형성 화학식 DNA Adducts 효소 활성화 된 발암 물질 및 생체 외에서 마약 및 32P postlabeling에 의해 그들의 결정에 의해

Biochemistry

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Summary

환경 약품 및 중간체 공유 DNA를 생성 하는 bioactivated adducts 효소 수 약물의 효능을 평가 암과 치료의 개발에 중요 한 필드입니다. 메서드는 양식에 그들의 탐지 및 정량화에 대 한 기술 뿐만 아니라 DNA adducts 복합 활성화에 대 한 설명 합니다.

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Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).

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Abstract

화학식 DNA adducts 화학 물질에 의해 형성 또는 발암 성 힘으로 약물 발암 과정의 개시 단계에서 가장 중요 한 요인의 하나로 판단 됩니다. 이 공유 바인딩 tumorigenesis의 원인으로 간주 됩니다, 이제 화학 발암의 중앙 교리로 평가 됩니다. 여기, 방법을 채용 시 토 크롬 P450 하 여 촉매 반응을 설명 하 고 화학 제품 또는 이러한 DNA를 형성 하는 대사 산물을 그들의 정품 인증에 대 한 약물의 효능을 조사 하기 위해 추가적인 생물학적 효소 adducts. 절차는 생물학적 효소 (microsomal와 cytosolic 샘플 한다 P450 또는 다른 생물학적 효소, , peroxidases, NADPH: 시 토 크롬 P450 보유 세포 분수의 격리를 설명 하 되 게 됩니다. oxidoreductase, NAD (P) H:quinone oxidoreductase, 또는 세 산화 효소). 방법 설명 또한, 이러한 효소 뿐만 아니라 DNA의 분리에 대 한 분석된 화학 물질의 대사 활성화를 위해 사용할 수 있는. 또한, 적절 한 방법을 감지 하 고 측정 화학/약물 파생 된 DNA adducts, , 32P postlabeling 기술의 다른 수정 및 방사성 분류의 고용, 화학 분석 자세히 표시.

Introduction

환경 화학 물질 (약물) xenobiotics의 물질 대사는 두 단계1에서 발생합니다. 단계 I 및 II 더 친수성 원래 소수 (하지 수용 성) 화합물을 렌더링 하는 것을 목표로 (수용 성), 따라서 소변, 배설물 또는 땀을 통해 쉽게 excretable 그들을 만들기. 단계 (기능화) 반응을 포함 산화, 감소, 및 hydroxylation peroxidases (P450s, CYPs), 시 토 크롬 P450s와 같은 효소에 의해 촉매 (즉,., cyclooxygenase, 콕스), aldo keto reductases (AKRs), 및 microsomal 플 라빈 함유 monooxygenases (FMOs)입니다. 또한 감소 반응, reductases 즉, microsomal NADPH: 시 토 크롬 P450 환 원 효소 (POR) 및 cytosolic NAD (P) H:quinone oxidoreductase (NQO1), 세 산화 효소 (XO), 그리고 알데하이드 산화 효소 (AO)1 의 다양 한에 의해 중재를 포함 하는 단계 . 두 번째 단계 (활용), 단계에 연결 된 기능 그룹에서에서 켤레 극성을 더욱 높이기 위해 작은 극 지 분자를 데 사용 됩니다. 단계 II는 sulfotransferases (SULTs), N, O-acetyltransferases (Nat), methyltransferases catechol-O-methyltransferase (COMT), 티 S-등의 반응에 참여 하는 것으로 간주 하는 효소의 예 transferases (GSTs), 그리고 uridine diphosphate glucuronosyltransferases (UGTs)1. 그러나 단계에서 효소의 분류 I 또는 II는,, 하지 경직 된, 그리고 일부 효소 틀림 없이 어느 범주에 그룹화 할 수 있습니다.

P450 효소 (EC 1.14.14.1) 헤 많은 화학, 그들의 변환3,4catalyzing의 생물학적에 참여, 다양 한 유기 체에 있는 단백질을 포함 하는. P450 효소 촉매 반응 어디 dioxygen의 1 개의 원자에 도입 xenobiotics, 분자 산소의 두 번째 아톰은 2 개의 전자 [방정식 (1 필요로 하는 반응에 의해 양식 물 감소 하는 동안 많은 기판의 hydroxylation )]3,4:

RH + O2 + NADPH + H+ → 노 + H2O + NADP+ (1)

P450 효소 포유류 세포 (microsomal P450 시스템)의 바인딩과 그물 막에 더 NADPH: 시 토 크롬 P450 환 원 효소 (POR) 및 시 토 크롬 b5 를 포함 하는 multienzyme monooxygenase 시스템의 구성원 인 NADH: 시 토 크롬 b5 reductase 효소의 기질 되 나. 일반적으로 허용된 이론 hypothesizes P450에 필요한 2 개의 전자의 기증자 NADPH/POR 시스템입니다. 그럼에도 불구 하 고, 시 토 크롬 b5 수 또한 역할 전자의 기증자 P450, 즉의 반응 주기의 두 번째 감소 동안 P450 감소 전자의 기증자로 어디 NADH: 시 토 크롬 b5 와 함께 작동 reductase2,,34.

포유류 활용 다양 한 P450 효소 (예를 들어, 가족 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26, 및 27의 효소) 스테로이드, 같은 귀중 한 내 인 성 화합물의 합성에 놓을 자연 제품2,3 에 대 한 그들을 사용 하 여 . 다른 CYP 포유류 효소, 인간의 CYP1A2, 2C 9, 2C 19 등 2D 6, 및 3A4, 마약으로 사용 되는 외 인 화학 물질 대사. 5 , 6 가장 중요 한 효소 약물의 대사를 catalyzing 3A subfamily, 특히 CYP3A4 CYPs는. 프로-발암 물질 등 프로-유독 xenobiotics의 변환 인간의 CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 및 3A42,5에 의해 중재 됩니다. 이러한 CYPs의 대부분 (CYP1A1 1B1 제외) 간에 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, CYPs는 여러 extrahepatic 장기에도 표현 됩니다. 이러한 P450s 주로 큰 의미의 있을 때 이러한 장기7에서 반응 중간체에 그들은 화학 물질 (약물)의 bioactivation 대사에 참여. 다양 한 P450s는 이것이 반드시 경우 비록 그들의 기질, 여러 화합물에 의해 유도 됩니다.

많은 P450 효소 화학 (마약) 독성에 역할을 재생합니다. 그들은 뿐만 아니라 자신의 해독 대사 산물에는 xenobiotics를 변환할 수 있지만 또한 수정 하는 또한 다른 생물 학적 속성을 일반적으로 그들의 독성을 일으키는 내 생 고분자 반응 종에 그들을 활성화 합니다. DNA, 지질, 및 단백질 반응 electrophiles 및 활성화 된 화학 물질에서 생성 된 래 디 칼에 의해 그들의 수정에 대 한 목표 수 있습니다. DNA의 경우 몇 가지 중요 한 유전자 응답 및 그들의 메커니즘 해결2,3,,45이미 알려져 있습니다.

DNA에 변화 세포 성장 제어, 감소 될 수 있습니다 그리고이 현상이 발암 과정의 개발을 선도 하는 주된 요인이 될 간주 됩니다. 화학식 DNA의 세대 adducts 화학 물질과 발암의 개시 단계에서 가장 중요 한 단계 중 하나는8,9,,1011처리 판단 데 발암 성 힘. 시연 되었다 DNA의 형성 관계 adducts 및 tumorigenesis 발생, 반면 DNA 양을 감소 adducts 자성8,,910, 에 대 한 책임은 11 , 12 , 13 , 14. 발암 물질/의약품 파생의 형성 DNA adducts의 DNA, 개별 기초에 따라 달라 집니다 그리고 DNA에이 기지의 시퀀스에 의해 영향을 받습니다. 수리의 DNA adducts는 그들의 위치 (베낀 또는 비 복사할 DNA 가닥) 및 수정 된 뉴클레오티드 시퀀스8,,1112,15의 종류에 16.

이 문서에서는, 우리 DNA를 수정 하는 대사 산물으로 활성화 될 그들의 힘을 조사 하기 위해 화학 물질 (마약)의 효소 촉매 변환 활용 절차 설명 (생성 하는 DNA adducts). 화학식 DNA 바인딩, 테스트 화합물 일반적으로 해야 개별 약물에 따라 산화 또는 감소 반응에 의해 활성화. 시험 된 화학 물질의 산화 또는 감소 활성화 P450 의존 효소 시스템 microsomal subcellular 분수에 의해 중재 또는 reductases 감소 하 여 microsomes (POR, NADH: 시 토 크롬 b5 에서 모두 환 원 효소, P450 효소)와 셀룰러 cytosolic subcellular 분수 (NQO1, XO, AO, 과산화 효소). 반응 metabolites 그 후 DNA를 바인딩할 adducts DNA를 형성. 산화와 감소 반응 이러한 반응 종에 여러 약물을 활성화 하는 것이 중요 하기 때문에, 산화/환 원 효소 시스템을 채용 하는 실험적인 절차 설명 합니다. 또한, 적절 한 방법을 감지 하 고 측정 이러한 DNA adducts 자세히 설명 되어 있습니다.

테스트 화학 효소 시스템에 의해 활성화 여부를 확인 하기 위해 두 개의 독립적인 절차 DNA에 바인딩되어 권장: 32P postlabeling 기술과 활용 표시 된 방사성 화합물 (., 3H 또는 14 C). 첫 번째 파일럿, 32P postlabeling 분석 결과 검사 것이 좋습니다. 정확 하 게 평가 하는 솔루션에서 DNA 콘텐츠의 결정 두 가지 방법 모두 붙여야 합니다.

32P postlabeling 기술을 활용 하 여 비 방사성 화학 물질 (발암 물질/의약품) 3´-phosphodeoxynucleosides, 5´-방사성 인 (32P)와 추가 인 산화에 의해 수정 하는 DNA의 효소 가수분해 오 위치, 그리고 화학 deoxynucleotide의 분리 adducts 정상 (수정된) deoxynucleotides에서 크로마토그래피17 (그림 1)에 의해. DNA는 화합물에 의해 수정 endonuclease, micrococcal nuclease 및 비장 포스로 알려진 exonuclease의 혼합물에 의해 분해 됩니다. (수정 되지 않은) 두 정상을 포함 하 고 deoxyribonucleoside 3´-monophosphates 양식 5´- 에 pH 9.5에서 캐리어 (비 방사성) ATP 및 T4 polynucleotide 키 존재 [γ-32P] ATP와 반응 수정 hydrolyzed DNA의 혼합물 32P 표시 된 3´, 5´ bisphosphates ("표준" 절차 그림1에서). 사용 된 알칼리 pH에서 위치 3´ deoxyribonucleoside 3´ monophosphates dephosphorylate를 T4 polynucleotide 키의 효소 활동을 최소화 가능 하다. 분리 및 32의 해상도에서 adducts P 라는 화학 물질에 의해 수정 되지 않은 레이블된 deoxynucleotides multidirectional 음이온 교환 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) polyethyleneimine (페이) 셀 루 로스 (그림 2에 의해 수행 됩니다 ). (D1 및 D2 방향)에서 첫 번째 및 두 번째 차입 단계에서 [32P] 인산 염으로 레이블이 지정 된 정상 (수정된) deoxynucleotides는 eluted의 짧은 조각에 전해질의 물 솔루션을 사용 하 여 TLC 페이 셀 룰 로스 판의 시작에서 컬럼에 종이 전시 (발암 물질/약물-adducts) 소수 성 속성 바인딩된 화학 물질을 포함 하는 deoxynucleotides 또한 해결 해야 페이 셀 룰 로스 판의 시작에 유지 하는 반면 TLC 판 상단에 적용 와 d 3와 d 4 방향 (그림 2)에서 여러 다른 용 매 시스템. 국산화 adducts 화면 향상 autoradiography;를 사용 하 여 수행 분리 adducts x 선 필름에 어두운 인식할 수 있는 반점으로 검색 됩니다. 관광 명소의 지역 접시에서 excised 있으며 액체 섬광 또는 계산 Cerenkov 방사능을 측정 하는 데 사용. 이미징 방법 지도 및 DNA 계량에 적응 된 스토리지 인 adducts chromatograms 감지에 의해 32P postlabeling 분석 결과 지금 또한 사용 됩니다. 18 는 즉시 영상 기계 같은 검색 이용 자주 하 고 DNA의 정량화 adducts. 스크린의 기술 향상 autoradiography19보다 32P를 탐지 하기 위한 보다 10 배 더 높은 감도를 제공 합니다.

양의 DNA adducts의 상대 값 adduct 라벨 (RAL), 방정식 (2)를 사용 하 여 다음과 같이 계산으로 결정 됩니다.

노출 당 비용입니다. 에 deoxynucleotides adduct
RAL =---(2)
32P-ATP의 특정 활동 (cpm. / pmol) x pmol deoxynucleotides

총 [adducted 고 정상 (수정된) deoxynucleotides]의 수 속도 RALs의 값은 adducted deoxynucleotides의 수의 비율 deoxynucleotides20,21. 그러나,이 계산을 기반으로 동등한 adducts의 효율성 라벨 및 일반 deoxynucleotides22. 그러나 다양 한 DNA adducts 32P postlabeling 기술의 고전 ("표준") 절차는 적절 한 (부피 또는 부피 비 adducts),, 그것의 감도 만족 스러운 감지 하에서 낮은 금액 DNA adducts. 이 절차를 사용 하 여 DNA (0.3 fmol adduct / µ g DNA)에 107 수정 되지 않은 deoxynucleotides에 adduct의 양을 감지입니다.

수정이 클래식 32P postlabeling 절차의 다양 한 기법의 감도 상승 이용 되어 있다. 10-100 배 더 높은 감도의 결정의 최대 32여 adducts P 라벨 달성 되었습니다 [γ-32P] ATP (강화 절차)의 제한 레벨을 사용 하 여. 23 , 24 32P postlabeling 방법의 감도 증가 소화 DNA 포함의 부 화를 활용 하 여 제공 하는 추가 절차 adducts nuclease P1 ( 푸른 곰 팡이 citrinum)에서21 (그림 1)와 함께. 이 효소는 바인딩된 화학 (adducted 뉴클레오티드)와 deoxynucleotides는 기본적으로 하지는 기질이이 효소의 수정 되지 않은 deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, dephosphorylate을 좋아한다. 따라서, dephosphorylated deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (, deoxyribonucleosides)에서 γ-32P [32P] 인산 하 여 T4 polynucleotide 키 니 아 제에 의해 phosphorylated 하지은] ATP. 그러나, 일부 화학 물질은 뉴클레오티드의 (adducted deoxynucleotides), deoxyguanosine,이 효소에 의해 수 bedephosphorylated의 c 8에서와 같은 arylamine adducts 대체. 대조적으로, 대부분 다른 adducts (adducts예를 들어, deoxyguanosine의 N2 에서 대체) nuclease p 1에 의해 dephosphorylated 하지. 32P postlabeling이 수정 게이 방법 상당히 더 민감한, 이상 3 개의 크기 순서에 의해 그것의 감도 증가. 또한,이 버전의 32P postlabeling 메서드를 제공 합니다 어디에 더 높은 양의 DNA (5-10 µ g) 및 캐리어 무료 초과 [γ- 32P] ATP는 이용 될 수 있다.

풍부 하 게 하는 또 다른 방법은 adducts, 굽타25설명 된는 물리를 활용 하 여 부피가 큰 deoxynucleotide의 속성 adducts는 n으로 추출 될 수 있다-단계 전송 에이전트 tetrabutylammonium 존재 butanol [32P] 인산 라벨, 수정 되지 않은 deoxynucleotides는이 유기 용 매 추출 저조한 반면 이전 염화 (미정) (그림 1). 그러나, 적은 소수 adducts, 구성 된 deoxynucleotides의 예 비 향기로운 부피가 moieties 또는 작은 알 킬 잔류물, 수정에 대 한 추출 되지 않습니다 효과적으로 n-butanol. 따라서, 그들은 32P postlabeling 방법의이 수정에 의해 분석 하면 기본적으로 감지 되지 않습니다.

모두 32P postlabeling 증가 감도 DNA의 정량화 adducts 엄청난 (최대 3 개의 크기 순서)의 이전에 언급 한 버전, 109,10 정상 당 adduct 하나를 검색할 수 있게 되 고 뉴클레오티드 (0.3-3 박 / µ g의 DNA). 이러한 두 가지 방법 covalently DNA를 바인딩할 그들의 효율성에 대 한 화학 물질을 테스트 하기 위한 권장 하 고, 따라서, 그들은 세부 사항에서이 작품에 설명 되어 있습니다.

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Protocol

모든 동물 실험 관리 및 사용의 실험실 동물 (311/1997, 농림, 체코 공화국), 헬싱키의 선언 준수에 대 한 규정에 따라 수행 했다.

1. 간 Microsomal 및 Cytosolic 분수의 격리

  1. 간단한 차동 원심 (105000 x g)에 의해 쥐에서 간 subcellular 분수 (microsomes P450 효소 또는 reductases 또는 수용 성 peroxidases에 풍부한 cytosols 풍부한)을 준비 합니다.
    참고: 펠 릿과 상쾌한 가져옵니다 microsomes와 cytosols, 각각.
    1. 간 샘플 (1-10 g) 50 mM Tris HCl 버퍼, pH 7.4 150 m m KCl 버퍼 (버퍼 1) 포함 된 두 번 씻어 (조직, 의 무게 보다 10 배 높은 볼륨 10-100 mL) 조직의 작은 조각으로 잘라 (의 주위에 2 x 2 m m 크기).
    2. 이 버퍼의 조직 균질 (> 3 볼륨/중량 mL/g) 5 분, 그리고 폐기에 대 한 4 ° C에서 균질 화기에 여과 사용 하 여 조직의 잔여 비 균질 조각 종이 필터. 원심 600 x g 4 ° C에서 10 분 동안에 homogenate 그리고 다른 원심 분리 관에는 상쾌한 전송.
    3. 다시 버퍼 1 (조직 1 g 당 1 mL)에 펠 릿을 균질, 반복 단계 1.1.3., 펠 릿을 삭제 하 고. 4 ° c.에 20 분 동안 15000 x g 에서 풀링된 supernatants 원심 또 다른 원심 분리 관에는 상쾌한을 전송 합니다.
    4. 105000 x g 4 ° c.에 60 분에서 상쾌한 원심 상쾌한 (cytosol)를 수집 하 고-80 ° c.에 aliquots (1-10 mL)에 저장 브래드 퍼 드26에서 설명 하는 방법을 사용 하 여 단백질 양을 cytosol 특징.
    5. 다시 100 m m 나트륨 인산 염 버퍼, pH 7.4에에서 펠 릿을 일시 중단 (> 2 볼륨/중량 mL/g), 4 ° c.에 60 분 105000 x g 에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한. 다시 50 mM Tris HCl 버퍼, pH 7.4 150 m m KCl와 20% 글리세롤을 포함 하는 펠 릿 (microsomes)를 균질 (< 5 볼륨/중량 mL/g) 4 ° c.에 균질 화기에 -80 ° c.에 0.5-1 mL aliquots에 microsomes를 저장 브래드 퍼 드26에서 설명 하는 방법을 사용 하 여 단백질의 내용에 대 한 microsomes 특징.
    6. Microsomes에서 시 토 크롬 P450의 농도 결정 합니다.
      참고: 무라와 사토27, 흡수 감소 P450 일산화 탄소 (CO)와 복잡의 결정에 의해 설명 된 대로 microsomes P450 효소의 농도 측정 됩니다. 일산화 탄소는 독성 화합물 이며 주의 후드에 처리 될 수 있다.

2. 효소 시스템의 dna 테스트 화학 물질 (발암 물질/의약품)의 외피

  1. 테스트 화학 물질 (발암 물질/의약품) dna 존재 한다 P450 산화 효소 시스템의 부 화
    1. 인큐베이션 혼합물 포함, 4 ° C에서 0.75 mL의 최종 볼륨, 다음 화합물 및 효소 시스템에 준비 합니다.
      1. 10mm NADPH 또는 NADPH를 생성 시스템 (10 m m MgCl2, 10 m m D-포도 당 6 인산 염, 10mm NADP+, 1 U/mL D-포도 당 6 인산 염 효소) 100 m m 인산 염 버퍼, pH 7.4 (0.375 mL) 혼합 (75 µ L).
      2. 이 혼합물 microsomes에 추가 또는 곤충 세포에서 분리 된 microsomes는 Supersomes에 순수한 재조합 P450 재조합 P450 효소, 50 µ L microsomal 또는 supersomal에서 50 pmol P450 효소의 cDNA를 포함 하는 잠재 구조와 페 준비-고립 된 실험실에서 또는 상업적인 소스에서 간장 microsomal 분수.
      3. 1 mg 송아지 흉 선 DNA (재고 솔루션-3.3 mg/mL 증류수에의 0.3 mL), 추가 하 고 5 소용돌이 통에 흔들어 s.
      4. 마지막으로, 추가 7.5 µ L 0.1 m m 테스트 ellipticine 마약 DMSO와 42.5 µ L에 녹아 증류수 0.75 mL의 인큐베이션 혼합물의 볼륨에 도달. 사용 화학 물질 3H 표시 또는 adducts 14C 또는 DNA의 검출에 대 한 절차에 따라 unlabelled 화학 물질.
      5. 5 미 품 30-60 분 동안 37 ° C에서 열린된 튜브에 대 한 소용돌이 통에 흔들.
      6. 또한 활성화 시스템 (microsomal 샘플) 없이 또는 (ii)와 함께, 하지만 화합물 테스트 없이 (i) 하지만, 마찬가지로, 두 개의 제어 외피를 준비 합니다.
  2. 감소 효소 시스템의 dna 테스트 화학 (발암 물질/의약품)의 외피
    1. 인큐베이션 혼합물 포함, 4 ° C에서 0.75 mL의 최종 볼륨, 다음 화합물 및 효소 시스템에 준비 합니다.
      1. 4 ° C에서 100 mM Tris HCl을 혼합 버퍼, pH 7.4, 0.2% 포함 된 트윈 20, (0.375 mL), 10 m m 솔루션 NQO1 감소 효소 (NADPH)의 공동 인자의 (75 µ L), cytosolic 분수 (간장 cytosolic 분수-실험실에서 또는 cytosolic 사용 하 여 격리 분수에 그들은 1 mg 단백질 (50 µ L)를 포함 하는 상업적인 소스에서 가져온 개별 인간 기증자 로부터 격리).
      2. 1 mg 송아지 흉 선 DNA (재고 솔루션-3.3 mg/mL의 증류수의 0.2 mL), 추가 하 고 5에 대 한 셰이 커에 흔들어 s.
      3. 마지막으로, 추가 7.5 µ L 0.1 m m 테스트 화학 물질 (화합물의 용 해도 따라 증류수, 메탄올, 에탄올 또는 DMSO, 해산)와 인큐베이션 혼합물을 위해 0.75 mL의 볼륨에 도달 42.5 µ L 소 주 물. 사용 화학 물질 3H 표시 또는 14C 또는 unlabelled 화학 물질, DNA의 검출에 대 한 절차에 따라 adducts (아래 참조).
      4. 1 분 30-60 분 동안 37 ° C에서 닫힌된 관에 5 미 품에 대 한 통에 쉐이크에 대 한 아르곤으로 반응 혼합물을 제거.
      5. 또한 활성화 시스템 (cytosolic 분수) 없이 또는 (ii)와 함께, 하지만 테스트 화학 물질 없이 (i) 하지만, 마찬가지로, 두 개의 제어 외피를 준비 합니다.
  3. 테스트 화학 물질의 과잉을 제거 하는 유기 용 매와 인큐베이션 혼합물의 추출
    1. 이러한 용 매를 추가 하 여 에틸 아세테이트 (diethyl 에테르 또는 헥 산)의 동일한 볼륨 캡 테스트 튜브에 인큐베이션 혼합 믹스. 에멀젼 형태까지 튜브의 내용을 통에 흔들.
    2. (3 분) 1600 x g 주위 온도에 원심 분리기에서 회전 합니다. 유기와 수성 단계 제대로 구분 하지 않습니다, 경우 더 긴을 위해 한 번 더 회전 기간 또는 더 높은 원심에서 속도.
    3. 수집을 피 펫을 위, 유기 단계를 제거 합니다. 만약 작은 볼륨 (< 400 µ L)는 적당 한 팁을 장착 한 자동 피 펫을 이용 사용. 이 유기 단계 옆으로 캐스팅.
    4. 반복 단계 2.3.1., 2.3.2., 고 2.3.3. 질소 가스의 흐름에 의해 잔류 유기 용 매를 제거 (제거의 5-10 분 이상 필요).
  4. 외피에서 DNA의 분리
    1. 페 놀/클로 프롬과 솔루션와 에탄올과 그것의 강 수에서 DNA의 추출
      1. 단백질 외피 혼합물에서 페 놀, 페 놀/클로 프롬 (1:1)와 DNA의 솔루션에서 단백질을 추출 하 여 DNA를 분리 하 고 아래 표시 된 절차에 의해 클로 프롬을 제거 합니다.
      2. 페 놀 또는 페 놀/클로 프롬 (1:1)는 팔 콘에서 모자와 함께 Eppendorf 관의 동일한 금액에 부 화 혼합 결합. 에멀젼 형태까지 혼합물을 저 어.
      3. (3 분) 1600 x g 주위 온도에 원심 분리기에서 회전 합니다. 유기와 수성 단계 제대로 구분 하지 않습니다, 경우 더 긴 기간 동안 또는 높은 원심 분리 속도에서 한번 더 스핀.
      4. 새로운 폴 리 프로필 렌 튜브에는 피 펫과 위 물 단계를 전송 합니다. 만약 작은 볼륨 (< 400 µ L)는 적당 한 팁을 장착 한 자동 피펫으로 활용 사용. 유기 단계 함께 단백질 인터페이스를 제거 합니다.
      5. 위 물 단계를 결합 하 여 동일한 양의 페 놀과 클로 프롬 (1:1)의 혼합물. 2.4.1.2 단계를 재현 합니다. -2.4.1.4.
      6. 클로 프롬 및 반복 단계 2.4.1.2 동일한 양의 위 물 단계를 결합 합니다. -2.4.1.4. 감기 (-20 ° C) 에탄올의 2 볼륨을 강 수에 의해 DNA를 복구 합니다. DNA 솔루션의 볼륨을 결정 합니다.
      7. 5 M 마지막에 염화 나트륨의 추가 의해 여러차례 양이온의 농도 적응 0.1 M.의 농도 저으 적극적으로. 감기 (-20 ° C) 에탄올의 2 볼륨으로 결합 하 고 제대로 혼합. -20° C에 냉각
      8. DNA를 침전 될 때까지-20 ° C에서 저장 합니다. 때 DNA는 외피 동안 조각화 (., 효소 활성화 반응 동안 산소 래 디 칼의 형성에 의해) 또는 작은 DNA의 크기에 격리 과정 (< 1 킬로바이트) 때 DNA는 작은 금액에 존재 하는 또는 (< 0.1 mg / mL), 냉각 시간 증가 하 고-70 ° c 온도 감소
      9. (10 분)에서 1600 x g 0 ° c 원심 분리기에서 회전 합니다. 있으면 DNA 낮은 농도에 또는 작은 파편의 형태로, 더 긴 기간 (30 분)에 대 한 한 번 더 회전 합니다. 폐기는 상쾌한.
      10. 제거 하려면 모든 용액 (또는 화학 시험의 잔여 흔적)는 침전 된 DNA에 있을 수 있습니다, 70% 에탄올과 에테르 diethyl DNA를 씻어. 워시 DNA를 시 켰 던 감기 (-20 ° C)와 70% 에탄올. (10 분)에서 1600 x g 0 ° c 원심 분리기에서 회전 합니다. 폐기는 상쾌한.
      11. 2.4.1.10 단계를 반복 합니다. 워시 DNA를 시 켰 던 감기 (-20 ° C)와 70% 에탄올. (10 분)에서 1600 x g 0 ° c 원심 분리기에서 회전 합니다. 폐기는 상쾌한.
      12. 2.4.1.10 단계를 반복 합니다. 잔여 상쾌한을 제거 하는 흡수 성 종이에 수직 상태로 튜브를 넣어. 고립 된 DNA에서 화학 시험의 잠재적인 잔류물을 삭제 하도록 diethyl 에테르의 1 mL을 추가 하 여 DNA 펠 릿을 세척. (10 분)에서 1600 x g 0 ° c 원심 분리기에서 회전 합니다. 폐기는 상쾌한.
      13. 적절 한 볼륨에서 DNA 펠 릿을 분해 (보통 0.5-DNA 농도 달성 하기 위해 µ L 100-400에서에서 1 µ g / µ L) 증류수 (또는 0.15 m m 나트륨 구 연산 염 및 1.5 m m 염화 나트륨). DNA 솔루션 4 ° C에서 하룻밤, 설 수 또는 DNA를 녹이는 증가 10-30 분에 대 한 37 ° C에가 열 될 수 있습니다.
      14. 중지 및 재개 DNA 솔루션의 수에 있는 감소에서 결과 adduct 농도 반복 하기 때문에 저장 하기 전에 작은 aliquots (10-20 µ L)으로 DNA를 구분 합니다. -80 ° C에 또는 추 저장 합니다.
        참고: DNA의 Spectrophotometric 결정: 간단 하 고 정확한 방법, 널리 샘플은 순수한 경우는 준비에서 DNA의 양을 측정 하는 데 사용 되는 (, 상당한 양의 단백질, 페 놀, 등 기타 오염 물질 없이 핵 산), DNA의 UV 방사선의 양의 spectrophotometric 측정 기초 (이전에 설명한 절차 참조)에 의해 흡수 된다28.
  5. DNA의 검출에 대 한 절차 adduct 형성
    1. 32 P postlabeling 분석 결과
      참고: DNA 가수분해의 분석 adducts (2.5.1)에 대 한 뿐 아니라 일반 (수정된) deoxynucleotides (2.5.7)의이 단계에서 준비의 활용 합니다.
      1. ~ 450 단위 (U)의 농도에 물에서 micrococcal nuclease (미네소타) 녹 / mL. 증류수에 대 한 dialyze 하 고 300 U/mL을 조정 합니다. 비장 포스 (SPD) 솔루션 dialyze 고 4 U/mL을 조정 합니다.
      2. 최종 농도 150 뮤 / µ L MN 및 2.5 뮤 / µ L SPD (MN/SPD 솔루션) 미네소타와 SPD를 믹스. DNA 솔루션 12.5 µ g를 포함 하 고 건조 한 증발 기에서 증발. 6.5 µ L 소 주 물에 용 해.
      3. 5.0 µ L MN/SPD 솔루션 추가 (미네소타의 최종 농도 60 무 / µ L, SPD의 최종 농도 1 무 / µ L), 및 1.0 µ L 소화 버퍼 (나트륨 호박의 최종 농도 20 mM, CaCl2 의 최종 농도 8 m m). 혼합물의 마지막 볼륨은 12.5 µ L. 믹스 하 고 37 ° c.에 3 h에 대 한 반응을 허용
      4. 제거 더 희석 및 수정 되지 않은 deoxynucleotides (2.5.7)의 분석에 대 한 2.5 µ L (다른 튜브에 전송)
    2. Nuclease P1 농축 절차
      1. 나머지 10.0 µ L, 0.65 µ L 나트륨 아세테이트 버퍼 (최종 농도, 40 m m), 0.65 µ L ZnCl2 솔루션 추가 (최종 농도 0.1 m m), 1.25 µ L NP1 솔루션 (최종 농도, 0.385 µ g / µ L), 및 0.45 µ L 증류수. 혼합물의 마지막 볼륨 13 µ L입니다.
      2. 37 ° C에서 30 분 동안 반응 혼합물을 허용 고 트리 스 솔루션의 3 µ L의 추가 가진 반응.
    3. n-Butanol 농축 절차
      1. DNA의 나머지 10.0 µ L을 11.6 m m 염화 편대 솔루션, pH 3.5, 25 µ L 10 m m 미정 염화 솔루션의 215 µ L를 추가 합니다. 250 µ L n추출-butanol 활발 한 혼합 하 여 (물으로 포화). (3 분)을 별도 도면층, 상위 n을 1600 x g 에서 스핀-butanol 층. 250 µ L n한 번 더 추출-butanol (물으로 포화), 회전, 위쪽 n이륙-butanol 층 및 전 추출 물과의 결합.
      2. 400 µ L 물 추가 ( n포화-butanol)이 추출, 그리고 적극적으로 혼합. 레이어를 분리 하 고 수성 레이어 삭제를 스핀. 물 400 µ L를 사용 하 여이 세척 절차를 반복 ( n포화-butanol). N250 mm Tris HCl 솔루션, pH 9.5, 3 µ L를 추가-butanol 층. N증발-butanol 주위 온도에서 증발 건 고 하.
      3. 100 µ L n에서 잔류물을 디졸브-butanol, 다시, 증발 건조 하 고 16.0 µ L 물에 잔류물을 디졸브.
    4. 라벨의 adducts
      1. Bicine 버퍼 솔루션 (라벨 버퍼)의 1 µ L와 4.5 µ L 100 µCi [γ-32P] ATP, 차가운 ATP의 45 pmol 10.0를 포함 하는 혼합의 추가 U의 T4-PNK (T4-phosphonucleotide 키 니 아 제) 16.0 µ L 솔루션 NP1 또는 butanol 농축 혼합에서. 시 약의 최종 농도 다음 것입니다: 20 m m bicine, 10 m m MgCl2, 10 m m dithiotreitol, 0.5 m m spermidine, 그리고 0.5 U / µ L T4-PNK, 3 µ M ATP. 혼합물의 총 볼륨 20 µ L입니다.
      2. 실 온에서 30 분 동안 반응 혼합물을 허용 한다. 전체 샘플을 적용 (. 20 µ L) 페이 셀 루 로스 TLC 판에 (2.5.6.).
    5. NP1 또는 n 의 효능 평가-butanol 절차 강화
      1. 워시 50 µ L 물 관의 하단. 거기에 설정에 30 s 및 1600 x g 에서 원심 분리기에서 회전 (1 분)에 대 한 적극적으로 혼합 뚜껑에 오염이 없음 이다. 페이-셀 루 로스 TLC 판 (20 x 20 cm)에 5 µ L를 자리. 그래서 (NH4)2솔루션 280 m m를 사용 하 여 크로마 토 그래프4 와 50mm NaH24, pH 6.8.
    6. Adducted deoxynucleotides의 TLC 분리
      1. 증류수와 사전 세척 TLC 번호판입니다. 특히 집에서 만든 번호판에 대 한는 것이 좋습니다.
        참고:이 세척 한다 실시 플레이트, 배경, 특히 용 매 앞에 상승 수 색에서에서 노란 색을 제거 하.
      2. 페이-셀 루 로스 TLC 판에 전체 샘플 하 고 시작 크로마토그래피 (2.5.4.); 정리 adducts D1 및 d 2 방향 (그림 2)에서 접시를 개발 하 여 수행 됩니다.
      3. D1 방향 (그림 2)에서 접시를 개발 합니다. 사용 1.7 M 나트륨 인산 염 버퍼, pH 6.8, DNA adducts 되도록는 TLC 판의 시작에 잔여. 비슷하게,이 버퍼를 사용 하 여 d 2 방향에 접시를 개발 합니다. 에 대 한 내용은 절차에 대 한 가능한 버퍼, 여러 종류의 해상도 대 한 설명 참조 솔루션 adducts20,28.
        참고: d 2 방향에서 격판덮개의 개발 생략할 수 있습니다.
      4. 착 색 인쇄기 2 개의 연속 목욕에서 약 5 분 후 이온된 수에 접시를 씻어. 그 후, 접시 건조.
      5. D 3와 d 4 방향으로 3.5 M 리튬 편대 버퍼, pH 3.5 사용 하 여 접시를 개발, D3 방향에 대 한 8.5 M 요소 및 0.5 M Tris HCl 버퍼, pH 8.0, D4 방향 (그림 2)에 대 한 0.8 M LiCl과 8.5 M 요소를 포함. 용은 TLC 격판덮개 adduct 관광 명소를 개발 하기 위해 조정 해야 합니다. D 3와 d 4 개발 절차에 대 한 가능한 버퍼에 대 한 정보를 설명 하는 여러 종류의 해상도 adducts23,,2425,28솔루션 참조.
      6. D4 방향과 물 세척에서 개발 후 D4에 어떤 문제를 피하기 위해 1.7 M 인산 나트륨, pH 6.0 (보통 방향 D5 개발으로 할당 된), 종이 심지 (12 x 11.5 cm)의 상단에 있는 (D4) 따라 번호판을 개발 합니다.
        참고: D5 방향 생략할 수도 있습니다. 이 경우에, 그것은 TLC 탱크 용 매는 TLC의 상단에 도달 했습니다 때 열고 최대 60 분에 대 한 실행을 허용 하는 데 필요한. 이 메서드는 심지 (d 4에 어떤 문제 든 지 삭제 하 많은 실험실에서 자주 사용 하는 메서드)를 추가 하는 것 보다 더 나은.
    7. 가수분해 후 정상 (수정된) deoxynucleotides의 정량화
      1. 희석의의 약 수 (에서 2.5.1. DNA 가수분해를 설명) 증류수와 (., 2.5 µ L에서 소화 혼합물의 2.5.1. 250 µ L을 조정 하 고이 솔루션의 10 µ L 150 µ L를 조정).
      2. 5 µ L (10 pmol 정상적인 deoxynucleotides)이이 다이제스트의 aliquot, 2.5 µ L 10 mM Tris HCl 버퍼, pH 9.0, 및으로 레이블 추가 2.5.4. (혼합물의 최종 볼륨은 10 µ L). 실 온에서 30 분 동안 반응 수 있습니다.
      3. 4 µ L 혼합물의 aliquot 그리고 10 mm Tris HCl, pH 9.0 750 µ L를 희석. 믹스 및 스핀 뚜껑의 오염 없이 설치. 페이-셀 루 로스 TLC 판에 5 µ L를 적용 합니다. 그래서 TLC 판 280 mM (NH4)2의 솔루션 개발4 와 50mm NaH24, pH 6.5. TLC 후 건조를 허용 합니다.
      4. 4 수정 되지 않은 deoxynucleotide 두번째 인산 염을 지역화 하려면 주위 온도에 약 45 분 동안 수행 되는 autoradiography를 사용 합니다. 액체 섬광 또는 계산 Cerenkov 정량화를 위해 자리를 잘라.
    8. 친척의 계산 adduct 라벨 (RAL)
      1. Adduct 명소에 개수와 분류 되지 않은 (일반) deoxynucleotides의 약 수에 수의 값을 결정 합니다.
        참고: 후자 전, adduct 레벨의 RAL 값을 평가 대 한 수정 되지 않은 (일반) deoxynucleotides의 수에 적용할 변환 계수는 그림 보다는 물자 더 적은 180000 건의 결정 됩니다 있다. RAL의 DNA adducts 위의 방정식 (2)에 따라 계산 됩니다.
    9. 바인딩 테스트 발암 물질 또는 약물 표시 된 방사성 의약품을 사용 하 여 dna의 검출
      1. 3H 또는 화학 물질과 액체 섬광 계산 하 여 수정 하는 DNA의 14C 방사능 평가 합니다.
      2. DNA 솔루션의 10-50 µ L 섬광 유리병에 섬광 솔루션의 3 mL를 추가 합니다. 잘 믹스. 섬광 카운터를 사용 하 여 방사능을 측정 합니다.

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Representative Results

그들의 공유의 결과로 중간체를 대사에 화학 물질 (발암 물질/약)의 효능을 조사 하 효소 촉매 활성화 (즉, P450, 과산화 효소, reductase)의 활용에 대 한 여기에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 DNA에 바인딩 (세대의 DNA adducts), 우리 (대 한 검토 보고,29,,3031), 항 암 에이전트 ellipticine의 약리 작용의 (i)는 소설 메커니즘을 확인할 수 있었다 (ii) 두의 병 인 nephropathies 식물 알칼로이드 aristolochic 산 (Aristolochic acid 신 장병 그리고 발칸 반도 풍토 성 신 장병) (대 한 검토 보고,32,,3334에 의해 발생 하는 위 urothelial로 암과 연관 된 35,,3637,,3839), 및 (iii) 고 차적인 메커니즘의 공기 오염 물질 3-등 여러 가지 발암 물질의 발암 성 nitrobenzanthrone (3-NBA)40,41,,4243,44,45 및 감소 대응, 3-aminobenzanthrone (3-ABA),46 ,,4748 식물 알칼로이드 aristolochic 산,32,33,34,35,,3637 , 38 , 39 그리고 향기로운 아민 oanisidine. 49 , 50 , 51 , 52 추가, 이러한 화학 물질의 생물 학적 효과 결정 하는 효소 결정 했다 설명된 방법을 채용.

여기, 대표 P450s에 의해 ellipticine의 산화 활성화에 결과 화학식의 세대의 결과로 peroxidases adducts DNA와 DNA covalently, 표시 되는 대사 산물을 3-NBA의 감소.

식물 알칼로이드 ellipticine (5,11-디 메 틸-6H-pyrido [4,3-b] carbazole) 및 그 유도체는 세포 주기 검거와의 유도로 포함 하는 여러 메커니즘을 통해 DNA 손상 마약 행위로 antitumor 에이전트 (에 대 한 개요, 참조29,,3031) apoptosis. 이 작업에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여, 우리 항 암 약물 화학식 DNA 생성 시연 대사 bioactivation microsomal P450s에 의해 촉매 후 adducts (그림 3)과 peroxidases (그림 4)29, 30 , 31 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59 , 60 , 61, 그리고이 암 세포30에 대 한이 에이전트의 강한 효율성을 설명 했다. [3시간]-방사선된 ellipticine과 nuclease P1 버전 32P postlabeling 기술을 주로 연구29,,3031,53 활용 했다 ,61. Subcellular 효소 시스템, 효소 저 해제 및 기술된 프로토콜, 주된 DNA를 형성 하는 반응 종 산화 ellipticine adducts P450 효소 및 구조를 활용 하 여 실험에 순수한 효소 복잡 한 연구를 사용 하 여 이러한 반응 종 했다 특징이29,30,,3155. 검사 P450s의 인간의 CYP3A4 효소는 ellipticine 12-hydroxyellipticine 13-hydroxyellipticine, ellipticine-12-ylium 및 ellipticine-13-ylium 자연 분해 ellipticine 대사 산물으로 산화에 가장 효율적인 DNA (그림 5)에 바인딩. 55 , 61 는 CYP 효소 또한 9-hydroxyellipticine, 해독 대사 산물, 7-hydroxyellipticine 및 ellipticine N2여겨지는 등 추가 대사 산물을 생성-미성년자로 형성 되는 산화물 ellipticine 대사 산물입니다. 9 hydroxyellipticine 7-hydroxyellipticine 및 ellipticine N2-산화물은 주로 의해 형성 된 CYP1A1 및 CYP2D6, 각각. 55 , 57 , 58

Peroxidases (, 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP), lactoperoxidase (LPO), myeloperoxidase (MPO) 및 cyclooxygenases (c o X-1와 c o X-2)) 같은 생성 하는 ellipticine 대사 ellipticine 파생 된 DNA adducts (그림 4)61 그림 5에 표시 하는 메커니즘으로

Nitroaromatic 3-NBA (3-니트로-7H-벤츠anthracen-7-1) 디젤 배기 가스의 구성 요소 이며 공 수 입자62,,6364에서 발견 된다. 이 오염 물질, 3-ABA,,6465 의 주요 대사 산물은 오랜 시간63에 대 한 디젤 배기 가스에 드러낸 소금 광산의 노동자의 소변에서 발견 되었다. 이 시연 3 NBA에 이들이 근로자 노출 됐다. 이 nitroaromatic는 intratracheal 점67후 쥐에 폐 종양을 발생합니다. 3 NBA는 또한 돌연 에임스 살 모 넬 라 typhimurium 테스트 (스트레인 YG1024 nitroreductase 및 Ooverexpressing-acetyltransferase), nanomole 당 6 백만 이상의 revertants이 스트레인62에서 생성에 역할을 합니다. 차적인 힘 또한 입증 되었다의 세대에 의해 공유 adducts DNA 생체 외 와 활성화 후이 일, 그리고 vivo에서 설치류 동물 (그림 6의 여러 기관에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 여러 효소에 의해 )39,40,41,42,43,44,45,,4647 64,,6768.

3 NBA 파생 된 DNA adducts 형성 후 cytosolic reductases (즉, NQO1)와 3 NBA 활성화 nuclease P1 n에 의해 측정 되었다- 32P postlabeling 메서드는 프로토콜의 butanol 농축 방법 이 연구에서 제시 하는. 결과 최대 5 개의 DNA의 형성 adducts 표시 (adduct 그림7에서 명소 1-5), 그리고 3 명은 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-aminobenzanthrone 특징 이었다 (다-N6-C2-ABA; adduct 1 자리), N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-aminobenzanthrone (dG-N2-C2-ABA; 자리 3 adduct) 및 N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone (dG-C8-N-ABA; adduct 명소 4. 그리고 5) (그림 7 그림 8). 32P postlabeling 메서드는 dG의 nuclease P1 버전 활용-C8-N-ABA (adduct 명소 4와 5) 탐지 (그림 7 그림 8). 32P-postlabeling의이 버전의 몇 가지 제한 사항이 발생, 즉이 결과 밑줄는 adducted deoxynucleotides의 (해당 되는 경우) 낮은 검출 nuclease P1에 의해 dephosphorylated (즉, adducts 동안 arylamines 또는 N-hydroxyarylamine-파생 상품에 향기로운 nitroderivatives의 감소에 의해 산화 대체 deoxyguanosine의 c 8에). Ellipticine와 연구와 마찬가지로, 우위 한이 작업에 설명 된 프로토콜을 사용 하는 실험에서 표준 adduct subcellular 효소 시스템, 효소 억제제, 순수한 효소와 DNA와 복잡 한 연구를 활용 하 여 cytosolic 3 NBA에 의해 생성 된 대사 산물을 3-NBA를 metabolizing 생성 DNA adducts, 즉, 3-NBA (N-오-ABA)의 감소에 의해 형성 된 반응성 대사 산물 및 3 개의 DNA의 구조 adducts 효소를 감소 되었다 (그림 7 의 특징 그리고 그림 8)입니다. 간에서는, 생체 외에서 3 NBA의 bioactivation 하 여 인간의에 주로 기인 NQO1 쥐 발견 (그림 7), 인간의 N, 동안 NAT2,Oacetyltransferases (Nat), NAT1, sulfotransferase (SULT), SULT1A1 및에 낮은 범위, SULT1A2는 단계 II 3 NBA42활성화의 주된 효소. 간장 microsomal POR 3 NBA41의 활성화에 효과적 이기도 하지만 마우스 3 NBA이 microsomal POR42보다 NQO1 주로 bioactivated. 3 NBA 발암67대상 조직 이다, 폐에서 NQO1와 XO 줄일 3-NBA 생성 DNA adducts 대사 산물. 그러나, XO이 기관69의 사소한 3 NBA 활성화 효소로 보인다.

Figure 1
그림 1: 32P postlabeling 분석 결과의 체계. 32P postlabeling 방법 및 그것의 향상 된 절차의 각 단계에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: DNA의 패턴 adduct 페이 셀 루 로스 TLC 판에 차입. 페이-셀 루 로스에 multidirectional 크로마토그래피의 DNA adducts 접시 같습니다. 출처는 페이 셀 루 로스 TLC 판에 시작 위치입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 32P postlabeling 분석의 DNA adducts 송아지 흉 선 DNA ellipticine, NADPH와 쥐 (A)와 (B) 인간 간 microsomes incubated에 형성, (C) 컨트롤 샘플 microsomes 없이. Adducts 1과 2를 화살표로 할당 ellipticine microsomes 활성화 하 여 DNA에 deoxyguanosine에 생성 됩니다. 32 (단계 2.5.2.) 메서드의 nuclease P1 버전 고용 수행한 P postlabeling 기원 하단 왼쪽된 모서리에 있습니다 (위쪽 및 왼쪽에서 오른쪽에 D4를 하단에서 D3). D 2가 생략 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 32P postlabeling 분석 ellipticine 중재 DNA adducts. 송아지 흉 선 DNA ellipticine (100 µ M)와 양 고추냉이 과산화 효소 (A), 반응 형성 Adducts 소 lactoperoxidase (B), 인간의 myeloperoxidase (C), 양 cyclooxygenase-1 (D), 인간의 cyclooxygenase 2 ( E) (5 µ g peroxidases는 외피에 참석 했다), 간 (bw) (F), 킬로그램 체중 당 40 mg ellipticine 송아지 thymus DNA에서에서 치료 하는 쥐의 DNA ellipticine와 인간의 CYP3A4 반응에서 (G), 13- hydroxyellipticine(H), ellipticine N2-(), 산화 및 12-hydroxyelipticine (J). 실험의 분석 결과 (단계 2.5.2.) nuclease p 1 버전을 사용 하 여 수행 했다 기원 하단 왼쪽된 모서리에 있습니다 (위쪽 및 왼쪽에서 오른쪽에 D4를 하단에서 D3). D 2가 생략 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: peroxidases에 의해 ellipticine의 산화와 CYPs ellipticine 대사 산물 및 그 제안 생성 DNA adducts. 괄호 안에 화합물 하지 않은 여전히는 실험에 사용 된 실험 조건에서 감지 하 고 그들은 DNA 궁극적인 종 바인딩 postulated electrophilic 대사 산물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6:의 신진 대사 활성화 및 DNA adduct 형성 3-nitrobenzanthrone 여. 3 NBA 3-nitrobenzanthrone; NQO1, NAD (P) H:quinone oxidoreductase; NAT, N,O-acetyltransferases; SULT, sulfotransferase; CYP, 시 토 크롬 P450. POR, NADPH: 시 토 크롬 P450 oxidoreductase; HRP, 양 고추냉이 과산화 효소; LPO, lactoperoxidase; MPO, myeloperoxidase; C o X-1, cyclooxygenase-1. R =-COCH3 또는-그럼3H; 다-N6-ABA, 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-aminobenzanthrone; dG-N2-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-aminobenzanthrone; dG-C8-N-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: 32P postlabeling 분석 3 NBA 파생 된 DNA adducts. Nuclease P1-(왼쪽 패널)과 n-butanol 추출 버전 (오른쪽 패널) 방법의 활용 했다. A는 , Ab, adducts thymus DNA 쥐 간 cytosols와 활성화 후 3-NBA (300 μ M)와 반응에서 형성 된 종 아리. B는a Bbadducts 송아지 흉 선 DNA, 인간의 간 cytosol (풀링된 분수)와 활성화 후 3-NBA (300 μ M)와 반응에서 형성. C는 Cbadducts 송아지 흉 선 DNA, 순수한 쥐 키 모와 활성화 후 3-NBA (300 μ M)와 반응에서 형성 NQO1 (0.09 대). D는a Db, adducts 송아지 흉 선 DNA, 인간의 재조합 NQO1와 활성화 후 3-NBA (30 µ M)와 반응에서 형성 (0.06 단위). E는 , Eb에서 형성 된 연어 adducts testis DNA N-오-ABA 치료. F는a Fbadducts 형성된에 간 야생-타입 littermates C57BL/6 배경 3-NBA kg 들어 당 2 밀리 그램에 노출에 DNA 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8: 32P postlabeling 분석 3 NBA 파생 DNA adduct 표준 [dG-N2-C2-ABA (A), 다-N6-C2-ABA (B)와 dG-C8-N-ABA (C)] (패널은)의 구조 3-NBA 및이 3 NBA DNA adducts (고 패널 b)입니다. N-방법의 butanol 추출 버전 이용 되었다 (패널에). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 논문에서는, 그것은 대사 중간체, 화학식 DNA의 세대에서 발생 하는 bioactivated 것 화학 물질의 효능 연구를 광범위 하 게 액세스할 수 있는 방법론 adducts 시연입니다. 이것은 중요 한 문제, 환경 화학 물질의 힘 이나 공유 DNA를 생성 하는 대사 산물을 그들의 효소 활성의 약물의 평가 adducts 때문에 암과 치료의 개발에 중요 한 필드입니다. 종양 개발의 원인으로 간주 하는 발암 물질에 의해 DNA의 수정입니다 지금은 발암 물질에 의해 발생 하는 발암의 중앙 교리로 판단 됩니다. 이 제안 결과, 현상 등의 다양 한에 의해 확인 되는: (i)은 발암 성 속성 다양 한 발암 물질의 대사 산물 DNA;에 및 센터와 반응에이 화합물의 bioactivation 의존 (ii) 수준의 DNA adducts 자주 많은 발암 반응을;에 해당 (iii) 그리고 특정 종양 억제기 유전자에 여러 proto-oncogenes의 활성화 돌연변이 발암 성 potencies와 화학 물질과 그들의 수정에 의해 발생할 수 있습니다. 또한, 항 암 약물에 의해 DNA의 화학식 수정 가장 효율적인 DNA 손상의 효과 이러한 약물 암 치료에 그들의 사용에 어떤 결과의 한으로 증명 되었습니다.

차적인 특성, 공유 DNA를 형성 하는 그들의 potencies adducts, 화학 제품의 성공적인 평가 결정 하는 두 가지 중요 한 포인트를 구체적으로 있다: (i)를 해결, 그리고 효소의 효율 특성 시스템 발암 물질/약 electrophilic 종 바인딩, DNA 및 (ii) 개발 하 고 있는 발암 물질/마약-DNA adducts 가장 적합 한 기술을 사용 하 여 및 센터는 발견 하 고 구조적 특징을 활성화 할 수 있습니다. 이 연구에서 두 기능에 대 한 적절 한 방법은 설명 합니다.

생물학적 효소 (microsomal 또는 cytosolic 샘플 보유 P450s와 추가 bioactivating 효소 즉, peroxidases 또는 reductases POR NQO1, XO, AO)를 포함 하는 세포질 분수에 대 한 격리 절차에 대 한 프로토콜 효소 시스템 (dna 외피), 및 그들의 사용 같이 대표 결과 의해,이 작품에 표시 된 화학 물질의 차적인 속성의 평가 대 한 그들의 적합성 테스트 발암 물질/약의 bioactivation.

또한, 탐지 및 정량화의 적합 방법 32P postlabeling 기술 (nuclease P1-와 n-butanol 추출 절차)의 두 가지 농축 버전 등의 사용 dna adducts 방사성으로 분류 시험된 화합물 발암 물질/약 xenobiotics의 genotoxicity를 평가 하는 연구에 대 한 적절 한 수를 표시 했다.

Adducts 화학식 DNA의 결정에 관하여,이 두 가지 방법, 뿐만 아니라 다른 방법을 위해 검출 및 측정의 DNA adducts 적당 한 설립된8,,7071,72 ,73,74,75,76,77,,7879,80,81 , 82. 1981 년까지 DNA의 정량화 adducts 사용된 방사성 화학 물질 (발암 물질/의약품), 3H 또는 14C에 의해 표시 된 종합적으로 준비 되었습니다. 이러한 방법을 이용 되었습니다 유용 ellipticine 함께 연구에 대 한이 작업에 설명 된 대로 (53,54참조). 그럼에도 불구 하 고, 그것은 일반적으로 그들의 성공적인 사용73,,8081에 대 한 높은 방사능과 파생 상품을 준비할 어렵습니다. 따라서, 비록이 절차는 아직도 사용 하 고, 불행 하 게도 여기에 설명 된 것과 유사한 실험 체 외에 제한 됩니다. 다른 기술, 질량 분석, 전자 분무 이온화 (ESI), 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화 (MALDI), 가속기 질량 분석 (AMS), 형광, immunoassay, 및 32 와 같은 생물 학적 방법 P postlabeling 세부 사항에,이 연구에서 설명 되었다 개발 (검토, 참조8,16,70,,7172,73, 74,75,76,77,,7879,80,81,82).

뿐만 아니라 생체 외에서 실험에 적용 있다 32P postlabeling 분석 결과이 작품의 프로토콜에서 설명 표시 됩니다 (표시 대표), 즉, 새로운 화합물 genotoxicity 또는 기계적 테스트 발암 물질/의약품 활성화의 조사는 하지만 또한 더 사용률은 환경 발암 물질에 노출, 평가 등 종양 개발, DNA, DNA 검사의 복구 감시의 메커니즘에 대 한 연구 생에 의해 손상 화합물 및 산화 반응에 대 한 응답 환자의 세포 독성 항 암 제를 조사 하 고 약72,83.

그러나이 기술은 아니다,, 몇 가지 제한73없이. 되지 않은 monodeoxynucleotides로 안정, dna, 병 변은 안정적으로 확인할 수 없습니다. 32P postlabeling 메서드는 DNA의 구조를 식별 능력이 adduct. 따라서, DNA의 구조 특성 adducts 자주 보여주는 알려진 구조의 합성 기준 가진 그들의 공동 착 색 인쇄기에 의존. 사실, 그러한 방법의 대표적인 결과이 작품 (ellipticine, 3-NBA)에 표시 된 두 예제에서 사용 되었다.

결론적으로,이 작품에 표시 된 프로토콜 환경 화학 제품의 효능 평가를 적당 한 방법으로 간주 될 수 있습니다 또는 효소 bioactivated 공유 DNA를 생성 하는 대사 산물을 되도록 약물 adducts에 대 한 매우 중요 한 과정은 암과 치료의 개발입니다.

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Disclosures

저자는 공개 상관이 있다.

Acknowledgments

이 연구는 체코 과학 재단 (GACR, 그랜트 17-12816S)에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40

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