disse prosedyrene, protein demonstrerer reproduserbar høy aktivitet i proton pumpe.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlig til Robert Gennis fra University of Illinois og Christoph von Ballmoos fra Universitetet i Bern for å gi en plasmider og en belastning å uttrykke bo3-oksidase. Prosjektet ble støttet av BBSRC gi BB/L01985X/1 R.I. og R.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DOPC neutral lipid Avanti Lipids 850375
POPA anionic lipid Avanti Lipids 840857
E-PC cationic lipid Avanti Lipids 890704
Cholesteryl-Bodipy-FL12 Thermofisher C3927MP
Sephadex G-50, Super Fine Sigma G5050
Ficoll 400, Type 400-DL Sigma F8016
ACMA Sigma A5806
Nigericin Sigma N7143
ATP Sigma A26209
Q1 Sigma C7956
DTT Sigma D0632
PEP Sigma 860077
NADH Sigma N8129
PK Sigma P9136-1KU
LDH Sigma L1254-1KU
Luciferin Sigma L6882
Luciferase Sigma/Roche 10411523001
Calcein Insight Biotechnology sc-202090
CoCl2 Sigma C8661
EDTA Sigma E6758
Sulforhodamine 101 Sigma S7635
Extrusion system Avanti Extruder
Single tube luminometer, model Sirius L Titertek Berthold
Polycarbonate filter, D19 mm Sigma, Whatman NucleporeTrack-Etched Membranes WHA800309, WHA800284 100 or 200 nm to form SUV, and 400 or 800 nm for LUV
Name Company Catalog Number Comments
Buffers used in the paper
Buffer A 100 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.4, 1 mM MgCl2
Buffer B 20 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4, 0.1 mM MgCl2
Buffer C 100 mM KCl, 10 mM MOPS pH 7.4
Buffer D 1 mM MOPS pH 7.4
Various concentrations of KCl

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Liposomes, Pt B. 372, 65-86 (2003).
  2. Johnson, M., et al. Two-dimensional crystallization of membrane proteins by reconstitution through dialysis. Methods Mol Biol. 955, (31-58), 31 (2013).
  3. Dezi, M., et al. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proc Nat Acad Sci U S A. 110, (18), 7276-7281 (2013).
  4. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys J. 87, (1), 419-429 (2004).
  5. Angelova, M., et al. Preparation of Giant Vesicles by External Ac Electric-Fields - Kinetics and Applications. Trends in Colloid and Interface Science Vi. 89, 127-131 (1992).
  6. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8, (6), 1048-1057 (2013).
  7. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-Like Printed Material. Science. 340, (6128), 48-52 (2013).
  8. Khalil, A. S., Collins, J. J. Synthetic biology: applications come of age. Nat Rev Genet. 11, (5), 367-379 (2010).
  9. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Lett. 588, (17), 2755-2761 (2014).
  10. Church, G., et al. Realizing the potential of synthetic biology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (4), 289-294 (2014).
  11. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337, (6100), 1340-1343 (2012).
  12. Nordlund, G., Brzezinski, P., von Ballmoos, C. SNARE-fusion mediated insertion of membrane proteins into native and artificial membranes. Nat Commun. 5, 4303 (2014).
  13. Decout, A., et al. Enhanced efficiency of a targeted fusogenic peptide. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 1372, (1), 102-116 (1998).
  14. Chan, Y. H., van Lengerich, B., Boxer, S. G. Effects of linker sequences on vesicle fusion mediated by lipid-anchored DNA oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (4), 979-984 (2009).
  15. Ishmukhametov, R. R., Russell, A. N., Berry, R. M. A modular platform for one-step assembly of multi-component membrane systems by fusion of charged proteoliposomes. Nat Commun. 7, 13025 (2016).
  16. Biner, O., et al. Delivery of membrane proteins into small and giant unilamellar vesicles by charge-mediated fusion. FEBS Lett. 590, (14), 2051-2062 (2016).
  17. Bian, T., et al. Direct detection of SERCA calcium transport and small-molecule inhibition in giant unilamellar vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 481, (3-4), 206-211 (2016).
  18. Schuette, C. G., et al. Determinants of liposome fusion mediated by synaptic SNARE proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (9), 2858-2863 (2004).
  19. Spencer, A. C., Torre, P., Mansy, S. S. The encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics. J Vis Exp. (80), e51304 (2013).
  20. Verchere, A., et al. In vitro investigation of the MexAB efflux pump from Pseudomonas aeruginosa. J Vis Exp. (84), e50894 (2014).
  21. Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of Microgram Quantities of Protein in the Presence of Milligram Levels of Lipid with Amido Black B-10. Analytical Biochemistry. 150, (1), 97-104 (1985).
  22. Rumbley, J., et al. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochim Biophys Acta. 1340, (1), 131-142 (1997).
  23. Taussky, H. H., Shorr, E. A Microcolorimetric Method for the Determination of Inorganic Phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 202, (2), 675-685 (1953).
  24. Galkin, M. A., Ishmukhametov, R. R., Vik, S. B. A functionally inactive, cold-stabilized form of the Escherichia coli F1Fo ATP synthase. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757, (3), 206-214 (2006).
  25. Ishmukhametov, R. R., Galkin, M. A., Vik, S. B. Ultrafast purification and reconstitution of His-tagged cysteine-less Escherichia coli F1Fo ATP synthase. Biochim Biophys Acta. 1706, (1-2), 110-116 (2005).
  26. Wiedenmann, A., Dimroth, P., von Ballmoos, C. Deltapsi and DeltapH are equivalent driving forces for proton transport through isolated F(0) complexes of ATP synthases. Biochim Biophys Acta. 1777, (10), 1301-1310 (2008).
  27. Morein, S., et al. Wild-type Escherichia coli cells regulate the membrane lipid composition in a "window" between gel and non-lamellar structures. J Biol Chem. 271, (12), 6801-6809 (1996).
  28. Zinser, E., et al. Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 173, (6), 2026-2034 (1991).
  29. Daum, G., Vance, J. E. Import of lipids into mitochondria. Prog Lipid Res. 36, (2-3), 103-130 (1997).
  30. Pantazatos, D. P., MacDonald, R. C. Directly observed membrane fusion between oppositely charged phospholipid bilayers. J Membr Biol. 170, (1), 27-38 (1999).
  31. Pantazatos, D. P., Pantazatos, S. P., MacDonald, R. C. Bilayer mixing, fusion, and lysis following the interaction of populations of cationic and anionic phospholipid bilayer vesicles. J Membr Biol. 194, (2), 129-139 (2003).
  32. Sunami, T., et al. Detection of association and fusion of giant vesicles using a fluorescence-activated cell sorter. Langmuir. 26, (19), 15098-15103 (2010).
  33. Memoli, A., et al. Effects of surfactants on the spectral behaviour of calcein (II): a method of evaluation. J Pharm Biomed Anal. 19, (3-4), 627-632 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics