Un modèle mini-Invasive pour analyser Endochondral Fracture de guérison chez des souris dans des Conditions biomécaniques

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Summary

Ce protocole décrit une technique d’ostéosynthèse mini-invasive utilisant une vis intramédullaire pour stabilisation normalisée des fractures du fémur, qui peut être utilisé pour analyser des os endochondral guérison chez les souris.

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Histing, T., Bremer, P., Rollmann, M. F., Herath, S., Klein, M., Pohlemann, T., Menger, M. D., Fritz, T. A Minimally Invasive Model to Analyze Endochondral Fracture Healing in Mice Under Standardized Biomechanical Conditions. J. Vis. Exp. (133), e57255, doi:10.3791/57255 (2018).

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Abstract

Modèles de guérison osseuse sont nécessaires pour analyser les mécanismes complexes de guérison pour améliorer le traitement des fractures cliniques de fracture. Au cours de la dernière décennie, une utilisation accrue des modèles de souris dans la recherche orthopédique a été notée, très probablement parce que les modèles murins offrent un grand nombre de souches génétiquement modifiés et des anticorps spéciales pour l’analyse des mécanismes moléculaires de la guérison des fractures. Pour contrôler les conditions biomécaniques, techniques d’ostéosynthèse bien caractérisés sont obligatoires, aussi chez les souris. Nous rapportons ici, sur la conception et l’utilisation d’un OS fermé modèle de guérison pour stabiliser les fractures du fémur chez la souris. La vis intramédullaire, en acier inoxydable de qualité médicale, fournit par le biais de compression fracture une stabilité axiale et de rotation par rapport aux broches intramédullaire simple utilisé pour la plupart, qui montrent un manque de stabilité axiale et de rotation. La stabilité obtenue par la vis intramédullaire permet l’analyse des os endochondral guérison. Une grande quantité de cals, reçu après une stabilisation avec une vis, offre des conditions idéales à la récolte de tissus pour des analyses biochimiques et moléculaires. Un autre avantage de l’utilisation de la vis est le fait que la vis peut être insérée dans le fémur avec une technique mini-invasive sans provoquer de dommages aux tissus mous. En conclusion, la vis est un implant unique qui peut idéalement servir dans fracture fermée modèles offrant des conditions biomécaniques normalisées de guérison.

Introduction

Études de guérison osseuse chez la souris sont en grande demande en raison d’un large spectre des anticorps et des animaux génétiquement modifiés. Ces faits permettent d’étudier les mécanismes moléculaires de l’OS guérison1. En quelques années, des os différents modèles de guérison pour les souris ont été mis au point2. Ces modèles peuvent être divisés en modèles ouverts, dans lequel l’os sont osteotomized à l’aide d’une approche chirurgicale latérale ouverte et dans des modèles fermés, où l’os sont rompue basés sur le modèle de la rupture introduit par Bonnares et Einhorn3. En utilisant cette technique, une rupture transversale normalisée peut être produite par un dispositif de flexion 3 points et les implants intramédullaire peuvent être insérés par une incision de petites parapatellar médiale dans une technique mini-invasive en évitant un traumatisme majeur de tissus mous.

La vis intramédullaire peut être appliquée pour la stabilisation de la fracture fermée chez la souris. La vis offre une stabilité de rotation et axiale. Ceci est réalisé par compression de la fracture par un thread proximal et distale tête4. D’autres avantages de la vis sont la simple technique chirurgicale, l’implant le bas grade d’invasivité, le faible poids et, surtout, une plus grande stabilité, fournissant des conditions biomécaniques normalisées et contrôlées par rapport aux autre intramédullaire 5les implants. En fait, dans les modèles de fracture plus fermées, les fragments sont stabilisés uniquement par broches simples, qui est associé à un manque de stabilité de rotation et axiale et un risque élevé de goupille et également de fracture luxation. Il peut considérablement influencer le processus de guérison, ce qui peut aboutir à une guérison retardée ou formation non syndiqués.

Il est bien connu que la stabilité de la fixation de la fracture a un impact énorme sur le processus guérison6,7. Une fixation rigide élevé entraîne guérison intramembranaires, tandis qu’une fixation moins rigide, ce qui autorise les micro-mouvements de l’écart de la fracture, résultats dans la guérison des os endochondral. Stabilisation de la rupture avec la vis intramédullaire montre principalement un endochondrale guérison avec une grande quantité de cals, particulièrement après 2 semaines de guérison des fractures. La possibilité de récolter une grande quantité de cals permet l’analyse de plusieurs paramètres par différentes techniques.

Nous rapportons ici, sur la conception et l’application de la vis intramédullaire chez la souris, ainsi que sur ses avantages et inconvénients dans les études expérimentales sur la guérison des os endochondral normal.

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Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux lignes directrices du National Institutes of Health pour l’utilisation des animaux d’expérimentation et suivi les directives institutionnelles (Landesamt für Verbraucherschutz, Zentralstelle Amtstierärztlicher Dienst, Saarbrücken, (Allemagne).

1. élaboration d’Instruments chirurgicaux et d’Implants

  1. Sélectionnez une lame de bistouri Swann-Morton (taille 15), un petit écouvillon, pinces fines, une aiguille de 27 G, une suture non résorbable 5-0, ciseaux et un porte aiguille dans la zone de l’instrument de microchirurgie.
  2. Déballez la vis intramédullaire, le fil de guidage (0,3/0,2 mm de diamètre, 10 cm de longueur), la foret de centrage (0,5 mm de diamètre) et la perceuse à main (Figure 1, voir Table des matières).
    Remarque : La vis intramédullaire (0,5 mm de diamètre, 17,2 mm de longueur) est faite d’acier inoxydable de qualité médicale pour une implantation rétrograde dans le fémur. La vis a un filetage proximal (0,5 mm de diamètre, longueur 4 mm) avec un nez (0,2 mm de diamètre, longueur 0,4 mm) à l’extrémité et distale conique tête (0,8 mm de diamètre, longueur 0,9 mm) pour réaliser la compression fracture ainsi que stabilité axiale et de rotation.
  3. Exposer les implants et tous les instruments chirurgicaux à une solution désinfectante (96 % d’alcool) pendant 5 min ou stériliser (stérilisation à la vapeur, 130 ° C, 25 min). Après la désinfection ou la stérilisation, placer les instruments sur un tissu de l’opération. Positionner le tissu de l’opération directement adjacent à la table de la petite exploitation animale.

2. les animaux, anesthésie et analgésie

  1. Choisissez la souche, âge et sexe des souris selon la question de l’étude dont il est question.
    Remarque : Les souris CD-1 mâles âgés de 12 à 14 semaines ont été utilisées pour cette étude. Le poids du corps approprié d’utiliser la vis intramédullaire est entre 25 et 35 g.
  2. Anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine xylazine et 75 mg/kg de 15 mg/kg. Confirmer l’anesthetization de pincement de l’orteil. Appliquer du lubrifiant oculaire pour protéger les yeux des animaux de séchage pendant l’anesthésie. Après l’induction de l’anesthésie, placez votre souris sous un radiateur thermique pour maintenir la température corporelle constante. Au cours de la procédure, animaux ont été suivies avec pincée d’orteil répétées pour assurer un plan approprié de l’anesthésie.
  3. Appliquer le chlorhydrate de tramadol dans l’eau potable (1,0 mg/mL) pour l’analgésie de 1 jour avant la chirurgie jusqu’au jour 3 après la chirurgie.
    Remarque : Prévention de l’analgésie et l’infection doit être en accord avec les orientations respectives du pays et l’institution où les essais sont à effectuer.

3. intervention chirurgicale et l’Implantation de vis intramédullaire

  1. Avant la chirurgie, raser la jambe postérieure droit et appliquer une crème dépilatoire. Après 5 min, retirez la crème et nettoyer la jambe avec de l’eau. Ensuite, appliquez une solution désinfectante avec 96 % d’alcool. Bétadine ou chlorhexidine peut être ajouté à l’alcool pour assurer une asepsie complète.
  2. Dans des conditions aseptiques, placez votre souris en décubitus dorsal sur la table de la petite exploitation animale. Pliez le genou droit afin de permettre une approche antérieure des condyles du genou. Effectuer une incision de 5 mm parapatellar médian au niveau du genou droit à l’aide de la lame de bistouri.
  3. Mobiliser le ligament rotulien délicatement avec la lame de bistouri Swann-Morton et l’écouvillon. Ensuite, déplacer la rotule latéralement avec la pince fine pour exposer l’encoche bicondylienne du fémur.
  4. Ouvrez l’encoche bicondylienne exactement au milieu du fémur entre les deux condyles. Veillez à ne pas dépasser 1,0 mm d’épaisseur pour le trou de forage.
    1. Démarrage manuel de forage à une vitesse lente et un dévoiement à 45 ° sur le ventre à l’axe du fémur en utilisant la 0,5 mm centrage foret et la perceuse à main (Figure 1 et D, Figure 2). Au cours du forage, continuellement diminuer l’angle de décalage de 0 ° (parallèle à l’axe de l’os du fémur). Arrêter lorsqu’est atteint 1,0 mm de profondeur de forage.
  5. Après l’ouverture de l’os à l’encoche bicondylienne, insérer l’aiguille 27 G dans la cavité intra-médullaire sur toute la longueur du fémur. Alésez la cavité intra-médullaire du fémur manuellement par le biais de mouvements de rotation de l’aiguille de 27 G. Pousser l’aiguille vers l’avant pour perforer l’os cortical au grand trochanter proximale.
  6. Retirer l’aiguille 27 G et appliquer le guide métallique par l’intermédiaire de la partie distale du fémur.
    1. Faire une incision de la peau avec une lame de bistouri Swann-Morton (taille 15) dans la partie proximale sur le fil-guide et poussez le fil-guide vers l’avant jusqu'à ce que les deux extrémités du fil-guide sont à l’extérieur. Veillez à garder le fil-guide en place.
  7. Créer une fracture fermée définie à l’aide de la guillotine.
    1. Placez votre souris en position latérale avec la jambe droite sous la guillotine. Assurez-vous que la pièce diaphysaire du fémur est placée au milieu de la guillotine.
    2. Déplacez le poids (200 g) de la distance définie de 25,5 cm.
  8. Contrôler la configuration de la fracture et fracture position ainsi que la position du fil-guide (Figure 3) à l’aide de l’appareil de radiographie (voir Table des matières).
  9. Raccorder la vis intramédullaire avec le nez à l’extrémité distale pour le fil de guidage 0,2 mm et insérez-le dans le fémur sous pression continue et la rotation dans le sens horaire.
    1. Cisaillement de l’arbre de transmission lorsque le couple suffisant est atteint.
    2. Enlever le fil de guidage dans la partie proximale.
  10. Repositionner la patella et fixer le tendon rotulien aux muscles avec une suture simple utilisant un 5-0 et le synthétique, monofilament, suture de polypropylène. Utiliser des sutures simples de même taille et de matériel pour refermer la plaie. La réduction des fragments et la position de la vis par examen radiologique à l’aide de l’appareil de radiographie de contrôle (voir Table des matières).
  11. Garder les animaux sous le radiateur thermique jusqu'à ce qu’ils récupèrent de l’anesthésie. Ne laissez pas les animaux sans surveillance jusqu'à ce qu’ils ont repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus ventral. Rentrer les animaux cages unique dans l’animalerie. Ne pas retourner les animaux à la compagnie d’autres animaux durant les premières 24 heures, même si ils ont pleinement récupéré de l’anesthésie.
  12. Surveiller les animaux soigneusement tous les jours. Maintenir à l’aide de chlorhydrate de tramadol dans l’eau potable avec une dose de 1,0 mg/mL pendant les trois premiers jours de l’analgésie postopératoire. Continuer l’analgésie si, au jour 4 après la chirurgie, les animaux montrent toujours des signes de douleur, comme indiqué par la vocalisation, agitation, manque de mobilité, échec de toiletter, posture anormale et manque d’intérêt normal dans un cadre. Mettre fin à l’analgésie lorsque les animaux sont sans douleur.
  13. À la fin de l’expérience euthanasier l’animal par une surdose de barbituriques.

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Representative Results

La durée de fonctionnement de l’incision cutanée de blesser la fermeture a 20 min. La chirurgie peut être effectuée sans un stéréomicroscope. Après l’opération, les animaux ont été surveillés tous les jours. Analgésie post-opératoire a été résilié après 2 jours, parce qu’aucun des animaux présentaient des douleurs après cette période de temps. Les animaux ont aussi supportant le poids normal en 2 jours après la chirurgie. Les infections de plaie n’ont pas été observées au cours de la période d’observation tout.

Analyses radiologiques après que 2 semaines a montré une évidente formation de cals, combler le fossé de la fracture (Figure 4 a). Après 5 semaines, la fracture était guérie, et le périoste CAL a été presque entièrement rénové (Figure 4 b).

Des analyses histologiques de la Cal et la zone de fracture après 2 semaines a montré la distribution tissulaire typique d’endochondrale guérison avec tissu cartilagineux, construit au cours du processus de chondrogéniques et tissus osseux (Figure 5 a). Après 5 semaines, le tissu cartilagineux a disparu, et l’OS tissé est converti en l’OS lamellaire afin de reconstituer l’anatomie normale et charge les propriétés de l’OS (Figure 5 b).

Analyses biomécaniques après que 2 semaines indique une rigidité en flexion de 37 % par rapport à l’os non fracturés controlatérale. Après 5 semaines, la rigidité en flexion était presque 100 % indiquant la guérison complète (Figure 6).

Figure 1
Figure 1 : les Implants. A. l’intramédullaire vis (0,5 mm de diamètre, 17,2 mm de longueur) avec le fil (diamètre 0,5 mm, 4 mm de longueur) et le nez (0,2 mm de diamètre, longueur 0,4 mm) proximal et une cône tête (0,8 mm de diamètre, longueur 0,9 mm) distale. B. le fil de guidage (0,3/0,2 mm de diamètre, longueur 10 cm). C. le centrage foret (0,5 mm de diamètre). D. la perceuse à main. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : schéma des condyles du fémur indiquant l’entrée de point pour la vis intramédullaire. Condyles du fémur avec l’encoche antéro-postérieur bicondylienne Découvre (à gauche) et vue sagittale (à droite). La Croix (à gauche) indique le point d’entrée pour la vis intramédullaire, la flèche (à droite) indique le décalage de 45 ° à l’axe du fémur pour commencer le forage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : radiographie du fémur avec une rupture transversale et le fil-guide inséré. Radiographie montre la configuration de rupture transversale dans la partie diaphysaire du fémur (flèche) et le fil de guidage dans la cavité intra-médullaire combler la fracture. Barres d’échelle représentent 5 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : radiographies après 2 à 5 semaines de cicatrisation osseuse. A. analyse radiographique d’un fémur stabilisé avec la vis après 2 semaines, ce qui démontre la formation de cals évidente. B. analyse radiographique d’un fémur stabilisé avec la vis après 5 semaines, démontrant une guérison presque complète de la fracture avec le remodelage du cal. Barres d’échelle représentent 5 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : coupes histologiques après 2 à 5 semaines de cicatrisation osseuse. A. analyse histologique d’un fémur stabilisé avec la vis après 2 semaines, ce qui démontre la distribution tissu typique au cours de l’os endochondral guérison avec cartilage (c) et (b) le tissu au sein du cal osseux. B. faire une analyse histologique d’un fémur stabilisé avec la vis après 5 semaines, ce qui démontre la transformant presque complète d’os lamellaire. Les coupes histologiques sont colorés selon le procédé trichrome. Barres d’échelle représentent 1000 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : analyse biomécanique. Analyse biomécanique de la rigidité en flexion après 2 semaines (barre blanche, n = 9) et 5 semaines (barre noire, n = 8). Rigidité de flexion est indiquée en pourcentage sur le fémur non fracturée controlatéral. Données sont données comme moyenne ± écart-type de la moyenne (SEM), * p < 0,05 vs 2 semaines. Après avoir prouvé l’hypothèse d’une distribution normale (Kolmogorov-Smirnov-test) et de variance égale (F-test), la comparaison entre les deux groupes expérimentaux a effectué un test de t Student´s. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Des étapes critiques de l’approche chirurgicale sont à trouver le point d’entrée correct pour l’implantation de vis au milieu des condyles du fémur à l’encoche bicondylienne ainsi que l’orientation optimale de l’aiguille parallèle à l’axe de l’OS pour l’alésage de la cavité intra-médullaire. Pour éviter une position entrée incorrecte, le chirurgien doit préparer l’encoche jusqu'à l’obtention d’une vue optimale. Pour contrôler l’orientation au cours de l’alésage, le fémur des souris se tienne avec les doigts dans une position stable. Une autre étape critique est l’insertion de la vis dans le fémur sur le guide métallique, parce que le fil-guide échappe du fragment proximal osseuse aboutissant à une luxation de la fracture. Dans ce cas, le chirurgien peut essayer d’enfiler les fragments d’OS nouveau, mais cette manœuvre est le plus souvent sans succès, et les animaux doivent alors être exclus de l’étude.

En outre, l’approche chirurgicale peut-être développer des complications. Par exemple, le ligament rotulien, qui se déplace latéralement pour obtenir une vue optimale sur les condyles, peut se rompre. Pour cela, suture du ligament après insertion de la vis. Pendant l’ouverture de l’os à des condyles et alésage de la cavité intra-médullaire, les condyles risquent d’éclater. Dans ce cas, il n’y a aucune possibilité de dépannage, car la vis ne peuvent pas être fixée de façon appropriée à l’extrémité distale et la compression de la fracture n’est pas atteint. Une autre complication est la dislocation du fil-guide inséré ou une mauvaise position de l’OS. Cette complication peut être réduite en gérant avec précaution et par analyse radiographique après l’insertion pour confirmer le placement correct pendant la chirurgie. En outre, le chirurgien doit faire attention que la vis est insérée complètement car une saillie de la vis peut restreindre la mobilité de la souris ou réduire la compression de la fracture. Par conséquent, un appareil de radiographie est obligatoire pour l’intervention chirurgicale. Seuls les animaux après confirmation radiographique à la fin de la chirurgie devraient figurer dans le protocole de l’étude.

Suppression de la vis intramédullaire à la fin de l’expérience peut être effectuée sans aucune difficulté, car la tête de la vis peut être reliée à un instrument spécial de retrait ou, alternativement, la vis peut être enlevée aussi avec le porte-aiguille.

Une des limites de la technique sont que la vis intramédullaire est fournie par l’entreprise uniquement en unique taille d’une longueur définie de 17,2 mm et donc la taille du fémur doit être considérée. Une autre limitation sur l’utilisation de la vis intramédullaire est qu’in vivo micro calculé tomographie-(CT) ou des analyses de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) du processus de guérison sont pratiquement impossibles en raison de l’implant, qui affecte l’image qualité. Par conséquent, ces analyses ne peuvent être effectuées qu’après l’euthanasie et le retrait de l’implant à la fin de la période d’étude. Enfin, la vis ne peut servir à analyser la guérison osseuse défaut, parce que la stabilité axiale est obtenue par la compression des fragments osseux par le thread proximal et distal chef.

Études de guérison osseuse utilisent soit ouvert8,9,10,11,12,13,14 ou fermé4,15, 16,OS de17 modèles de guérison. Modèles de guérison osseuse ouverte permettent une fixation plus rigide des fragments par rapport à l’OS fermé modèles, ce qui entraîne une plus grande quantité de guérison intramembranaires sans une formation de cals prononcé de guérison. Parce que les modèles ouverts sont associés à la formation de cals peu, ces modèles peuvent être pas préférés dans les expériences qui nécessitent de plus grandes quantités de cals pour analyses biochimiques et moléculaires. Un autre désavantage des modèles ouverts est la nécessité d’une approche latérale invasive avec un traumatisme majeur de tissus mous. En revanche, l’utilisation d’un modèle fermé requiert uniquement un petit moins incision invasive. Jusqu'à présent, seulement quelques modèles fermés existent dans la souris2.

Dans l’OS fermé modèles de guérison, surtout une tige intramédullaire simple est utilisée. Cependant, cette technique présente des inconvénients distincts. Plus particulièrement, le manque de stabilité axiale et de rotation. Cela peut entraîner un hétérogène de réponse guérison5. Même si cet inconvénient est connu pour influencer les résultats expérimentaux18, des études récentes, qui ont l’intention d’analyser les mécanismes de cicatrisation osseuse, toujours utilisent des modèles murins dans lequel la rupture est stabilisée seulement avec une épingle ou reste-t-il encore non stabilisée7 . Nous pensons que techniques d’ostéosynthèse stable, comparables à celles utilisées en pratique clinique, devraient également être utilisés chez les souris. Pour atteindre une stabilité axiale et de rotation, la vis intramédullaire a été développée qui induit la compression de la fracture par une tête distale et un thread proximal. D’intérêt, l’application de la vis intramédullaires ne produit pas une fixation rigide, et, ainsi, la rigidité torsionnelle de fémurs fracturées stabilisé avec la vis intramédullaire est significativement plus faible par rapport à celle du fémur fracturé stabilisé par un fixateur externe ou un blocage de la plaque5. Cependant, il faut une fixation moins rigide pour étudier endochondrale la guérison osseuse, car seulement une fixation moins rigide permet les micro-mouvements des fragments osseux, qui provoquent l’endochondrale processus de guérison. Néanmoins, comme indiqué dans un précédent ex vivo study, la vis intramédullaire produit une stabilité axiale et rotation distincte. Des analyses biomécaniques ont révélé que la vis intramédullaire permet d’obtenir une rigidité torsionnelle de 0,34 ± 0,18 Nmm / °, ce qui est nettement plus élevé par rapport à qui atteint avec une épingle classique (± 0,00 0,00 Nmm / °)5. Ainsi, la vis intramédullaire présentée ici est le seul implant qui peut être utilisé dans une technique mini-invasive et qui fournissent des conditions biomécaniques normalisées pour la guérison des fractures endochondrale étude chez la souris.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par RISystem AG, Davos, Suisse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mouse Screw RISystem AG 221,100
Guide wire RISystem AG 521,100
Centering bit RISystem AG 590,205
Hand drill RISystem AG 390,130
Cotton-Swab (150 mm, small head) Fink Walter GmbH 8822428
Suture (5-0 Prolene) Ethicon 8614H
Forceps Braun Aesculap AG &CoKG BD520R
Scissors Braun Aesculap AG &CoKG BC100R
Needle holder Braun Aesculap AG &CoKG BM024R
27 G needle Braun Melsungen AG 9186182
Scalpel blade size 15 Braun Aesculap AG &CoKG 16600525
Heat radiator Sanitas 605.25
Depilatory cream Asid bonz GmbH NDXZ10
Eye lubricant Bayer Vital GmbH 2182442
Xylazine Bayer Vital GmbH 1320422
Ketamine Serumwerke Bernburg 7005294
Tramadol Grünenthal GmbH 2256241
Disinfection solution (SoftaseptN) Braun Melsungen AG 8505018
CD-1 mice Charles River 22
X-ray Device Faxitron MX-20, Faxitron X-ray Corporation 2321A0988
Fracture device small RISystem AG 891,100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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