Образования ковалентной ДНК аддукты ферментативно активированные канцерогенов и наркотиков в пробирке и их решимость по 32P-postlabeling

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Оценка потенции окружающей среды химических веществ и лекарств, чтобы быть энзиматического bioactivated для промежуточных генерации ковалентных ДНК аддукты, является важной области в развитии рака и его лечении. Описаны методы для активации соединения к форме, которую аддукты ДНК, а также методов их обнаружения и количественного определения.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ковалентный ДНК аддукты формируется химических веществ или препаратов с канцерогенными потенции оцениваются как один из наиболее важных факторов в этапе инициирования канцерогенных процессов. Теперь этот ковалентных привязки, который считается причиной tumorigenesis, оценивается как Центральная догма химического канцерогенеза. Здесь описаны методы использования реакции, катализируемой цитохрома Р450 и дополнительные биотрансформации ферменты расследовать потенции химических веществ или препаратов для их активации метаболитов, образуя эти ДНК аддукты. Процедуры представлены описания изоляции сотовой фракций, обладающие ферментов биотрансформации (микросомальной и цитозольной образцы с цитохромов P450 или других ферментов биотрансформации, т.е., пероксидазы, NADPH: цитохрома Р450 Оксидоредуктазы, NAD (P) H:quinone Оксидоредуктазы или ксантиноксидаза). Кроме того, описаны методы который может использоваться для активации метаболических анализируемого химических веществ в этих ферментов, а также для изоляции ДНК. Кроме того соответствующие методы обнаружения и количественного химического вещества/препарата производные ДНК аддукты, то есть, различные модификации метода P-postlabeling 32и занятости радиоактивных обозначенного анализа химических веществ, являются показано в деталях.

Introduction

Метаболизм ксенобиотиков (окружающей среды химических веществ или лекарств) происходит в два этапа1. Фазы I и II цель оказать более гидрофильные первоначально гидрофобные (не растворимые в воде) соединений (водорастворимые), таким образом делая их легко excretable через моча, фекалии или пота. Этап I (функционализация) реакции включают окисления, сокращение, и гидроксилирования катализируемых ферментами, например цитохрома P450s (P450s, CYPs), пероксидазы (т.е., циклооксигеназы, кокс), reductases (AKRs), Альдо Кето и микросомальной флавинсодержащих монооксигеназ (FMOs). Этап I также включает снижение реакции, при посредничестве различных reductases т.е. микросомальной NADPH: цитохрома P450 редуктаза (POR) и H:quinone Оксидоредуктазы цитозольной NAD (P) (NQO1), ксантиноксидаза (XO) и альдегид оксидазы (AO)1 . На втором этапе (спряжение), функциональные группы, которые были приложены в фазе я используются для конъюгата малых полярных молекул для дальнейшего увеличения полярности. Примеры ферментов, считается, что участие в реакции фазы II включают sulfotransferases (результаты), N, O- acetyltransferases (NAT), methyltransferases как катехол -О- метилтрансфераза (КОМТ), глутатион S- трансферазы (GSTs) и уридина дифосфат glucuronosyltransferases (UGTs)1. Ферментов в фазе I или II является классификация, однако, не жесткой, и некоторые ферменты вероятно могут быть сгруппированы в любой категории.

Р450 ферментов (EC 1.14.14.1) являются гема, содержащих белков, присутствующих в различных организмах, которые участвуют в биотрансформацию многих химических веществ, катализирующих преобразование3,4. Энзимы Р450 катализировать гидроксилирования многих субстратов, с реакцией, где один атом непосдедственно вводится в молекуле ксенобиотиков, в то время как второй атом кислорода уменьшается до формы воды по реакции, которая требует двух электронов [уравнение (1 3,)]4:

RH + O2 + НАДФН + H+ → Ро + H2O + NADP+ (1)

Энзимы Р450 локализуется в мембраны эндоплазматического ретикулума mammalian клеток (микросомальной системы P450) являются членами multienzyme монооксигеназ системы, которая также содержит NADPH: цитохрома P450 редуктаза (POR) и цитохром b5 , субстрат фермента называется как NADH: цитохромы b5 редуктазы. Общепринятые теории гипотез, что доноров двух электронов, необходимые для P450 является NADPH/POR системой. Тем не менее цитохромы b5 может также выступать в качестве донора электронов для P450, а именно в качестве донора электрона, уменьшение P450 во время второго сокращения цикла своей реакции, где он действует совместно с НАДН: цитохромы b5 редуктазы2,3,4.

Млекопитающие используют различные энзимы Р450 (например, энзимы семей 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 и 27) для синтеза ценных эндогенных соединений, такие как стероиды и использовать их для катаболизма натуральных продуктов2,3 . Другие ферменты CYP млекопитающих, таких как человека CYP1A2, 2 c 9, 2 c 19, 2D 6 и 3A4, метаболизму экзогенных химических веществ, которые используются как наркотики. 5 , 6 наиболее важных ферментов, катализирующих метаболизм препаратов являются CYPs 3A подсемейство, особенно CYP3A4. Преобразования ксенобиотиков, такие как канцерогены pro и pro токсикантов, являются опосредовано человека CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2Е1 и 3A42,5. Большинство из этих CYPs присутствуют в печени (за исключением CYP1A1 и 1B1). Тем не менее CYPs также выражаются в нескольких внепеченочных органах. Такая P450s может иметь большое значение, преимущественно когда участие они активация метаболизма химических веществ (лекарственные препараты) для реактивной интермедиатов в эти органы7. Различные P450s вызванных несколько соединений, которые являются их субстратов, хотя это не обязательно так.

Многие энзимы Р450 играют роль в токсичности химических (наркотиков). Они могут не только превратить их метаболитов детоксикации ксенобиотиков, но также активировать их для реактивных видов, которые изменить эндогенные макромолекул, которые дополнительно демонстрируют различные биологические свойства, как правило, вызывает их токсичности. ДНК, липидов и белков может быть цели для их модификации реактивного электрофилами и радикалы, образующиеся при активации химических веществ. В случае ДНК урегулировании нескольких ответов важно генов и их механизмы уже известны2,3,4,5.

Изменения в ДНК может привести к снижению роста ячейки, и считается, что это явление является преобладающим фактором, ведущим к разработке канцерогенных процессов. Поколения ковалентных ДНК аддуктов с химическими веществами, имеющие канцерогенных потенции оценивается как один из наиболее важных шагов в фазе начала канцерогенных процессов8,9,10,11. Было продемонстрировано, что отношения между формирования ДНК аддукты и tumorigenesis происходят, в то время как уменьшение количества ДНК аддукты отвечает за химиопрофилактики8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. образование канцерогенов, наркотиков полученных ДНК аддукты зависит от индивидуальных оснований ДНК и зависит от последовательности этих оснований в ДНК. Ремонт ДНК аддукты зависит от их расположения (на strand ДНК транскрибируется или не транскрибируется) и виды модифицированных нуклеотидных последовательностей8,11,12,15, 16.

В этой статье, мы описываем процедуры с использованием ферментов катализированное преобразования химических веществ (лекарственные препараты), расследовать их потенции активироваться в метаболиты, которые изменены ДНК (генерации ДНК аддукты). Для ковалентной ДНК привязки, тест соединения обычно должен быть активирован либо окислительная или восстановительной реакции, в зависимости от отдельных препаратов. Окислительная или восстановительной активация испытания химических веществ при посредничестве P450-зависимых ферментативные системы, присутствующих в микросомальной фракции субцеллюлярные или путем сокращения с reductases представить как в микросом (POR, НАДН: цитохромы b5 редуктазы, энзимы Р450) и в сотовой цитозольной субцеллюлярные фракций (NQO1, глутатионпероксидазы, XO, AO). Реактивных метаболитов затем связываются с ДНК ДНК формируя аддукты. Потому что реакций окислительного и восстановительной важны для того активировать несколько препаратов к этим реактивного видов, экспериментальной процедуры, используя окисления/снижение ферментативной системы описаны. Кроме того, соответствующие методы, способные обнаружения и количественного определения этих ДНК аддукты подробно описаны.

Два независимых процедур для определения ли испытания химического, активации ферментных систем, привязан к ДНК, рекомендуется: 32P-postlabeling техники и использования радиоактивных меченых соединений (например., 3Ч или 14 C). Для первого пилота, скрининг 32P-postlabeling assay рекомендуется. Определение содержания ДНК в растворах, точно оценены, должны предшествовать обоих методов.

32P-postlabeling техника использует ферментативного гидролиза ДНК, изменена нерадиоактивные химических веществ (канцерогенов/наркотиков) 3´-phosphodeoxynucleosides, дополнительные фосфорилирование с радиоактивного фосфора (32P) на 5´- OH позиции и разделение химико deoxynucleotide аддукты от нормальных (неизмененным) deoxynucleotides хроматографии17 (рис. 1). ДНК, изменена химический состав гидролизованный смесью эндонуклеазы, Микрококковая Нуклеаза и exonuclease, известный как селезенке фосфодиэстеразы. Смесь гидролизованный ДНК, содержащие оба нормальный (неизмененном) и изменения deoxyribonucleoside, который реагирует с [γ -32P] АТФ в присутствии перевозчика (нерадиоактивного) СПС и T4-полинуклеотид киназы при pH 9.5 в форме 5´- 3´-monophosphates 32P-меченых 3´, 5´-bisphosphates («стандарт» процедура на рис. 1). Используется щелочной рН способен минимизировать активность фермента протеинкиназы T4-полинуклеотид для dephosphorylate deoxyribonucleoside 3´-monophosphates на позиции 3´. Разделение и резолюции 32P-меченых аддуктов с надписью deoxynucleotides, которые не изменены химическими веществами осуществляется разнонаправленный Анионообменная тонким слоем хроматографии (ТСХ) на полиэтиленимина (PEI) целлюлозы (Рисунок 2 ). В первой и второй элюции шаги (в направлении D1 и D2) помечены нормальной (неизмененным) deoxynucleotides, а также [32P] фосфат этого eluted от начала пластину TLC-ПЭЙ целлюлозы с использованием водных растворов электролитов на короткий кусок хроматографического бумага применяется на верхней пластине TLC, тогда как deoxynucleotides, содержащие связанные химических веществ, проявляющие гидрофобные свойства (канцероген/наркотиков аддукты) поддерживаются в начале Пей целлюлозные плиты дополнительно решить с несколько различных растворителей систем в D3 и D4 направлениях (рис. 2). Локализация аддукты осуществляется с помощью авторадиографии расширение экрана; раздельный аддукты определяются как темные пятна узнаваемым на рентгеновских пленок. Области пятен иссечена от плиты и используется для количественного определения радиоактивности ЖС или Cerenkov подсчета. Хранения люминофора, изображения метод, который был адаптирован к сопоставить и количественно определить ДНК аддукты на хроматограммы обнаружены 32P-postlabeling пробирного теперь также используется. 18 мгновенного Imager машина часто используются такие обнаружения и количественного определения ДНК аддукты. Этот метод обеспечивает более чем 10 - раз выше чувствительность обнаружения 32P, чем методика экрана Улучшено авторадиографии19.

Количество ДНК аддукты определяются как значения относительной аддукт маркировки (RAL), рассчитывается с помощью уравнения (2) следующим образом:

CPM. в аддукт deoxynucleotides
RAL =---(2)
Удельная активность 32P-АТФ (в cpm. / пмоль) x pmol deoxynucleotides

RALs значений соотношение количество ставок углубил deoxynucleotides над количество ставок общей [углубил и нормальной (неизмененным) deoxynucleotides] deoxynucleotides20,21. Однако, этот расчет основан на равных маркировки эффективности аддукты и нормальной deoxynucleotides22. Классическая процедура («стандарт») 32P-postlabeling техника подходит для различных ДНК аддукты (громоздкие и/или не громоздкие аддукты), ее чувствительность, однако, не является удовлетворительным для обнаружения аддукты в малых количествах в ДНК. С помощью этой процедуры, количество аддукт в 10 deoxynucleotides7 немодифицированные ДНК (0,3 фмоль adduct/мкг ДНК) является обнаруживаемой.

Повысить чувствительность метода были использованы различные модификации этой классической 32P-postlabeling процедура. До 10-100 раз выше чувствительность определения аддукты 32P-маркировки был достигнут с помощью предельных уровней [γ -32P] АТФ (усиление процедуры). 23 , 24 дальнейшая процедура условии, что увеличение чувствительности метода P-postlabeling 32использует инкубации переваривается ДНК-содержащие аддуктов с нуклеиназы P1 (от Penicillium обыкновенный)21 (рис. 1). Этот фермент предпочитает dephosphorylate неизмененном deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, тогда как deoxynucleotides с связанных химикатов (углубил нуклеотидов) являются по сути не субстратов этого фермента. Таким образом, dephosphorylated deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (например, диоксирибонуклеозиды) не phosphorylated, T4-полинуклеотид киназы, фосфат [32P] от γ -32P] СПС. Однако, некоторые из нуклеотидов, где химические вещества связаны (углубил deoxynucleotides), такие, как arylamine аддукты заменен на C8 deoxyguanosine, может bedephosphorylated этого фермента. В отличие от этого, большинство других аддукты (например, аддукты в N2 deoxyguanosine) не dephosphorylated от нуклеиназы P1. Эта модификация 32P-postlabeling делает этот метод значительно более чувствительны, повышение его чувствительности более чем трех порядков. Кроме того, эта версия 32P-postlabeling предоставляет метод, где выше количество ДНК (5-10 мкг) и избыток свободных перевозчика [γ - 32P] СПС могут быть использованы.

Другой метод, чтобы обогатить аддукты, описываемого Гупта25, использует физико-химических свойств громоздкие deoxynucleotide аддукты, которые могут быть извлечены в n-бутанол присутствии этап передачи агента tetrabutylammonium хлорид (TBA) (рис. 1) перед [32P] фосфат маркировки, тогда как неизмененное deoxynucleotides плохо извлекаемые этой органического растворителя. Однако, менее гидрофобные аддукты, состоящий на пример deoxynucleotides изменен с неароматических громоздкие постановление или небольших алкил остатков, не извлекаются эффективно с n-бутанол. Следовательно они являются по существу обнаружить, когда анализируются этой модификации 32P-postlabeling метод.

Как упоминалось ранее версии 32P-postlabeling увеличение чувствительности и количественного определения ДНК аддукты чрезвычайно (до трех порядков), будучи в состоянии обнаружить одно аддукт на нормальных 1010 9, нуклеотидов (0,3 - 3 amol в мкг ДНК). Эти два метода, рекомендуется для тестирования химических веществ для их эффективность ковалентно связываются с ДНК, и поэтому они описаны в этой работе в деталях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с положениями для ухода и использования лабораторных животных (311/1997, Министерство сельского хозяйства, Чешская Республика), которое в соответствии с Хельсинкской декларации.

1. изоляция печеночная микросомальной и цитозольной фракции

  1. Подготовка печени субцеллюлярные фракций (микросом богаты Р450 ферментов или cytosols богаты reductases или растворимые пероксидазы) от крыс путем простой дифференциального центрифугирования (105 000 x g).
    Примечание: Гранулы и супернатант принимаются как микросом и cytosols, соответственно.
    1. Дважды промыть пробы печени (1-10 g) 50 мм трис-HCl буфере, рН 7,4, содержащие 150 мм KCl (буферу 1) (10-раз более высоких объемах, чем вес ткани, т.е. 10-100 мл) и нарезать на мелкие кусочки ткани (из вокруг размер 2 x 2 мм).
    2. Однородный ткани в присутствии этого буфера (> 3 объем/вес мл/г) в гомогенизатор на 4 ° C за 5 мин и удалить остаточные-гомогенизированные куски ткани с помощью фильтрации фильтра бумаги. Центрифуга огневки на 600 x g 10 мин при температуре 4 ° C и передать другой трубки центрифугирования супернатант.
    3. Повторно гомогенизировать Пелле в буфере 1 (1 мл на 1 г ткани), повторите шаг 1.1.3. и отбросить гранулы. Центрифуга для пула supernatants на 15000 x g 20 мин при 4 ° C. Супернатант передать другой трубки центрифугирования.
    4. Центрифуга супернатант в 105000 x g 60 мин при 4 ° C. Собирать супернатант (цитозоль) и хранить его в аликвоты (1-10 мл)-80 ° c. Характеризуют цитозоль на сумму белка, с помощью метода, описанного в Брэдфорд26.
    5. Вновь приостановить гранулы в 100 мм натрия фосфат буфера, рН 7,4 (> 2 объем/вес мл/г), центрифуги в 105000 x g 60 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант. Повторно гомогенизировать Пелле (микросом) 50 мм трис-HCl буфере, рН 7,4, содержащие 150 мм KCl и 20% глицерина (< 5 объем/вес мл/г) в гомогенизатор на 4 ° C. Хранить микросом в 0,5 - 1 мл аликвоты-80 ° c. Характеризуют микросом за содержание белков, с помощью метода, описанного в Брэдфорд26.
    6. Определите концентрацию цитохрома Р450 в микросом.
      Примечание: Концентрация ферментов P450 микросом измеряется как описано в Omura и Сато27, определение поглощения комплекса снижение P450 с окиси углерода (CO). Окись углерода токсичные соединения и быть обработаны с осторожностью и в капюшоне.

2. инкубаций испытания химических веществ (канцерогенов/препараты) с ДНК в присутствии ферментных систем

  1. Инкубация испытания химических веществ (канцерогенов/препараты) с ДНК присутствии окислительных ферментных систем, содержащих цитохромов Р450
    1. Подготовьте инкубации смеси, содержащие, в окончательный объем 0,75 мл при температуре 4 ° C, следующих соединений и ферментных систем.
      1. Смешать 100 мм фосфатного буфера, рН 7,4, (0,375 мл) с 10 мм NADPH или NADPH-генерации системы (10 мм MgCl210 мм D-глюкоза-6-фосфат, 10 мм NADP+, 1 ед/мл D-глюкоза-6-фосфат дегидрогеназы) (75 мкл).
      2. Добавить в эту смесь микросом или transfected чисто рекомбинантных P450 в Supersomes, которые являются микросом, изолированных от насекомых клеток с бакуловирусы конструкции, содержащие cDNA рекомбинантные энзимы Р450, 50 пмоль Р450 ферментов в 50 мкл микросомальной или supersomal подготовка - печеночная микросомальной фракции изолированных в лаборатории или из коммерческих источников.
      3. Добавить 1 мг теленка тимуса ДНК (0,3 мл Стоковый раствор - 3,3 мг/мл в дистиллированной воде) и встряхните в шейкере Вортекс для 5 s.
      4. Наконец, добавьте 7.5 мкл 0,1 мм тест ellipticine препарата растворяют в ДМСО и 42,5 мкл дистиллированной воды, чтобы достичь объема смеси инкубации 0,75 мл. Использование химических веществ помечены 3H или 14C или немаркированных химических веществ, в зависимости от процедуры для обнаружения ДНК аддукты.
      5. Встряхните в шейкере Вортекс для 5 s. инкубировать в открытые трубы при 37 ° C за 30-60 мин.
      6. Также подготовьте два управления инкубаций аналогично, но (i) без активации системы (микросомальной образцы) или (ii) с ним, но без составные теста.
  2. Инкубаций испытания химических веществ (канцерогенов/препараты) с ДНК присутствии восстановительной ферментных систем
    1. Подготовьте инкубации смеси, содержащие, в окончательный объем 0,75 мл при температуре 4 ° C, следующих соединений и ферментных систем.
      1. На 4 ° C, смешать 100 мм трис-HCl буфере, рН 7,4, содержащие 0,2% Tween-20, (0,375 мл), 10 мм раствор кофактора NQO1 редуктивной фермента (NADPH) (75 мкл), цитозольной фракции (печеночная цитозольной фракции - изолированных в лабораторных условиях или в случае использования цитозолевая фракции, изолированные от индивидуальных человеческих доноров, когда они были получены из коммерческих источников, содержа протеин 1 мг (50 мкл)).
      2. Добавить 1 мг теленка тимуса ДНК (0.2 мл Стоковый раствор - 3,3 мг/мл дистиллированной воды) и встряхните в шейкере 5 s.
      3. Наконец добавьте 7,5 мкл 0,1 мм испытания химического (растворяют в дистиллированной воды, метанола, этанола или ДМСО, в зависимости от растворимости соединения) и 42,5 мкл дистиллированной воды для достижения объемом 0,75 мл смеси в инкубации. Использование химических веществ помечены 3H или 14C или немаркированных химических веществ, в зависимости от процедуры для обнаружения ДНК аддукты (см. ниже).
      4. Очистите реакционную смесь аргоном за 1 мин встряхните в шейкере для 5 s. инкубировать в закрытых трубах при 37 ° C за 30-60 мин.
      5. Также подготовьте два управления инкубаций аналогично, но (i) без активации системы (цитозольной фракции) или (ii) с ним, но без тестирования химических веществ.
  3. Извлечение инкубации смесей с органических растворителей для удаления избытка испытания химических веществ
    1. Смешайте смесь инкубации в пробирке с крышкой с такой же объем этилацетат (или диэтиловом эфире или гексана) путем добавления этих растворителей. Встряхните содержимое трубки на шейкер до формы эмульсии.
    2. Спина (3 мин) при 1600 x g в центрифуге при комнатной температуре. Если органических и водной фаз не должным образом разделены, спина еще раз за более длительный период или на более высокой скорости центрифугирования.
    3. Удаление верхних, органические фазы, собирая с пипеткой. Если небольшие объемы (< 400 мкл), использовать, использовать автоматические пипетки, установлены с подходящей наконечником. Отбросить это органические фазы.
    4. Повторите шаги 2.3.1., 2.3.2. и 2.3.3. Удаление остаточных органических растворителей потоком газа азота (по крайней мере 5-10 мин удаления необходимы).
  4. Изоляция ДНК от инкубаций
    1. Экстракции ДНК из растворов с фенол/хлороформе и осадков с этанолом
      1. Ликвидировать белки для изолировать дна от инкубации смесей путем извлечения белков из растворов ДНК с фенолом, фенол/хлороформ (1:1) и хлороформа по процедуре показано ниже.
      2. Объединить смесь инкубации с тем же количеством фенола или фенол/хлороформ (1:1) в сокола или Eppendorf трубки с крышкой. Перемешайте смесь до формы эмульсии.
      3. Спина (3 мин) при 1600 x g в центрифуге при комнатной температуре. Если должным образом не разделены органических и водной фаз, спина еще раз на более длительный срок или на более высокой скорости центрифугирования.
      4. Передать новые полипропиленовые трубы верхней водной фазы с пипеткой. Если небольшие объемы (< 400 мкл), используется, использовать автоматические пипетки, установлены с подходящей наконечником. Удаление интерфейса белка вместе с органические фазы.
      5. Объединить верхней водной фазы с тем же количеством смесь фенола и хлороформа (1:1). Воспроизвести шаги 2.4.1.2. -2.4.1.4.
      6. Совместить верхние водной фазы с то же количество метилхлороформа и повторите шаги 2.4.1.2. -2.4.1.4. Восстановление ДНК, осадков с 2 тома холодная (-20 ° C) этанола. Определите объем раствора ДНК.
      7. Адаптировать концентрации катионов моновалентной добавлением хлорида натрия 5 М в финал концентрации 0,1 м. Размешивать энергично. Совместить с 2 тома холодная (-20 ° C) этанола и смешайте правильно. Охладите до-20° C.
      8. Хранить при температуре-20 ° C до тех пор, пока осаждается ДНК. Когда во время инкубаций фрагментирована ДНК (например., путем формирования радикалов кислорода во время ферментативной активации реакции) или во время процедуры изоляции на размер ДНК, это небольшой (< 1 КБ) или когда ДНК присутствует в небольших количествах (< 0,1 мг / Мл), время охлаждения должно быть увеличено и температура снизилась до-70 ° C.
      9. Спина (10 мин) при 1600 x g при 0 ° C в центрифуге. Если ДНК в виде небольших фрагментов или низких концентрациях, спина еще раз для более длительного периода (30 мин). Выбросите супернатант.
      10. Чтобы удалить растворенных веществ (или остаточные следы химических испытаний), который может присутствовать в осажденный ДНК, промойте ДНК на 70% спирте и диэтиловом эфире. Мыть осаждают ДНК с холодной (-20 ° C) на 70% спирте. Спина (10 мин) при 1600 x g при 0 ° C в центрифуге. Выбросите супернатант.
      11. Повторите шаг 2.4.1.10. Мыть осаждают ДНК с холодной (-20 ° C) на 70% спирте. Спина (10 мин) при 1600 x g при 0 ° C в центрифуге. Выбросите супернатант.
      12. Повторите шаг 2.4.1.10. Положите трубку в вертикальной состояние на чистую фильтровальную бумагу, чтобы удалить остаточные супернатант. Помыть лепешка ДНК, добавив 1 мл диэтиловом эфире отказаться от потенциальных остатков химических веществ из изолированной ДНК тест. Спина (10 мин) при 1600 x g при 0 ° C в центрифуге. Выбросите супернатант.
      13. Растворяют гранулы ДНК в соответствующий объем (обычно в 100-400 мкл достичь концентрации ДНК 0,5 - 1 мкг/мкл) дистиллированной воды (или хлорида натрия цитрат натрия и 1,5 мм 0.15 мм). Решение ДНК может стоять на ночь при 4 ° C, или можно нагревать до 37 ° C в течение 10-30 мин для увеличения, растворяя ДНК.
      14. До хранения разделите ДНК на аликвоты небольшой (10-20 мкл), потому что повторил замораживания и оттаивания растворов ДНК может привести к снижению аддукт концентрации. Храните при температуре-80 ° C или холоднее.
        Примечание: Спектрофотометрические определение ДНК: простой и точный метод, который широко используется для измерения количество ДНК в подготовке, если образец чисто (т.е., без значительного количества таких загрязнителей, как белка, фенол или другие Нуклеиновые кислоты), является спектрофотометрические измерения количества ДНК УФ излучение поглощается баз (см. описанные ранее)28.
  5. Процедуры для обнаружения ДНК аддукт формирования
    1. 32 P-postlabeling пробы
      Примечание: ДНК гидролиз использует гидролизат, подготовленный на этом этапе для анализа аддукты (2.5.1.), а также от нормальной (неизмененным) deoxynucleotides (2.5.7.).
      1. Растворите в воде в концентрации ~ 450 единиц (U) Микрококковая Нуклеаза (MN) / мл. Dialyze против дистиллированной воды и приспособиться к 300 ед/мл. Dialyze селезенки фосфодиэстеразы (СДПГ) решение и приспособиться к 4 ед/мл.
      2. Mix MN и СПД для окончательного концентрации 150 му/мкл MN и 2,5 му/мкл СПД (MN/СПД раствор). Принять решение ДНК, содержащие 12,5 мкг и испаряются сухости в испаритель. Растворите в 6,5 мкл дистиллированной воды.
      3. Добавить 5.0 мкл раствора MN/СПД (конечная концентрация марганца 60 му/мкл, конечная концентрация СПД является 1 му/мкл) и 1.0 мкл буфера пищеварения (конечная концентрация натрия сукцината составляет 20 мм, конечная концентрация CaCl2 – 8 мм). Окончательный объем смеси составляет 12,5 мкл. смеси и позволяют реакций за 3 ч при 37 ° C.
      4. Удаление 2,5 мкл (передача в другую трубу) для дальнейшего разбавления и анализа неизмененном deoxynucleotides (2.5.7.)
    2. Нуклеаза P1 обогащения процедура
      1. Для оставшихся 10,0 мкл гидролизат, добавьте 0,65 буфера ацетат натрия мкл (конечная концентрация, 40 мм), 0,65 решение ZnCl2 мкл (конечная концентрация 0,1 мм), 1,25 мкл NP1 решение (конечная концентрация, 0,385 мкг/мкл) и 0,45 мкл дистиллированной воды. Окончательный объем смеси составляет 13 мкл.
      2. Разрешить смесь реагировать на 30 минут при 37 ° C и конце реакции с добавлением 3 мкл раствора трис.
    3. n-бутанол обогащения процедура
      1. Для остальных 10,0 мкл ДНК гидролизат 215 мкл 11,6 мм аммония Формиат раствор, рН 3,5 и 25 мкл 10 мм TBA хлорида раствор. Извлечение с 250 мкл n-Бутанол (насыщена водой), энергичные смешивая. Спина (3 мин) при 1600 x g отдельные слои, и снимать верхние n-бутанол слоя. Извлечь еще раз с 250 мкл n-Бутанол (насыщена водой), спина, снять верхние n-бутанол слой и сочетают с бывшим экстракт.
      2. Добавить 400 мкл воды (насыщенный с n-бутанол) это экстракт и смесь энергично. Спина в отдельные слои и удалить нижний водный слой. Повторите эту процедуру Стиральная с использованием 400 мкл воды (насыщенный с n-бутанол). 3 мкл 250 мм раствор трис-HCl, pH 9.5, в n-бутанол слоя. Испарится n-бутанол к сухости в испаритель при комнатной температуре.
      3. Растворяют остатки в 100 мкл n-Бутанол, снова выпарить до сухости и распустить остатки в 16,0 мкл воды.
    4. Маркировка аддукты
      1. Добавить 1 мкл bicine буферного раствора (маркировка буфера) и 4,5 мкл сочетание содержащих 100 Μки [γ -32P] СПС, 45 пмоль холодной СПС и 10.0 U из T4-PNK (T4-phosphonucleotide киназы) до 16,0 мкл раствора от NP1 или бутанол обогащение смеси. Окончательный концентрации реагентов будет следующим: bicine 20 мм, 10 мм MgCl2, dithiotreitol 10 мм, 0,5 мм спермидина и 0,5 U/мкл T4-PNK, СПС 3 мкм. Общий объем смеси составляет 20 мкл.
      2. Позвольте смеси реагировать на 30 минут при комнатной температуре. Применить весь образец (т.е. 20 мкл) на пластину TLC Пей целлюлозы (2.5.6.).
    5. Оценка эффективности NP1 или n -Бутанол, совершенствовании процедур
      1. Мыть в нижней части трубки с 50 мкл воды. Смесь энергично для 30 s и спина (1 мин) при 1600 x g в центрифуге учредить там это не загрязнение на крышке. SPOT 5 мкл на плите TLC Пей целлюлозы (20 x 20 см). Хроматограф с помощью решения 280 мм (NH4)2так4 и 50 мм NaH2PO4, pH 6.8.
    6. ТСХ разделения углубил deoxynucleotides
      1. Предварительная стирка TLC пластины с дистиллированной водой. Рекомендуется особенно для домашнего пластин.
        Примечание: Это мыть должно осуществляться для удаления желтый цвет из плит, цвет, который может поднять фон, особенно на фронт растворителя.
      2. Месте весь образец на ОПЭ целлюлоза TLC пластину и начать хроматографии (2.5.4.); очистку аддукты осуществляется путем разработки пластину в D1 и D2 направлениях (рис. 2).
      3. Разработка пластину в направлении D1 (рис. 2). Использование 1,7 М натрия фосфат буфера, pH 6.8, чтобы обеспечить, что ДНК аддукты остаются в начале пластину TLC. Аналогично развивать пластины в направлении D2, используя этот буфер. Для получения информации о возможных буферы для процедур см. решений, описанных для разрешения нескольких типов аддукты20,28.
        Примечание: Развитие плиты в направлении D2 может быть опущен.
      4. После хроматографии для около 5 мин в двух последовательных бани Вымойте пластину в деионизированной воде. После этого сухой плиты.
      5. Разработка плиты в направлении D3 и D4, используя 3,5 М литий формате буфера, рН 3,5, содержащий 8,5 М мочевины для направления D3 и 0,5 М трис-HCl буфера, рН 8,0, содержащий 0.8 M LiCl и 8,5 М мочевины для D4 направлении (рис. 2). Растворители должны быть скорректированы развивать пятна adduct через пластину TLC. Для получения информации о возможных буферы для D3 и D4 разработки процедур увидеть решения, описал резолюции нескольких типов аддукты23,24,25,28.
      6. Чтобы избежать проблем в D4, после разработки в направлении D4 и промывка водой, развивать пластины (вдоль D4) в 1,7 М натрия фосфат, pH 6.0 (обычно назначаются как развитие в направлении D5), в верхней части фитиля бумаги (12 х 11,5 см).
        Примечание: D5 направлении также может быть опущено. В этом случае необходимо открыть танк TLC, когда растворитель достиг верхней части TLC и позволяет работать до 60 мин. Этот метод является даже лучше, чем добавление фитиль (метод часто используется во многих лабораториях для удаления каких-либо проблем в D4).
    7. Количественная оценка нормальной (неизмененным) deoxynucleotides после гидролиза
      1. Разбавить Алиготе гидролизат (от 2.5.1. описанием гидролизу ДНК) с дистиллированной водой, (т.е., 2.5 мкл пищеварение смеси от 2.5.1. скорректирована с 250 мкл, и 10 мкл это решение скорректирована 150 мкл).
      2. Возьмите 5 мкл (10 пмоль нормальной deoxynucleotides) аликвота этого сборника, добавить 2,5 мкл 10 мм трис-HCl буфере, рН 9,0 и метки как в 2.5.4. (окончательный объем смеси-10 мкл). Позволяет реагировать на 30 минут при комнатной температуре.
      3. Возьмите 4 мкл аликвота смеси и разбавляют до 750 мкл с 10 мм трис-HCl, рН 9,0. Mix и спин установить, нет никакого загрязнения крышки. Примените 5 мкл на тарелку, пей целлюлоза TLC. ТАК развитие пластину TLC в растворе 280 мм (NH4)24 и 50 мм NaH2PO4, рН 6,5. Дайте высохнуть после TLC.
      4. Используйте авторадиографии, выполняемого для приблизительно 45 мин при комнатной температуре для локализации четыре неизмененном deoxynucleotide бис фосфаты. Вырежьте пятно для квантификации ЖС или Cerenkov подсчета.
    8. Расчет относительного аддукт маркировки (RAL)
      1. Определите значения счетчиков в пятнах adduct и графов в Алиготе помечены неизмененным (нормальный) deoxynucleotides.
        Примечание: Последние должны определяться на 180 000 пунктам меньше материала, чем первый, и эта цифра является коэффициент пересчета для применения к количество неизмененных (нормальный) deoxynucleotides для оценки значения RAL adduct уровней. RAL ДНК аддукты рассчитывается по уравнению (2) показано выше.
    9. Определение привязки тест канцерогенов или наркотиков ДНК с помощью меченных радиоактивными наркотиков
      1. Оценки 3H или 14C радиоактивности ДНК изменения с химическими веществами путем подсчета ЖС.
      2. Добавьте 10-50 мкл раствора ДНК в 3 мл раствора сцинтилляционные во флаконе сцинтилляции. Хорошо перемешайте. Измерения радиоактивности, используя счетчик сцинтилляции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Использование протоколов, описанные здесь для использования активации фермента катализированное (т.е., P450, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы) расследовать потенции химических веществ (канцерогенов/препараты) для метаболизируется до промежуточных продуктов, что приводит к их ковалентных Привязка к ДНК (поколения ДНК аддукты), мы смогли решить (i) роман механизм фармакологического действия противоопухолевых агентов ellipticine (для обзора см,29,,30-31), (ii этиологии двух нефропатии, связанные с верхней urothelial тракта рака, вызванного завод алкалоид aristolochic кислота (Aristolochic кислота нефропатии и балканских эндемических нефропатия) (для обзора см,32,33,34, 35,,3637,,3839) и (iii) генотоксичных механизмы канцерогенности несколько канцерогенных веществ как загрязнителей воздуха 3 - nitrobenzanthrone (3-НБА)40,,4142,,4344,45 и его восстановительной коллегой, 3-aminobenzanthrone (3-ABA),46 ,,4748 завода алкалоид aristolochic кислоты,32,33,34,35,,3637 , 38 , 39 и ароматических аминов o- anisidine. 49 , 50 , 51 , 52 , ферменты, определения биологического воздействия этих химических веществ были определены использованием описанных методов.

Здесь представитель результаты на окислительная активация ellipticine, P450s и пероксидазы результате поколения ковалентных аддуктов с ДНК и на сокращение 3-НБА метаболитов, которые ковалентно изменение ДНК, показаны.

Завод алкалоида ellipticine (5,11-диметил-6H- pyrido [4,3 -b] Карбазол) и его производные являются противоопухолевых агентов, которые действуют как повреждение ДНК наркотиков через несколько механизмов, включенные в арест клеточного цикла и индукции апоптоз (для обзора, см.29,,30-31). Используя протоколы, описанные в этой работе, мы продемонстрировали, что противораковый препарат генерирует ковалентных ДНК аддукты после метаболических активация, катализируемые микросомальной P450s (рис. 3) и пероксидазы (рис. 4)29, 30 , 31 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59 , 60 , 61и это объясняется сильным эффективность этого агента против раковых клеток30. [3H]-radiolabeled ellipticine и нуклеиназы P1 версии 32P-postlabeling техника использовались преимущественно в исследования29,,3031,53 ,,61. Комплексное исследование с помощью субцеллюлярные ферментных систем, ингибиторы фермента и чистых ферментов в эксперименты, используя описанные протоколы, преобладающим Р450 ферментов, которые аддукты окисляющие ellipticine реактивной видов, образующих ДНК и структуры Эти реактивные видов были характерны29,30,,3155. P450s изучил человеческого фермента CYP3A4 является наиболее эффективным в ellipticine окисления для 12-hydroxyellipticine и 13-hydroxyellipticine, ellipticine метаболитов, которые спонтанно разложить ellipticine-12-ylium и ellipticine-13-ylium Привязка к ДНК (рис. 5). 55 , 61 CYP ферменты также генерировать дальнейшие метаболитов например 9-hydroxyellipticine, который считается детоксикации метаболит, 7-hydroxyellipticine и ellipticine N2-оксид, которые образуются как несовершеннолетнего ellipticine метаболитов. 9-hydroxyellipticine, а также 7-hydroxyellipticine и ellipticine N2-оксид главным образом формируются CYP1A1 и CYP2D6, соответственно. 55 , 57 , 58

Пероксидазы (т.е., пероксидаза (ПХ), лактопероксидаза (ЛПО), миелопероксидаза (МПО) и циклооксигеназами (COX-1 и COX-2)) метаболизировать ellipticine для создания же ellipticine производные ДНК аддукты (рис. 4)61 механизмами, показанный на рисунке 5.

Nitroaromatic 3-НБА (3-нитро-7H-benzдеanthracen-7-1) является компонентом дизельных двигателей и находится в воздухе частиц62,,6364. Основной метаболит этого загрязнителя, 3-ABA,64,65 был обнаружен в моче рабочих соляных шахт, которые были подвержены дизельных выбросов для долгое время63. Этот вывод свидетельствует, что эти рабочие подвергаются 3-НБА. Этот nitroaromatic вызывает опухоли легких крыс после инстилляции трахею67. 3-НБА также действует как мутагены в тесте Эймса Salmonella typhimurium (в штамм YG1024 экспрессирующих nitroreductase и O- Ацетилтрансфераза), создавая более чем 6 миллионов ревертантов за nanomole в этот штамм62. Ее генотоксичных потенции был также продемонстрировали поколение ковалентных аддуктов с ДНК в пробирке, после активации несколькими ферментами, используя протоколы, описанные в этой работе и в естественных условиях в нескольких органах животных грызунов (Рисунок 6 )39,40,,4142,,4344,45,46,47 ,64,,6768.

3-НБА производные ДНК аддукты формируется после активации 3-НБА с цитозольной reductases (т.е. NQO1) были измерены нуклеиназы P1 и n-бутанол методы обогащения 32P-postlabeling методом, описанным в протоколах представленные в настоящем исследовании. Результаты показали, что формирование до пяти ДНК аддукты (аддукт пятна 1-5 на рис. 7), и три из них были охарактеризованы в 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-aminobenzanthrone (да -N6-C2-ABA; аддукт место 1), N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-aminobenzanthrone (dG -N2-C2-ABA; аддукт пятно 3) и N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone (ГД-C8 -N-ABA; аддукт пятна 4. и 5) (рис. 7 и 8 цифра). Используя нуклеиназы P1 версии 32P-postlabeling метод, ГД-C8 -N-ABA (аддукт пятна 4 и 5) было обнаружить (рис. 7 и рис. 8). Это результат подчеркивает, возникают некоторые ограничения этой версии 32P-postlabeling, а именно, низкая (если таковые имеются) обнаружение углубил deoxynucleotides, которые dephosphorylated Нуклеаза P1 (то есть, аддукты образующихся окисление ариламинов или путем уменьшения ароматических nitroderivatives N- hydroxyarylamine-производные заменен на C8 deoxyguanosine). Аналогичные исследования с ellipticine, используя комплексное исследование с субцеллюлярные ферментных систем, ингибиторы фермента, чистых ферментов и ДНК аддукт стандартов в эксперименты, используя протоколы, описанные в этой работе, преобладающим цитозолевая сокращение ферментов метаболизма 3-НБА метаболитов генерации ДНК аддукты, а именно, реактивный метаболит, образованный сокращение 3-НБА (N-OH-ABA), и структуры трех ДНК аддукты порожденных 3-НБА были характерны (рис. 7 и Рисунок 8). В печени, активация 3-НБА в vitro был найден объясняется главным образом человека и крыса NQO1 (рис. 7), а человека N,O- acetyltransferases (NAT), NAT2, NAT1, sulfotransferase (SULT), SULT1A1 и, меньшей степени, SULT1A2 являются преобладающим ферменты этапа II активации 3-НБА42. Печеночная микросомальной POR также эффективен в активации 3-НБА41, но в мышей, 3-НБА является главным образом bioactivated, NQO1, вместо того, чтобы этот микросомальной POR42. В легких, который является ткани-мишени для канцерогенности 3-НБА-67, NQO1 и XO сократить 3-НБА метаболитов, которые аддукты генерации ДНК. Однако XO, как представляется, выступают в качестве незначительных 3-НБА активации фермента в этот орган69.

Figure 1
Рисунок 1: Схема 32P-postlabeling assay. Отображаются отдельные шаги 32P-postlabeling метода и его расширенной процедуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: структура ДНК аддукт элюции на ОПЭ целлюлоза TLC пластины. Разнонаправленный хроматографии ДНК аддукты на ОПЭ целлюлоза плит указаны. ПРОИСХОЖДЕНИЕ является стартовую позицию на пластину Пей целлюлоза TLC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: 32P-postlabeling анализ ДНК аддукты сформировалась в ДНК вилочковой железы теленка инкубировали с ellipticine, NADPH и крыса (A) и (B) человека микросом печени, (C) элемент управления образец без микросом. Аддукты 1 и 2, присвоенный стрелки генерируются в deoxyguanosine в ДНК ellipticine активированный с микросом. 32 P-postlabeling была выполнена используя нуклеиназы P1 версии метода (шаг 2.5.2.) Истоки расположены на нижней левой углах (D3 от дна к верхней и D4 слева направо). D2 был опущен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: 32P-postlabeling анализ ДНК, ellipticine опосредованной аддукты. Adducts сформированы в вилочковой железы теленка, ДНК прореагировало с ellipticine (100 мкм) и пероксидазы (A), говядину лактопероксидаза (B), человека миелопероксидаза (C), баранину циклооксигеназы-1 (D), человека циклооксигеназы-2 ( E) (5 мкг пероксидазы присутствовали в инкубаций), из печени, ДНК крыс, относились с ellipticine 40 мг на килограмм массы тела (bw) (F), от теленка тимуса ДНК прореагировало с ellipticine и человека CYP3A4 (G), с 13 - hydroxyellipticine()H), ellipticine N2-оксид (я) и 12-hydroxyelipticine (J). Были проведены эксперименты с использованием нуклеиназы P1 версии пробирного (шаг 2.5.2.) Истоки находятся на нижней левой углах (D3 от дна к верхней и D4 слева направо). D2 был опущен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: окисления ellipticine, пероксидазы и CYPs, показывая ellipticine метаболитов и тех, кто предложил сформировать ДНК аддукты. Соединений в скобках не имеют еще были обнаружены в экспериментальных условиях, используемых в экспериментах, и они являются электрофильное метаболитов, постулируется как конечной видов связывания ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: активация метаболических и ДНК аддукт формирования по 3-nitrobenzanthrone. 3-НБА, 3-nitrobenzanthrone; NQO1, NAD (P) H:quinone Оксидоредуктазы; NAT, N,O- acetyltransferases; SULT, sulfotransferase; CYP, цитохрома Р450; POR, NADPH: цитохрома P450 Оксидоредуктазы; HRP, пероксидазы; ЛПО, лактопероксидаза; MPO, миелопероксидаза; COX-1, циклооксигеназы-1. R = - COCH3 или -SO3Ч; dA -N6-ABA, 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-aminobenzanthrone; dG -N2-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-aminobenzanthrone; dG-C8 -N-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: 32P-postlabeling анализ ДНК, 3-НБА производные аддукты. Нуклеаза P1-(левой панели) и n-бутанол извлечения версий (правой панели) метода были использованы. A и Ab, аддукты формируются на теленка, что тимус ДНК прореагировало с 3-НБА (300 мкм) после активации с печёночной cytosols крыса. B и Bb, аддукты сформирована в теленка тимуса ДНК, отреагировал с 3-НБА (300 мкм) после активации с человеческой печени цитозоле (пуле дробь). C и Cb, аддукты сформирована в теленка тимуса ДНК, отреагировал с 3-НБА (300 мкм) после активации с чистой крыса печеночная NQO1 (0,09 единиц). D и Db, аддукты сформирована в теленка тимуса ДНК, реагируют с 3-НБА (30 мкм) после активации с человека NQO1 рекомбинантные (0,06 единиц). E и Eb, аддукты формируются на лосося яички ДНК относились с N-OH-ABA. F и Fb, аддукты сформированных в печени ДНК однопометники одичал типа на фоне C57BL/6, в 2 мг 3-НБА за кг ж.м пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: 32P-postlabeling анализ ДНК, 3-НБА производные аддукт стандартов [dG -N2-C2-ABA (A), да -N6-C2-ABA (B) и ГД-C8 -N-ABA (C)] (панели) и структуры 3-НБА и эти 3-НБА-ДНК () b панелей). Н-бутанол извлечения версии метода использовался (панелей в). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом документе доказано, что широко доступной методологии для изучения потенции химических веществ, чтобы быть bioactivated на метаболические промежуточных продуктов, что приводит к генерации ковалентных ДНК аддукты. Это очень важный вопрос, потому что оценки потенции окружающей среды химических веществ или препаратов их ферментативной активации метаболитов, генерации ковалентных ДНК аддукты важной области в развитии рака и его лечении. Как Центральная догма канцерогенеза, вызванных канцерогенов теперь судить модификации ДНК, канцерогены, считается причиной развития опухоли. Это предложение подтверждается целый ряд выводов, таких как явления что: (i) канцерогенных свойств различных канцерогенов зависит активация этих соединений для метаболитов, реагируя с нуклеофильных центров в ДНК; (ii) уровень ДНК аддукты часто соответствуют многие канцерогенные ответов; (iii) и мутации в определенных генов супрессоров опухолей и активации нескольких протоонкогенов могут быть вызваны их модификации с химическими веществами с канцерогенными потенции. Кроме того было продемонстрировано ковалентная модификация ДНК, противораковые препараты, как один из наиболее эффективных повреждения ДНК эффекты этих препаратов, что приводит к их использования в лечении рака.

Есть два критических точек, определяющих успешное оценки химических веществ для их генотоксических свойств, т.е. их потенции сформировать ковалентных ДНК аддукты, в частности: (i), чтобы найти, решить и характеризуют эффективность ферментативной систем, способных активации канцерогены/препараты для привязки электрофильное видов нуклеофильных центров ДНК, и (ii) разрабатывать и использовать наиболее подходящие методы, которыми аддукты канцерогенного вещества/препарата – ДНК найдены и структурно характеризуется. В этом исследовании описаны соответствующие методы для обеих функций.

Процедуры изоляции для сотовых фракций, содержащих ферментов биотрансформации (микросомальной или цитозольной образцы, обладающие P450s и дополнительные bioactivating ферменты т.е. пероксидазы или reductases POR, NQO1, XO и AO), протоколы для Активация тест канцерогены/наркотиков, ферментных систем (инкубаций с ДНК) и их использовании, показано в этой работе указано, как продемонстрировано представителем результаты, их пригодности для оценки генотоксических свойств химических веществ.

Кроме того методы, подходящие для обнаружения и количественного определения аддуктов с ДНК как две версии обогащения 32P-postlabeling техники (нуклеиназы P1 - и n -бутанол добыча процедур) и использование радиоактивно меченных проверенных соединений были продемонстрированы подходящими для исследований, оценивающих генотоксичности канцерогенного вещества/препарата ксенобиотиков.

Относительно определения ковалентных ДНК аддукты, не только эти два метода, но и другие методы для обнаружения и измерения ДНК аддукты были установленным8,,7071,72 ,,7374,75,76,,7778,79,80,81 , 82. до 1981 года, количественного определения ДНК аддукты используются радиоактивные химические вещества (канцерогены/препараты), обозначены 3H или 14C, которые были подготовлены синтетически. Такие методы были использованы пользой для исследования с ellipticine как описано в этой работе (см.,53-54). Тем не менее обычно трудно подготовить производные с высокой радиоактивностью для их успешного использования73,,8081. Таким образом несмотря на то, что эта процедура до сих пор используется, он ограничен к сожалению в vitro эксперименты аналогичны описанным здесь. Других методов, масс-спектрометрия, электрон спрей ионизации (ESI), при содействии матрицы лазерной десорбции ионизации (MALDI), ускоритель масс-спектрометрия (AMS), флуоресценции, биологические методы иммуноферментного анализа, и 32 P-postlabeling описано в настоящем исследовании в деталях, были разработаны (обзор, см8,16,,7071,,7273, 74,75,76,77,,7879,80,,8182).

Показано 32P-postlabeling assay описано в протоколе этой работы, которая не только имеет применимость в экспериментах в vitro (см. Представитель результаты), а именно, тестирование новых соединений для генотоксичности или механистической исследования канцерогенного вещества/препарата активации, но имеет также дальнейшее использование таких, как оценки воздействия на человека канцерогенов окружающей среды, исследования механизмов развития опухоли, мониторинг ремонта ДНК, анализ ДНК повреждения эндогенного соединений и окислительных реакций и расследование реакции больных цитотоксических противоопухолевых препаратов8372,.

Этот метод является, однако, не без некоторых ограничений73. Поражения в ДНК, которые не являются стабильными как monodeoxynucleotides, не может быть определено надежно. 32P-postlabeling метод не способен определить структуры ДНК аддукт. Следовательно, структурная характеристика ДНК аддукты часто опирается на демонстрации их совместного хроматографии с синтетическими стандартами известных структур. Действительно такой метод использовался в обоих примерах представитель результаты, показанные в этой работе (ellipticine, 3-НБА).

В заключение, протоколы, показано в этой работе может рассматриваться как подходящие методы для оценки потенции окружающей среды химических веществ или наркотиков энзиматического bioactivated метаболитов, генерации ковалентных ДНК аддукты, крайне важный процесс для развитие рака и его лечении.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Автор не имеет ничего, чтобы раскрыть.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано чешский научного фонда (GACR, Грант 17-12816S).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  2. Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 14, (6), 611-650 (2001).
  3. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 21, (2), 70-83 (2008).
  4. Stiborova, M., et al. NADH:Cytochrome b5 Reductase and Cytochrome b5 Can Act as Sole Electron Donors to Human Cytochrome P450 1A1-Mediated Oxidation and DNA Adduct Formation by Benzo[a]pyrene. Chem. Res. Toxicol. 29, (8), 1325-1334 (2016).
  5. Rendic, S., Guengerich, F. P. Contributions of human enzymes in carcinogen metabolism. Chem. Res. Toxicol. 25, (7), 1316-1383 (2012).
  6. Wienkers, L. C., Heath, T. G. Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Discov. 4, (10), 825-833 (2005).
  7. Guengerich, F. P., Liebler, D. C. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites. Crit. Rev. Toxicol. 14, (3), 259-307 (1985).
  8. Poirier, M. C. Linking DNA adduct formation and human cancer risk in chemical carcinogenesis. Environ. Mol. Mutagen. 57, (7), 499-507 (2016).
  9. Rappaport, S. M., Li, H., Grigoryan, H., Funk, W. E., Williams, E. R. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles. Toxicol. Lett. 213, (1), 83-90 (2012).
  10. Luch, A. Nature and nurture - lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5, (2), 113-125 (2005).
  11. Nebert, D. W., Dalton, T. P. The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis. Nat Rev Cancer. 6, (12), 947-960 (2006).
  12. Phillips, D. H. Macromolecular adducts as biomarkers of human exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. Imperial College Press. London. 137-169 (2005).
  13. Phillips, D. H. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat. Res. 577, (1-2), 284-292 (2005).
  14. Hemminki, K. DNA adducts, mutations and cancer. Carcinogenesis. 14, (10), 2007-2012 (1993).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, (12), 958-970 (2008).
  16. Geacintov, N. E., Broydem, S. Repair-resistant DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 30, (8), 1517-1548 (2017).
  17. Randerath, K., Reddy, M. V., Gupta, R. C. 32P-labeling test for DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78, (10), PubMed ID: 7031643 6128-6129 (1981).
  18. Reichert, W. L., Stein, J. E., French, B., Goodwin, P., Vanarasi, U. Storage phosphor imaging technique for detection and quantitation of DNA adducts measured by the 32P-postlabeling assay. Carcinogensis. 13, (8), 1475-1479 (1992).
  19. Chang, L. W., Hsia, S. M. T., Chang, P. C., Hsieh, L. L. Macromolecular adducts - biomarkers for toxicity and carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 41-67 (1994).
  20. Gupta, R. C., Reddy, M. V., Randerath, K. 32P-post-labeling analysis of nonradioactive aromatic carcinogen DNA adducts. Carcinogenesis. 3, (9), 1081-1092 (1982).
  21. Reddy, M. V., Randerath, K. Nuclease-P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis. 7, (9), 1543-1551 (1986).
  22. Mourato, L. L., Beland, F. A., Marques, M. M. 32P-Postlabeling of N-(deoxyguanosin-8-yl)arylamine adducts: a comparative study of labeling efficiencies. Chem. Res. Toxicol. 12, (7), 661-669 (1999).
  23. Randerath, E., Agrawal, H. P., Weaver, J. A., Bordelon, C. B., Randerath, K. 32P-Postlabeling analysis of DNA adducts persisting for up to 42 weeks in the skin, epidermis and dermis of mice treated topically with 7,2-dimethylbez[a]anthracene. Carcinogenesis. 6, (8), 1117-1126 (1985).
  24. Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avits, T. A., Randerath, K. Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta. Science. 231, (4733), 57-65 (1986).
  25. Gupta, R. C. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res. 45, (11 Pt 2), PubMed ID: 4053037 5656-5662 (1985).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Omura, T., Sato, R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239, PubMed ID: 14209971 2370-2378 (1964).
  28. Stiborová, M., Asfaw, B., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M. Benzenediazonium ion derived from Sudan I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chem. Res. Toxicol. 8, (4), 489-498 (1995).
  29. Stiborova, M., Rupertova, M., Schmeiser, H. H., Frei, E. Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 150, (1), PubMed ID: 16936898 13-23 (2006).
  30. Stiborová, M., Rupertová, M., Frei, E. Cytochrome P450- and peroxidase-mediated oxidation of anticancer alkaloid ellipticine dictates its anti-tumor efficiency. Biochim. Biophys. Acta. 1814, (1), 175-185 (2011).
  31. Stiborova, M., Frei, E. Ellipticines as DNA-targeted chemotherapeutics. Current Med. Chem. 21, (5), 575-591 (2014).
  32. Arlt, V. M., Stiborova, M., Schmeiser, H. H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis. 17, (4), 265-277 (2002).
  33. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28, (11), 2253-2261 (2007).
  34. Stiborová, M., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy. Mutat. Res. 658, (1-2), 55-67 (2008).
  35. Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H. Biotransformation enzymes in development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid. Kidney Int. 73, (11), 1209-1211 (2008).
  36. Schmeiser, H. H., Stiborová, M., Arlt, V. M. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, (1), PubMed ID: 19152223 141-148 (2009).
  37. Gökmen, M. R., et al. The epidemiology, diagnosis, and management of aristolochic acid nephropathy: a narrative review. Ann. Intern. Med. 158, (6), 469-477 (2013).
  38. Stiborová, M., Martínek, V., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Enzymes metabolizing aristolochic acid and their contribution to the development of aristolochic acid nephropathy and urothelial cancer. Curr. Drug Metab. 14, (6), 695-705 (2013).
  39. Stiborová, M., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Balkan endemic nephropathy: an update on its aetiology. Arch. Toxicol. 90, (11), 2595-2615 (2016).
  40. Arlt, V. M., et al. Metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone by human acetyltransferases and sulfotransferase. Carcinogenesis. 23, (11), PubMed ID: 12419844 1937-1945 (2002).
  41. Arlt, V. M., Stiborova, M., Hewer, A., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H. Human enzymes involved in the metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone: evidence for reductive activation by human NADPH:cytochrome P450 reductase. Cancer Res. 63, (11), PubMed ID: 12782579 2752-2761 (2003).
  42. Arlt, V. M., et al. Environmental pollutant and potent mutagen 3-nitrobenzanthrone forms DNA adducts after reduction by NAD(P)H:quinone oxidoreductase and conjugation by acetyltransferases and sulfotransferases in human hepatic cytosols. Cancer Res. 65, (7), 2644-2652 (2005).
  43. Osborne, M. R., et al. Synthesis, characterization, and 32p-postlabeling analysis of DNA adducts derived from the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 18, (6), 1056-1070 (2005).
  44. Arlt, V. M., et al. Identification of three major DNA adducts formed by the carcinogenic air pollutant 3-nitrobenzanthrone in rat lung at the C8 and N2 position of guanine and at the N6 position of adenine. Int. J. Cancer. 118, (9), 2139-2146 (2006).
  45. Stiborová, M., et al. Mechanisms of the different DNA adduct forming potentials of the urban air pollutants 2-nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 23, (7), 1192-1201 (2010).
  46. Arlt, V. M., Hewer, A., Sorg, B. L., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, forms DNA adducts after metabolic activation by human and rat liver microsomes: evidence for activation by cytochrome P450 1A1 and P450 1A2. Chem. Res. Toxicol. 17, (8), 1092-1101 (2004).
  47. Arlt, V. M., Henderson, C. J., Wolf, C. R., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. Bioactivation of 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone: evidence for DNA adduct formation mediated by cytochrome P450 enzymes and peroxidase. Cancer Lett. 234, (2), 220-231 (2006).
  48. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676, (1-2), 93-101 (2009).
  49. Stiborová, M., Miksanová, M., Havlícek, V., Schmeiser, H. H., Frei, E. Mechanism of peroxidase-mediated oxidation of carcinogenic o-anisidine and its binding to DNA. Mutat. Res. 500, (1-2), 49-66 (2002).
  50. Stiborová, M., Miksanová, M., Sulc, M., Rýdlová, H., Schmeiser, H. H., Frei, E. Identification of a genotoxic mechanism for the carcinogenicity of the environmental pollutant and suspected human carcinogen o-anisidine. Int. J. Cancer. 116, (5), 667-678 (2005).
  51. Naiman, K., Martínková, M., Schmeiser, H. H., Frei, E., Stiborová, M. Human cytochrome-P450 enzymes metabolize N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, a metabolite of the carcinogens o-anisidine and o-nitroanisole, thereby dictating its genotoxicity. Mutat. Res. 726, (2), 160-168 (2011).
  52. Naiman, K., et al. Formation, persistence, and identification of DNA adducts formed by the carcinogenic environmental pollutant o-anisidine in rats. Toxicol. Sci. 127, (2), 348-359 (2012).
  53. Stiborová, M., Bieler, C. A., Wiessler, M., Frei, E. The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts. Biochem. Pharmacol. 62, (12), 1675-1684 (2001).
  54. Stiborová, M., Stiborová-Rupertová, M., Borek-Dohalská, L., Wiessler, M., Frei, E. Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16, (1), 38-47 (2003).
  55. Stiborová, M., et al. The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res. 64, (22), 8374-8380 (2004).
  56. Kotrbová, V., et al. Cytochrome b5 shifts oxidation of the anticancer drug ellipticine by cytochromes P450 1A1 and 1A2 from its detoxication to activation, thereby modulating its pharmacological efficacy. Biochem. Pharmacol. 82, (6), 669-680 (2011).
  57. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 increases cytochrome P450 3A4-mediated activation of anticancer drug ellipticine to 13-hydroxyellipticine whose covalent binding to DNA is elevated by sulfotransferases and N,O-acetyltransferases. Chem. Res.Toxicol. 2, (5), 1075-1085 (2012).
  58. Stiborová, M., et al. Ellipticine oxidation and DNA adduct formation in human hepatocytes is catalyzed by human cytochromes P450 and enhanced by cytochrome b5. Toxicology. 302, (2-3), 233-241 (2012).
  59. Sulc, M., et al. Effectiveness of human cytochrome P450 3A4 present in liposomal and microsomal nanoparticles in formation of covalent DNA adducts by ellipticine. Neuro Endocrinol. Lett. 37, (Suppl 1), PubMed ID: 28263536 95-102 (2016).
  60. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 plays a dual role in the reaction cycle of cytochrome P450 3A4 during oxidation of the anticancer drug ellipticine. Monatsh. Chem. 148, (11), 1983-1991 (2017).
  61. Stiborová, M., Poljaková, J., Ryslavá, H., Dracínský, M., Eckschlager, T., Frei, E. Mammalian peroxidases activate anticancer drug ellipticine to intermediates forming deoxyguanosine adducts in DNA identical to those found in vivo and generated from 12-hydroxyellipticine and 13-hydroxyellipticine. Int. J. Cancer. 20, (2), 243-251 (2007).
  62. Enya, T., Suzuki, H., Watanabe, T., Hirayama, T., Hisamatsu, Y. 3-Nitrobenzanthrone, a powerful bacterial mutagen and suspected human carcinogen found in diesel exhausts and airborne particulates. Environ. Sci. Technol. 31, (10), 2772-2776 (1997).
  63. Seidel, A., Dahmann, D., Krekeler, H., Jacob, J. Biomonitoring of polycyclic aromatic compounds in the urine of mining workers occupationally exposed to diesel exhaust. Int. J. Hyg. Environ. Health. 204, (5-6), 333-338 (2002).
  64. Arlt, V. M. 3-Nitrobenzanthrone, a potential human cancer hazard in diesel exhaust and urban air pollution: a review of the evidence. Mutagenesis. 20, (6), 399-410 (2005).
  65. Hansen, T., Seidel, A., Borlak, J. The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 221, (2), 222-234 (2007).
  66. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676, (1-2), 93-101 (2009).
  67. Nagy, E., et al. DNA adduct and tumor formations in rats after intratracheal administration of the urban air pollutant 3-nitrobenzanthrone. Carcinogenesis. 26, (10), 1821-1828 (2005).
  68. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its human metabolite 3-aminobenzanthrone are potent inducers of rat hepatic cytochromes P450 1A1 and -1A2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Drug Metab. Dispos. 34, (8), 1398-1405 (2006).
  69. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone induces cytochrome P450 1A1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in rat lung and kidney, thereby enhancing its own genotoxicity. Toxicology. 247, (1), 11-22 (2008).
  70. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat. Rev. Cancer. 4, (8), 630-637 (2004).
  71. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Discov. Med. 14, (77), PubMed ID: 23114584 283-288 (2012).
  72. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat. Res. 378, (1-2), 1-12 (1997).
  73. Phillips, D. H., et al. Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity. Environ. Mol. Mutagen. 35, (3), 222-233 (2000).
  74. Phillips, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis. 23, (12), 1979-2004 (2002).
  75. Phillips, D. H., Hewer, A., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 291, 3-12 (2005).
  76. Farmer, P. B., et al. DNA adducts: mass spectrometry methods and future prospects. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207, (2 Suppl), 293-301 (2005).
  77. Singh, R., Farmer, P. B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis. 27, (2), 178-196 (2006).
  78. Phillips, D. H., Arlt, V. M. The 32P-postlabeling assay for DNA adducts. Nat. Protoc. 2, (11), 2772-2781 (2007).
  79. Phillips, D. H. On the origins and development of the (32)P-postlabelling assay for carcinogen-DNA adducts. Cancer Lett. 334, (1), 5-9 (2013).
  80. Phillips, D. H., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 1105, 127-138 (2014).
  81. Stiborová, M., Frei, E., Bieler, C. A., Schmeiser, H. H. 32P-Postlabelling: a sensitive technique for the detection of DNA adducts. Chem. Listy. 92, 661-668 (1998).
  82. Stiborová, M., Rupertová, M., Hodek, P., Frei, E., Schmeiser, H. H. Monitoring of DNA adducts in humans and 32P-postlabelling methods. A review. Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 477-498 (2004).
  83. Beach, A. C., Gupta, R. C. Human biomonitoring and the 32P-postlabelling assay. Carcinogenesis. 13, 1053-1074 (1992).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics