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एक Vivo में रक्त मस्तिष्क बाधा विघटन का एक चूहा मॉडल में कोरोनरी स्ट्रोक का आकलन

Neuroscience

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Summary

इस प्रक्रिया का समग्र लक्ष्य vivo स्ट्रोक के चूहे मॉडल में रक्त मस्तिष्क बाधा व्यवधान के वीवो आकलन में के लिए एक उच्च reproducible तकनीक प्रदान करने के लिए है ।

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Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (133), e57156, doi:10.3791/57156 (2018).

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Abstract

कोरोनरी स्ट्रोक vasogenic मस्तिष्क सूजन और बाद में प्राथमिक मस्तिष्क चोट है, जो रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) के विनाश के माध्यम से मध्यस्थता है की ओर जाता है । प्रेरित कोरोनरी स्ट्रोक के साथ चूहों की स्थापना की और BBB के कार्यात्मक अखंडता की जांच करने के लिए vivo में मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया । कोरोनरी चोट के साथ मस्तिष्क के नमूनों में इवांस ब्लू (EB) के स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक का पता लगाने के अनुसंधान और उपंयास चिकित्सीय मोडलों के विकास के लिए विश्वसनीय औचित्य प्रदान कर सकता है । इस विधि reproducible परिणाम उत्पंन करता है, और विशेष उपकरणों के लिए एक की आवश्यकता के बिना किसी भी प्रयोगशाला में लागू है । यहां, हम चूहों में कोरोनरी स्ट्रोक की प्रेरण के बाद EB के extravasation का पता लगाने पर एक कल्पना और तकनीकी दिशानिर्देश पेश करते हैं ।

Introduction

Vasogenic मस्तिष्क सूजन के कारण रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) व्यवधान कोरोनरी स्ट्रोक की एक महत्वपूर्ण जटिलता और स्ट्रोक रोगियों में जीवित रहने की दर का एक प्रमुख निर्धारक1,2रहता है । रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB), जो मस्तिष्क केशिका endothelial कोशिकाओं (BCECs) द्वारा गठित और विशिष्ट neurovascular घटकों से बना है (जैसे, BCECs, pericytes, astroglial, और ंयूरॉन कोशिकाओं के बीच तंग जंक्शनों3), प्रदान करता है एक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) और परिधीय रक्त परिसंचरण4,5के बीच विशेष और गतिशील इंटरफेस । ischemia के रूप में अपमान-reperfusion चोटों BBB के कार्यात्मक अखंडता को बाधित और मस्तिष्क पैरेन्काइमा में घूम ल्यूकोसाइट्स के बाद प्रवेश करने के लिए नेतृत्व कर सकता है कि अंततः मस्तिष्क सूजन और प्राथमिक मस्तिष्क चोटों ट्रिगर , 7. पशु मॉडल एक स्ट्रोक की घटना के बाद BBB की शिथिलता का सटीक पता लगाने के लिए आवश्यक हैं । इस तरह के मॉडल अंतर्निहित pathophysiological तंत्र का अध्ययन और नई न्यूरोप्रोटेक्टिव रणनीतियों को शुरू करने के लिए बहुत महत्व के हैं । इन विट्रो सेल संस्कृति BBB के मॉडल आधारित अत्यधिक विकसित किया गया है और BBB physiopathology8,9,10के आणविक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया । फिर भी, vivo में पशु मॉडल है, जो मानव नैदानिक परिस्थितियों के समान BBB की कोरोनरी क्षति का उत्पादन, इस संबंध में बहुत सार्थक हैं । इवांस ब्लू (EB) के extravasation की मात्रात्मक जांच एक अच्छी तरह से स्वीकार किए जाते है और संवेदनशील तकनीक है कि BBB अखंडता और neurodegenerative रोगों में समारोह के आकलन के लिए इस्तेमाल किया गया है, कोरोनरी स्ट्रोक सहित11, 12 , 13 , 14. यह विधि किसी प्रायोगिक प्रयोगशाला में लागत-प्रभावी, साध्य, reproducible, और पूर्णत: लागू होती है । इसके कार्यांवयन ऐसे रेडियोधर्मी अनुरेखकों के रूप में उन्नत उपकरण की आवश्यकता नहीं है15 या चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई)16, कि अन्य तरीकों के लिए आवश्यकताएँ हैं. इस लेख में, हम व्यापक रूप से BBB आकलन की बुनियादी तकनीकी प्रक्रियाओं का उपयोग कर EB extravasation के चूहे के मॉडल में कोरोनरी स्ट्रोक ।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं पशु अध्ययन (एथिकल आईडी नंबर: आईआर के संचालन के लिए चिकित्सा विज्ञान अनुसंधान परिषद के अर्दाबिल विश्वविद्यालय के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया । ARUMS । आरईसी. 1394.08) । इस दृश्यात्मक अध्ययन में, हम चराई संस्थान (तेहरान, ईरान) से प्राप्त वयस्क पुरुष Sprague-Dawley चूहों (300-350g) का इस्तेमाल किया.

1. संज्ञाहरण और Flowmetry

  1. 4% isoflurane का उपयोग कर संज्ञाहरण प्रेरित और सर्जरी की अवधि के लिए नाइट्रस ऑक्साइड (70% वी/वी) और ऑक्सीजन (30% वी/वी) के एक मिश्रण में isoflurane (1-1.5%) के साथ इसे बनाए रखने ।
  2. एक फ़ीड पर प्रवण मुद्रा में एक anaesthetized पशु-वापस नियंत्रित हीटिंग कंबल प्लेस और 37 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर शरीर के तापमान को बनाए रखने के एक गुदा जांच इस हीटिंग इकाई से जुड़े के माध्यम से ।
  3. सूखापन को रोकने के लिए दोनों आंखों पर नेत्र मरहम की एक छोटी राशि लागू करें ।
  4. बिजली कतरनी के साथ खोपड़ी के बाईं ओर सर्जिकल क्षेत्र दाढ़ी । त्वचा को संक्रमित करने के लिए एक धुंध पैड के साथ betadine समाधान का प्रयोग करें । एक बाँझ 70% इथेनॉल युक्त पैड के साथ इस क्षेत्र कुल्ला और तीन चक्रों17के लिए दोनों कदम दोहराएं ।
  5. analgesia के लिए, सर्जरी क्षेत्र में चमड़े के नीचे 0.5% bupivacaine के 0.2 मिलीलीटर इंजेक्शन17
  6. खोपड़ी पर 1 सेमी लंबी त्वचा चीरा (बाएं कान के आधार पर बाईं आंख के पार्श्व canthus से विस्तार) और खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए छोड़ दिया temporalis मांसपेशी काटना । फिर, एक छोटे से गड़गड़ाहट छेद 5 मिमी करने के लिए पार्श्व और 1 mm bregma18 के पीछे करने के लिए डॉपलर flowmeter पेंसिल जांच की नोक के स्थान को कम बनाने ।
  7. लापरवाह स्थिति के लिए प्रवण से चूहे की बारी है, और फिर क्षेत्रीय मस्तिष्क रक्त प्रवाह (rCBF) की निगरानी करने के लिए पहले ड्रिल्ड खोपड़ी ब्लाइंड छेद में लेजर पेंसिल जांच डाल दिया ।
  8. प्रत्येक जानवर की आधारभूत rCBF रिकॉर्ड करें और 100% के रूप में इस पर विचार करें । विशेष रूप से, मध्य मस्तिष्क धमनी रोड़ा (MCAO) जब भी 80% से अधिक की rCBF में कमी19,20का पता लगाया है शुरू कर दिया है ।

2. फोकल Cerebra Ischemia की प्रेरण

  1. गर्दन क्षेत्र दाढ़ी और betadine समाधान और 70% इथेनॉल के साथ त्वचा को संक्रमित । analgesia17के लिए सर्जरी साइट में 0.5% bupivacaine के 0.2 मिलीलीटर सुई ।
  2. बाईं आम मन्या धमनी (LCCA) का उपयोग करने के लिए गर्दन की ventral सतह में एक 2 सेमी लंबी शल्य चीरा बनाओ. बाहरी मन्या धमनी (ECA) और आंतरिक मन्या धमनी (ICA) के विभाजन का उपयोग करने के लिए पड़ोसी प्रावरणी और vagus तंत्रिका से LCCA को अलग.
  3. Ligate स्थाई रूप से या तो LCCA या ECA एक 5-0 रेशम सीवन रोजगार और ICA धमनी के स्तर को मुक्त काटना pterygopalatine ।
  4. लचर LCCA के चारों ओर 5-0 रेशम सीवन का एक टाई जगह है, और फिर अस्थाई रूप से एक संवहनी माइक्रो क्लिप के साथ ICA दबाना ।
  5. पहले से रखा ढीला टाई करने के लिए पहले LCCA पर एक छोटा सा चीरा बनाओ, और फिर ICA के चमकदार अंतरिक्ष में एक 4-0 सिलिकॉन लेपित नायलॉन सीवन डालने और LCCA के आसपास सीवन कस करने के लिए नायलॉन सीवन सुरक्षित और खून टपक रोकने ।
  6. ICA से संवहनी माइक्रो क्लिप निकालें । फिर, एक सिलिकॉन लेपित intraluminal रेशा अग्रिम जब तक rCBF में एक उल्लेखनीय गिरावट है कि एमसीए मूल के रोड़ा इंगित करता है अवलोकन । कोरोनरी अवधि (90 मिनट) के अंत में, intraluminal टांका21वापस लेने से reperfusion शुरू करते हैं ।

3. Jugular नस Cannulation और इवांस ब्लू (EB) इंजेक्शन

  1. गर्दन में एक 1 सेमी अनुदैर्ध्य चीरा midline के बाईं ओर करने के लिए और फिर कुंद काटना दूर सतही प्रावरणी छोड़ jugular नस (LGV) की बाहरी शाखा का उपयोग करने के लिए । फिर, स्थाई रूप से LGV के कपाल के अंत को 5-0 रेशमी सीवन के साथ ligate । ढीला नस के आसपास दो संबंधों को जगह है, और फिर अस्थाई रूप से एक संवहनी माइक्रो के साथ LGV के हृदय समाप्ति दबाना ।
  2. दो टांके के बीच LGV पर एक छोटा सा चीरा बनाओ, और फिर LGV के चमकदार अंतरिक्ष में heparinized सीरम भरा कैथेटर डालें और यह लगभग 10 मिमी अग्रिम. बाद में, कैथेटर को सुरक्षित और रक्तस्राव को रोकने के लिए नस के आसपास लिगेचर्स कस । नस टूट से बचने के लिए सीरम की छोटी मात्रा में सुई ।
  3. reperfusion अवधि की शुरुआत में, धीरे से एक 5 मिनट की अवधि में EB डाई (खारा में 2% EB समाधान के 1 मिलीलीटर/ इसके बाद, 0.5 मिलीलीटर सामान्य खारा के इंजेक्शन द्वारा प्रवेशनी को धो लें और नस12,22से इंजेक्शन प्रवेशनी को बाहर निकाल दें ।
  4. अंत में, गर्दन और सिर चीरा सीवन और 0.05 मिलीग्राम/kg buprenorphine intraperitoneally (आईपी) और इंजेक्शन को दोहराने के लिए reperfusion अवधि के दौरान हर 6-8 घंटे के बाद ऑपरेटिव analgesia17
  5. पूर्व गर्म खारा (आईपी) के 5 मिलीलीटर सुई वसूली पिंजरे में जलयोजन प्रदान करने के लिए17.
  6. एक विशेष वसूली पिंजरे तापमान और एयर कंडीशनिंग नियंत्रण और संज्ञाहरण से जानवर की वसूली पर नजर रखने के साथ सुसज्जित में पशु प्लेस ।

4. रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता का आकलन

  1. reperfusion के 24 ज के बाद, गहराई से सोडियम thiopental के साथ पशु anesthetize । फिर, उरोस्थि के नीचे एक छोटा सा छेद बनाकर वक्ष गुहा खोल ।
  2. सही atrium में एक छोटी सी खोलने बनाओ और पूर्व के 250 मिलीलीटर इंजेक्षन 0.9% खारा (37 ˚ सी) के माध्यम से 110 mmHg के दबाव में 15 मिनट के लिए छोड़ दिया निलय संचलन से दूर EB धोने के लिए जब तक atrium से सामांय खारा पडने बेरंग हो जाता है23
  3. तुरंत खोपड़ी से मस्तिष्क निकालें और यह मस्तिष्क मैट्रिक्स में जगह है । काटना घ्राण बल्ब और सेरिबैलम, और फिर एक साफ उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर, midline साथ छोड़ दिया (घावों) से मस्तिष्क का सही गोलार्द्ध अलग ।
  4. प्रत्येक गोलार्द्ध वजन और homogenize उन्हें अलग से 2.5 मिलीलीटर में फॉस्फेट बफर खारा, और trichloroacetic एसिड के 2.5 मिलीलीटर के साथ इस मिश्रण 2 मिनट के लिए एक भंवर मशीन का उपयोग कर (60%) ।
  5. १,३२२ x g पर 30 मिनट के लिए मस्तिष्क के नमूनों को केंद्रापसारक और नमूनों को 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में ठंडा करने की अनुमति दें ।
  6. 610 एनएम23पर एक spectrophotometer द्वारा EB अवशोषक का अनुमान लगाने के लिए supernatants का प्रयोग करें ।
  7. एक मानक वक्र और मस्तिष्क ऊतक के µ g/जी के रूप में व्यक्त परिणामों के खिलाफ EB सांद्रता की गणना ।

5. EB मानक वक्र का उत्पादन

  1. EB की 10 मिलीलीटर में 1-10 µ जी की सांद्रता के साथ EB का नमूना समाधान तैयार करें 5
  2. एक spectrophotometer का उपयोग कर 610 एनएम में प्रत्येक नमूने के अवशोषक मूल्यों को मापने ।
  3. किसी स्प्रेडशीट का उपयोग करके स्कैटर चार्ट बनाएं और X अक्ष पर EB सांद्रता और Y अक्ष (चित्र 1) पर अवशोषक मानों को प्रस्तुत करें ।
  4. अपने समीकरण के साथ वक्र के लिए रेखीय रुझान-पंक्ति निर्धारित करें । फिर, यह नमूनों की EB एकाग्रता प्राप्त करने के लिए उपयोग करें ।
  5. मस्तिष्क ऊतक वजन के µ g/जी के रूप में EB extravasation के अंतिम परिणाम की रिपोर्ट ।

6. अन्तर्वासना ऑपरेशन

  1. अन्तर्वासना में चूहों के साथ एक ही शल्य प्रक्रिया संचालित समूह (गर्दन क्षेत्र और EB इंजेक्शन में एक चीरा बनाने सहित), लेकिन MCAO बाहर प्रदर्शन.

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Representative Results

EB के स्तर में कोई उल्लेखनीय अंतर नहीं था बनाम अन्तर्वासना के बाएँ गोलार्द्ध में संचालित चूहों (1.06 ± 0.1 µ g/g और 1.1 ± ०.०९ µ g/g, क्रमशः) । के रूप में आंकड़े 2a-bमें दिखाया गया है, क्षणिक ischemia की प्रेरण (90 मिनट ischemia/24 एच reperfusion) EB के स्तर में एक महत्वपूर्ण अंतर (१०.४१ ± ०.८४ µ जी/जी, पी < 0.001) कोरोनरी चूहों के बाएं गोलार्द्ध में, के रूप में संबंधित की तुलना में -शम में संचालित चूहों में गोलार्द्ध । सामूहिक रूप से, इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि सामान्य परिस्थितियों में, EB आसानी से मस्तिष्क पैरेन्काइमा में BBB को पार नहीं कर सकते हैं और सेरेब्रल कोरोनरी अपमान EB के एक बढ़ाया पारगम्यता के माध्यम से BBB के extravasation प्रेरित (आंकड़े 2a और बी#).

Figure 1
चित्र 1 : मानक वक्र अवशोषित मूल्यों से EB एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : कोरोनरी स्ट्रोक के 24 घंटे बाद EB extravasation द्वारा BBB व्यवधान का आकलन । अन्तर्वासना संचालित और कोरोनरी जानवरों () में दिमाग की तस्वीर । मस्तिष्क के ऊतकों (नीला रंग) में EB extravasation की तीव्रता क्षतिग्रस्त गोलार्द्ध में BBB व्यवधान की सीमा से उत्पन्न होती है । शम-संचालित और कोरोनरी जंतुओं (B) (n = 6, *p< 0.001 में बाएं गोलार्द्ध की तुलना में बाएं गोलार्ध (घावों) और EB में मस्तिष्क के दाएं गोलार्द्धों से तैयार नमूनों में एकाग्रता, p< 0.001 की तुलना में एक ही समूह के ipsilateral गोलार्द्ध) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रकार अब तक, इस तरह के autoradiography और रेडियोधर्मी अनुरेखकों का पता लगाने के रूप में विभिन्न तरीकों24,25, इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी26,27, और EB extravasation तकनीक20, 23 रक्त मस्तिष्क बाधा क्षति का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । EB डाई दृढ़ता से सीरम एल्ब्युमिन को बाइंड करने में सक्षम है और संवहनी रिसाव का पता लगाने के लिए एक अनुरेखक के रूप में प्रयोग किया जाता है और BBB टूटने11,28,29बढ़ाता है । के रूप में एक उच्च स्वीकार किए जाते है और विश्वसनीय विधि, EB extravasation तकनीक BBB कि कोरोनरी स्ट्रोक सहित विभिंन मस्तिष्क चोटों से प्रभावित है की अखंडता पर एक सीधा आकलन प्रदान करता है ।

BBB के vivo आकलन में शोधकर्ताओं ने vasogenic मस्तिष्क शोफ प्रेरित ischemia के संभावित pathophysiological तंत्र का अध्ययन करने के लिए और नए चिकित्सीय हस्तक्षेपों को खोजने की अनुमति देता है । इस मॉडल विशेष सुविधाओं की आवश्यकता नहीं है और प्रयोगों में एक उच्च सफलता दर के साथ विश्वसनीय परिणाम (80% से अधिक)13,20उत्पादन कर सकते हैं । मस्तिष्क के ऊतकों के लिए सीधी पहुँच के साथ, इस मॉडल BBB अखंडता का अत्यधिक सटीक आकलन सक्षम बनाता है, लेकिन लंबी अवधि के अध्ययन के लिए प्रतिबंधित है.

कोरोनरी स्ट्रोक की वजह से BBB में रोग परिवर्तन तीन चरणों में विकसित: एक्यूट (घंटे के भीतर), उप-तीव्र (घंटे दिनों के लिए), और जीर्ण (महीनों के लिए दिन)30,31. जाहिर है, जल्दी चिकित्सकीय हस्तक्षेप गंभीर रोग चरण में मूल्यवान सुरक्षात्मक प्रभाव का उत्पादन । EB खुराक और इंजेक्शन के समय बिंदु दो कोरोनर अपमान के बाद BBB के गतिशील प्रकृति के कारण विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों हैं । इसलिए, EB डाई के इंजेक्शन धीरे एक नस उचित खुराक का उपयोग प्रवेशनी के माध्यम से (1 मिलीग्राम/reperfusion अवधि की शुरुआत के बाद 2% EB समाधान) एक महत्वपूर्ण कारक है और स्ट्रोक के प्रारंभिक दौर में pathophysiological परिवर्तन के अध्ययन की अनुमति देता है .

कोरोनरी स्ट्रोक का अध्ययन करने के लिए कई प्रायोगिक तरीके शुरू किए गए हैं । इस प्रयोगात्मक मॉडल में, हम मानव स्ट्रोक21,32के समान परिस्थितियों बनाता है कि intraluminal रेशा विधि के साथ MCAO का इस्तेमाल किया । इस तकनीक को सरल और विश्वसनीय है; हालांकि, इसके निष्पादन को ध्यान में कुछ तकनीकी अंक लेने के लिए और तकनीक के प्रदर्शन को बढ़ाने और इसकी सटीकता सुनिश्चित करने की जरूरत है । शरीर का तापमान शल्य चिकित्सा के दौरान शारीरिक सीमा के भीतर रखा जाना चाहिए, जबकि रक्तचाप और रक्त गैसों33,34,35निगरानी की जानी चाहिए । एक लेजर डॉपलर flowmeter के साथ rCBF की लगातार रिकॉर्डिंग और एक उपयुक्त तैयार सिलिकॉन लेपित रेशा का उपयोग न केवल MCAO सफलता की दर में वृद्धि कर सकते हैं, लेकिन यह भी मृत्यु दर को कम.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक चिकित्सा विज्ञान के अर्दाबिल विश्वविद्यालय के अनुसंधान के लिए वाइस चांसलर के लिए आभारी है (अर्दाबिल, ईरान) वित्तीय सहायता के लिए (अनुदान नहीं: ९६०७) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Piramal AWN 34041100 20 - 25 °C
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) Molekula 31216368 4 years
Sprague–Dawley rats  Pasture Institute (Tehran, Iran) 300-350g
Evans Blue  Sigma-Aldrich  314-13-6
Trichloroacetic acid  Sigma-Aldrich  76-03-9 2 years
Bupivacaine HCl (0.5%) Delpharm Tours below  25 °C
Bupernorphine Exir (Iran)
Sodium Carbonate Sigma-Aldrich  497-19-8
Sodium chloride  Sigma-Aldrich  7647-14-5
Di- Sodium hydrogen phosphate EMD Millipore  231-448-7
Potassium chloride Sigma-Aldrich   7447-40-7
Ethanol  Sigma-Aldrich  64-17-5
silicone(Xantopren) Heraeus EN ISO 4823
Activator universal plus Heraeus 66037445
Micro-Dissecting forceps Stoelting 52100-41
Spring Scisors Stoelting 52130-00
Operating  Scissors Roboz 52140-70
Brain matrix  Stoelting 51390
Anesthesia Machine for Small Animals |  Kent Scientific SS-01
Power Lab system AD Instruments ML880
Laser Doppler flowmeter AD Instruments ML191
Heating feed back system Harvard Appratus 72-7560
Vascular micro clamp FineScience Tools 18055-03
Silk 5-0 suture thread Ethicon 682G
Ethilon 4-0 suture thread  Ethicon EH6740G

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References

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