Un'analisi di citometria-basata di flusso per identificare i composti che interrompono il grippaggio del Ligand di Chemokine CXC fluorescente etichettati 12 al recettore di chemochine CXC 4

Biology

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Summary

Un flusso di analisi basate su cytometry cellulare obbligatoria è descritto che è utilizzato principalmente come uno strumento di screening per identificare i composti che inibiscono il legame di un ligando di chemochine CXC fluorescente contrassegnato 12 (CXCL12) al recettore di chemochine CXC 4 (CXCR4).

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Schoofs, G., Van Hout, A., D'huys, T., Schols, D., Van Loy, T. A Flow Cytometry-based Assay to Identify Compounds That Disrupt Binding of Fluorescently-labeled CXC Chemokine Ligand 12 to CXC Chemokine Receptor 4. J. Vis. Exp. (133), e57271, doi:10.3791/57271 (2018).

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Abstract

Targeting farmacologica dei recettori accoppiati a proteine G (GPCR) è di grande importanza per la salute umana, come segnalazione disfunzionale GPCR-mediated contribuisce alla progressione di molte malattie. La coppia di ligando/recettore ligando di chemochine CXC 12 (CXCL12) / recettore delle chemochine CXC 4 (CXCR4) ha sollevato interesse clinico significativo, per esempio come un potenziale bersaglio per il trattamento di cancro e di malattie infiammatorie. Piccole molecole come pure gli anticorpi terapeutici specificamente destinate a CXCR4 e inibiscono la funzione del recettore sono pertanto considerati da preziosi strumenti farmacologici. Qui, un flusso cytometry cellulare test che permette l'identificazione di composti (ad esempio, piccole molecole) che abrogare CXCL12 associazione di CXCR4, è descritto. Essenzialmente, il dosaggio si basa sulla competizione per il recettore vincolante tra un importo fisso di CXCL12 fluorescente identificati, l'agonista di chemokine naturale per CXCR4 e composti senza etichetta. Quindi, in questo dosaggio è evitato l'uso indesiderabile di sonda marcata radioattivamente. Inoltre, le cellule viventi sono utilizzate come fonte di ricevitore (CXCR4) invece di preparazioni della membrana delle cellule. Questo consente il facile adattamento del dosaggio per un formato del piatto, che aumenta la velocità effettiva. Questo test ha dimostrato di essere un'analisi di scoperta del prezioso farmaco generico per identificare composti CXCR4-targeting. Il protocollo probabilmente può essere adattato ad altri GPCR, almeno se fluorescente contrassegnati ligandi sono disponibili o possono essere generati. Conoscenza preventiva riguardante le vie di segnalazione intracellulare che sono indotte all'attivazione di questi GPCR, non è necessario.

Introduction

I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono proteine di superficie delle cellule che possono essere attivati da ligandi extracellulari (ad es., peptidi, ormoni proteici, ammine), quindi molti fisiologici e di sviluppo che regolano i processi1. Quando un agonista occupa la tasca di associazione GPCR, il cambiamento conformazionale indotto nella proteina recettore promuove il legame di proteine intracellulari associata al recettore G eterotrimeriche, composto da Gα- PIL e subunitàβγ G. Il successivo scambio di GTP per PIL sui risultati di subunitàα G nella dissociazione delle subunità G proteine (Gα-GTP e Gβγ) che, a sua volta, ulteriormente avvierà a valle di segnalazione vie2,3. Quando il Gα-GTP diventa idrolizzato, ri-associazione il Gα- PIL e subunitàβγ G convertirà la proteina di G nel suo riposo di3,di stato4. Diversi tipi di proteine G esistano (Gs, G/ o, Gq, G12/13), che sono classificati basato su somiglianza di sequenza con la subunitàα di G5. Tutte queste proteine G indurre definite vie di segnalazione intracellulare che sottendono la risposta biologica per l'attivazione del recettore. A seguito di attivazione del recettore, chinasi GPCR (GRK) fosforilano la coda intracellulare dei GPCR, promuovendo in tal modo l'interazione con β-arrestins. Questo processo conduce alla cessazione di segnalazione, di desensibilizzazione e internalizzazione del recettore6G di proteine. Β-arrestins sono anche parte di complessi multi-molecolari che trigger segnalazione cascades indipendente di segnalazione7G di proteine.

GPCR sono tra i bersagli molecolari più convalidati per un intervento terapeutico, come deregolamentato GPCR-mediata di segnalazione, per esempio a causa di mutazioni con guadagno di funzione nel gene del ricevitore o sovraespressione del recettore, contribuisce all'eziologia di molti malattie umane8. Di conseguenza, GPCR rappresentano una delle più importanti classi di bersagli farmacologici studiati dall'industria farmaceutica8,9,10. Un esempio notevole di un GPCR clinicamente rilevante è il recettore di chemochine CXC 4 (CXCR4), che può essere attivato da un ligando naturale unico, le chemochine CXC (CXCL12) ligando 1211. A causa del suo ruolo stabilito come un importante co-recettore per il virus dell'immunodeficienza umana 1 (HIV-1) voce e infezione in cluster di differenziazione 4 (CD4) positivo T-linfociti12, CXCR4 in primo luogo è stato studiato come un bersaglio di farmaci antivirali. Interazione di CXCL12-CXCR4 nel midollo osseo inoltre regola la ritenzione e homing delle staminali e progenitrici delle cellule13. Inoltre, dato il suo coinvolgimento in molti aspetti del cancro biologia (ad esempio, la sopravvivenza delle cellule del tumore, metastasi, tumore-relativa angiogenesi)14 e diverse altre malattie umane (ad es., malattie infiammatorie)15, CXCR4 sollevato l'interesse significativo come un bersaglio promettente per la scoperta di nuovi farmaci. AMD3100, una piccola molecola che si rivolge specificamente CXCR4, inizialmente è stato scoperto come un anti-HIV farmaco candidato16 ed è ancora uno dei più potenti antagonisti CXCR4 descritti a data17. Suo sviluppo come un farmaco antivirale è stato, tuttavia, interrotto18. Attualmente questa molecola è usata come agente di mobilizzazione di cellule staminali durante il trattamento del mieloma multiplo e linfoma pazienti18. Diverse altre piccole molecole chimicamente indipendenti e biologics che inibiscono la funzione di CXCR4 con potenza variabile sono stati descritti19.

Metodi di associazione del ricevitore sono strumenti preziosi in farmacologia che permettono l'identificazione di composti (ad esempio, piccole molecole) che interagiscono direttamente con i GPCR di interesse. Al fine di eseguire studi di binding, non c'è nessuna necessità di conoscenza preliminare riguardante la proprietà di segnalazione intracellulare o la funzionalità di un determinato GPCR. Anche se questo può essere considerato un vantaggio, essa implica che composti per quale recettore può essere dimostrata associazione devono essere ulteriormente caratterizzata da valutare il loro potenziale attività agonista o antagonista. Questa attività può essere valutata utilizzando dosaggi farmacologici o biologiche legate alla GPCR sotto studio. Dipendente sul loro profilo di attività, molecole leganti del ricevitore potrebbero quindi potenzialmente evolvere per diventare composti di piombo romanzo per indagine negli studi pre-clinici e clinici. Molecole che si legano specificamente a un recettore ad alta affinità possono anche servire come scaffold per generare strumenti terapeutici o diagnostici, per esempio da radiolabeling li per l'imaging non invasivo in vivo del tumore le cellule20, o come potenziale veicoli per la somministrazione mirata di therapeutics21. In caso di CXCR4, è già stata dimostrata in vivo imaging delle cellule del tumore usando modelli murini in cui molecole di CXCR4-targeting con etichettate ha permesso la visualizzazione di cancro umano xenotrapianti20,22,23 .

In questo rapporto, descriviamo un protocollo dettagliato per un test di associazione di competizione che consente l'identificazione di piccole molecole e farmaci biologici che interferiscono direttamente con l'agonista (CXCL12) vincolante di CXCR4. Il principio di base del test è la competizione tra un importo fisso di ligando fluorescente contrassegnato (CXCL12AF647, Vedi tabella materiali e reagenti) e senza etichetta composti per il legame al recettore proteina17, 24. il segnale fluorescente specifico dal ligando con etichetta associato alle singole cellule che esprimono CXCR4 è quindi analizzato mediante citometria a flusso. Questo segnale fluorescente diminuisce quando adenoide piccole molecole disturbare l'interazione tra CXCL12AF647 e CXCR4. L'analisi utilizza le cellule viventi non manipolato che esprimono in modo endogeno CXCR4 (cioè, cellule Jurkat). Quindi, nessuna preparazione della membrana delle cellule è richiesta, che rende il dosaggio conveniente, veloce e compatibile con aumento della velocità. Poiché viene utilizzato un ligando fluorescente contrassegnato, radioattività è evitato.

Perché CXCL12 è l'agonista naturale per CXCR4, composti di piccola molecola che interferiscano con l'associazione di CXCL12AF647 nell'analisi sono probabilità di interagire con il sito di legame del recettore ortosterici (cioè, il sito di legame occupato dalla naturale agonista). Molecole che potrebbe interagire con siti di legame del recettore topograficamente distinti dal sito di legame ortosterici rimangano inosservati, se non influenzano il legame di CXCL12. Per esempio, modulatori allosterici positivi e negativi, una categoria importante ed emergente di GPCR targeting molecole che agiscono su allosterico associazione siti25, potenzialmente non verremo con questo test. Inoltre, se i composti identificati con questa funzione di analisi di associazione come antagonisti o agonisti non può essere derivato. Indagine dei composti identificati in ulteriori saggi relativi recettori farmacologici o funzionale così sarà richiesto. Queste analisi potrebbero includere (una combinazione di) analisi cellulare fluorescenza - o luminescenza-based per la rilevazione di secondi messaggeri (ad es., Ca2 +, monofosfato di adenosina ciclico (cAMP)), fenotipiche o saggi biologici e β-arrestina saggi di reclutamento, la cui scelta dipende dalle specifiche proprietà segnalazione dei GPCR sotto studio. Quindi, il saggio di legame competitivo descritto nel presente documento principalmente serve come un test di screening iniziale che deve essere integrata con altre analisi cell-based per consentire un'approfondita caratterizzazione di composti con potenza di legame del recettore.

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Protocol

1. manutenzione della coltura delle cellule

Nota: Tutti i passaggi descritti in 1 e 2 sono effettuati in condizioni di sterilità in un flusso laminare.

  1. Crescere le cellule in matracci di cultura T75 a 37 ° C e 5% di CO2 in un incubatore.
    Nota: In questo test, vengono utilizzate cellule Jurkat (cioè, cellule leucemiche umane del linfocita di T che esprimono in modo endogeno CXCR417). Espressione di CXCR4 alla superficie delle cellule dovrebbe essere valutata in tutto cellula coltura mediante citometria a flusso. Una descrizione della procedura di citometria a flusso e reagenti per determinare i livelli di espressione del recettore sulla superficie cellulare, tuttavia, non è nell'ambito del presente protocollo, ma è stato descritto in precedenza17.
  2. Ha lasciato le cellule Jurkat crescere in sospensione fino a quando raggiungono l'80-85% confluenza. Prima passaggio le cellule in un matraccio da romanzo, lasciare che tutti i reagenti raggiungano la temperatura ambiente (TA).
  3. Aggiungere 20 mL di fresca completa crescita medio (medium RPMI-1640, 10% siero bovino fetale (FBS), glutamina 2mm) in un matraccio di cultura T75 romanzo.
  4. Aggiungere 5 mL di sospensione cellulare Jurkat dal pallone originale T75 (contenente 25 mL di sospensione cellulare) al romanzo T75 matraccio di cultura. Incubare a 37 ° C e 5% di CO2 in un incubatore.

2. preparazione di CXCL12, tampone e cellule Jurkat per il concorso associazione Assay.

  1. Preparare una soluzione stock di CXCL12AF647 (20 µ g/mL; Vedi tabella materiali e reagenti) sciogliendo il reagente liofilizzato (conservato a-80 ° C, al buio) in acqua ultrapura completato con 0.01% (volume/volume) di polisorbato 20. Conservare le aliquote monouso da questa soluzione madre a-80 ° C, al riparo dalla luce.
  2. Preparare il tampone del saggio aggiungendo 40 mL HEPES (concentrazione di 1 M, 20 mM finale) di soluzione salina bilanciata di Hank 200ml (HBSS, 10x, senza rosso fenolo e senza bicarbonato di sodio, 1 x concentrazione finale). Aggiungete dell'acqua ultrapura per ottenere un volume finale di 2 L. aggiungere 4 g (0,2% peso/volume) albumina di siero bovino (BSA) e sciogliere la BSA via magnetica mescolando. Infine, regolare il pH a 7,4 (utilizzare NaOH per questo) e filtrare la soluzione attraverso 0,2 µm pori (Vedi tabella materiali e reagenti) utilizzando un collettore ad aspirazione.
    Nota: Questo tampone verrà essere utilizzato in tutte le fasi ulteriori del protocollo.
  3. Contare il numero e la vitalità delle cellule. Per questo, prendere un campione della sospensione cellulare e diluirla in tampone fosfato salino (PBS).
    Nota: Usiamo ordinariamente un analizzatore di attuabilità delle cellule automatizzato (Vedi tabella materiali e reagenti) in grado di contare le sospensioni delle cellule alle concentrazioni variabili. Per il conteggio delle cellule, diluire 0,5 mL di sospensione cellulare in 1,5 mL di PBS (sono possibili anche altre diluizioni, per esempio, 0,1 mL in 1,9 mL di PBS,). L'uso di questo metodo, che si basa il metodo di esclusione del colorante blu di trypan, è stato descritto in precedenza26. Molti altri dispositivi sono disponibili in commercio per contare il numero di cell e vitalità che dovrebbe funzionare altrettanto bene.
  4. Raccogliere il numero desiderato di cellule (cioè, ~ 24 x 106 cellule per eseguire il test con una piastra a 96 pozzetti completa) in una provetta sterile 50 mL mediante centrifugazione (Vedi tabella dei materiali e i reagenti per il tipo di centrifuga utilizzata) a 400 x g per 5 min a RT.
  5. Versare delicatamente il sovranatante senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere tampone fresco (ad es., da 20 mL) e risospendere le cellule pipettando delicatamente su e giù.
  6. Centrifugare le cellule ancora a 400 x g per 5 minuti a TA.
  7. Versare nuovamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare nel tampone fresco per ottenere una densità di 5 x 106 cellule/mL.

3. concorrenza Binding Assay

Nota: Il test di associazione effettiva competizione viene eseguito a RT e possono essere eseguite in condizioni non sterili.

  1. Diluire i composti sotto inchiesta nel tampone (Vedi 2.2) per ottenere la concentrazione desiderata. O preparare una concentrazione fissa di composto per lo screening iniziale (ad esempio, 10 concentrazione finale di µM) o, in alternativa, una serie di diluizioni seriali di concentrazioni per più dettagliate caratterizzazione dei composti (ad esempio, un 1/3, 1/4 o 1 / 5 serie di diluizioni a partire a 1 µM, concentrazione finale). Tenete a mente che la soluzione composta alla fine diventerà 2x diluito nel dosaggio; quindi, preparare una soluzione concentrata di 2x.
  2. Pipettare 100 µ l di soluzione composto (2x concentrato) in un chiaro 96 pozzetti fondo piatto rotondo (Vedi tabella materiali e reagenti) secondo un pre-definito laico sperimentale fuori (per esempio, Figura 1).
    Nota: In questa fase, i campioni di controllo positivi e negativi sono inclusi nell'analisi. Nel campione di controllo negativo, 100 µ l di tampone di dosaggio viene aggiunto invece composto dei pozzetti della piastra 96 pozzetti. Per il campione di controllo positivo, il tampone viene aggiunto anche durante questo passaggio. Vedi anche Figura 1 per un tipico layout sperimentale in cui viene testata una serie di diluizioni di diversi composti.
  3. Aggiungere 50 µ l di sospensione cellulare (Vedi 2.7; 0.25 x 106 cellule) da un serbatoio di reagente nella piastra 96 pozzetti usando una pipetta multicanale. Incubare la piastra per 15 min a RT nel buio.
  4. Aggiungere 50 µ l di CXCL12 fluorescente contrassegnati (cioè, 100 ng/mL di CXCL12AF647 in tampone, 4x concentrato, concentrazione finale di 25 ng/mL) da un serbatoio di reagente simile ai pozzetti della piastra 96 pozzetti. Incubare per 30 min a temperatura ambiente al buio.
    Nota: Per i campioni di controllo negativo, aggiungere tampone del saggio. Quindi, il segnale fluorescente rilevato nei campioni di controllo negativo corrisponderà il segnale di fondo di autofluorescent (Figura 1A). Per i campioni di controllo positivi, aggiungere 50 µ l/pozzetto di CXCL12AF647. I campioni di controllo positivo darà il segnale di fluorescenza massima rilevato, poiché nessun potenziale inibizione di pre-incubazione con composti era inclusa (Figura 1A).
  5. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 400 x g per 5 min a RT. rimuovere il surnatante dalle cellule pellettate di lanciare sopra la piastra. Asciugare la piastra su un tessuto.
  6. Aggiungere 200 µ l di tampone fresco da un serbatoio di reagente nei pozzetti usando una pipetta multicanale. Procedere immediatamente.
  7. Centrifugare la piastra ancora per 5 min a 400 x g a RT. rimuovere il surnatante da lanciare sopra la piastra e asciugare nuovamente sul tessuto.
  8. Delicatamente e risospendere il pellet cellulare in 200 µ l di 1% paraformaldeide disciolto in PBS. Questo passaggio consentirà di correggere le cellule.
  9. Continuare il protocollo immediatamente con la quantificazione della fluorescenza da citometria a flusso.

4. analisi dei campioni mediante citometria a flusso

CXCL12AF647 macchiato e fissate cellule ora sono pronte essere analizzati mediante citometria a flusso. Diversi tipi di citometri a flusso possono essere utilizzati, ma hanno bisogno di essere equipaggiata con il laser corretto (cioè, un laser rosso, eccitazione gamma ~ 630 nm) per eccitazione e filtri adatti per il rilevamento di fluoroforo (emissione filtri ~ 660 nm). Hanno bisogno di essere in grado di gestire campioni in un formato di piastra a 96 pozzetti. Esempi di dispositivi di citometria a flusso adatto sono forniti nella tabella materiali e reagenti.

  1. Avviare il dispositivo e aprire il software corrispondente (Vedi tabella materiali e reagenti).
  2. Selezionare i seguenti parametri cellulari possano essere visualizzati in un formato di punto della macchia: forward scatter (FSC), side scatter (SSC) e il canale di rilevamento fluoroforo (CXCL12AF647).
    Nota: Con il parametro FSC, le cellule sono discriminate base alle loro dimensioni, poiché l'assorbimento della luce rilevata è proporzionale al diametro della cella. Il parametro SSC, misura la dispersione della luce ad un angolo di 90°, fornisce informazioni circa la granularità delle cellule.
  3. Scegliere un campione (ad esempio, un campione di controllo negativo) di eseguire gating di una popolazione di cella definita omogeneo basata sui parametri FSC e SSC.
    1. Selezionare automatico iniezione di ~ 100 µ l di cellule fissate da questo campione di controllo negativo nel citometro a flusso. Selezionare l'opzione "miscelazione" prima dell'iniezione e utilizzare una portata del campione di 1,5 µ l/s.
    2. Esegui questo esempio selezionando "Acquisizione dati". I parametri FSC e SSC per questo esempio verranno visualizzato sullo schermo.
    3. Selezionare strumento di controllo del software. Basato sul FSC e SSC la visualizzazione dot blot, pre-definire una popolazione cellulare omogenea e praticabile di gating. A tale scopo, creare un poligono (utilizzando tool gating del software) che include le celle singole omogeneamente distribuite ("eventi") basate su queste due dimensioni.
      Nota: La procedura di gating mira a definire una popolazione cellulare omogenea e praticabile che verrà utilizzata per un'ulteriore analisi. Gating si basa sul presupposto che la maggior parte delle cellule vitali si forma una popolazione omogenea delle cellule basata sui parametri FSC e SSC. Eseguendo questo passaggio, detriti cellulari, cellule morte e aggregati cellulari in gran parte possono essere esclusi da ulteriori analisi. Un'illustrazione del processo di colata è dato in Figura 1B.
  4. Selezionare questa opzione per analizzare 20.000 "eventi" (cioè, cellule singole) per campione.
    Nota: Questo significa che per ogni campione, 20.000 celle che rientrano il cancello pre-definito saranno infine analizzate. Acquisizione di dati per ciascun campione continuerà fino a quando questo numero di eventi è analizzato.
  5. Avviare l'esecuzione (selezionare "Record dati"). Il dispositivo di citometria a flusso ora analizzerà tutti i campioni one-by-one registrando l'intensità media di fluorescenza (MFI) per ogni campione. Questo MFI corrisponde al segnale fluorescente medio corrispondente alle 20.000 celle che rientrano il cancello pre-definito.

5. analisi dei dati

Utilizzare l'IFM ottenuto per ciascun campione per eseguire tutti i calcoli successivi. Analisi dei dati di citometria a flusso può essere eseguita da diversi pacchetti software disponibili in commercio (vedere tabella materiali e reagenti).

  1. Per determinare la percentuale di inibizione del segnale fluorescente associazione, a seguito di composto pre-incubazione, applicare la seguente formula:
    Equation 1
    Dove:
    MFIExp = l'IFM di sperimentale (= composto-trattati) campione
    MFIPC = l'IFM del controllo positivo
    MFINC = l'IFM del controllo negativo
  2. Per determinare il valore di50 IC di un composto (cioè, la concentrazione del composto che può ridurre il segnale fluorescente associazione 50%), applicare la seguente formula:
    Equation 2
    Dove:
    Logconc.2 = registro di una concentrazione del composto che si traduce in meno del 50% di inibizione della differenza tra il valore MFI di PC e NC
    Logconc.1 = il log di una concentrazione del composto che si traduce in più del 50% l'inibizione della differenza tra il valore MFI di PC e NC
    Nota: In alternativa, in caso di composti altamente attivi, una curva dose-risposta che coprono diversi registri di grandezza può essere generata basato sull'IFM corrispondente a ciascuna concentrazione testata del composto. Mediante l'applicazione di montaggio di curva di regressione non lineare usando il software adatto (Vedi tabella materiali e reagenti), valori di IC50 quindi possono essere dedotto dalle curve generate. Nella Figura 3è riportato un esempio di questo approccio di analisi.

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Representative Results

Il flusso di lavoro generale del dosaggio associazione è presentato in Figura 1A. Un'illustrazione del tipo di dati di citometria a flusso ottenuti per tipi di campioni diversi in un esperimento standard (cioè, controllo negativo, controllo positivo e campione sperimentale) è raffigurata in Figura 1Be un layout possibili piastra per eseguire il dosaggio in un formato di piastra a 96 pozzetti è dato in Figura 1. L'incubazione delle cellule Jurkat, che esprimono in modo endogeno del ricevitore di chemokine CXCR4 (cioè, i GPCR di interesse in questo saggio), con quantità crescenti di CXCL12 fluorescente contrassegnati (cioè, CXCL12AF647) portato in aumentato livelli di fluorescenza (Figura 2), che riflette i livelli aumentati di grippaggio del ligand di CXCR4. Per dimostrare la specificità del recettore di CXCL12AF647 associazione, è stato usato un consolidate e specifiche del recettore CXCR4 antagonista (la piccola molecola AMD3100). Cellule Jurkat in primo luogo sono state pre-incubate con una serie di diluizione di 1/5 di AMD3100 che vanno da 0,064 ng/mL a 1.000 ng/mL, seguita da un'incubazione con una concentrazione finale di 25 ng/mL CXCL12AF647 (cioè, l'importo fisso di chemokine con etichetta ordinariamente usato per il test). Quindi, le cellule Jurkat sono stati ulteriormente trattate come descritto nel protocollo. Il segnale fluorescente (la media intensità di fluorescenza, MFI) dopo l'aggiunta dell'importo fisso di CXCL12AF647 alle cellule Jurkat pre-incubate, è stata ottenuta dall'analisi di citometria a flusso per tutti i campioni. Questo segnale fluorescente potrebbe quasi essere completamente inibito nel caso in cui le cellule Jurkat sono state pretrattate con la più alta concentrazione di AMD3100 (1.000 ng/mL). In questa circostanza, il livello inibito di fluorescenza era solo leggermente sopra il livello di sfondo corrispondente al livello di autofluorescenza per cellule Jurkat. In conclusione, l'applicazione di 25 ng/mL (concentrazione finale) di CXCL12AF647 nell'analisi della associazione generata una finestra grande segnale fluorescente (quando rispetto al controllo negativo) con un minimo livello residuo di non specifico recettore vincolante ( Figura 3A).

Questa analisi obbligatoria è stata utilizzata principalmente allo schermo per interrompere il grippaggio del ligand in pannelli composti senza etichetta con un'unica concentrazione fissa di composti, o per studiare l'effetto dose-dipendente di composti attivi. In quest'ultimo caso, l'obiettivo è quello di ottenere valori di50 IC (cioè, la concentrazione del composto che inibisce il segnale di collegamento del 50%), che riflettono la potenza di associazione dei composti. La figura 3 illustra come flusso cytometry dati ottenuti con questo test di associazione possono essere utilizzati per determinare la potenza inibitoria (in termini di IC50) di piccole molecole perturbare l'associazione di CXCL12 di CXCR4. Basato sull'inibizione dose-dipendente di CXCL12AF647 associazione di AMD3100, il valore di50 IC è stato determinato qui applicando l'analisi di regressione non lineare. In questo esempio, il valore calcolato di IC50 per AMD3100 corrisponde al 18.12 ng/mL. Perché in campagne di screening, la maggior parte dei composti selezionati in modo casuale si prevede di non inibire il legame di CXCL12AF647 di CXCR4+ Jurkat cells, un esempio di un inattivo composto inoltre è stato incluso in questo studio. Qui, la piccola molecola maraviroc, che esibisce attività potente di anti-HIV-1, agendo come un antagonista specifico per il recettore di chemochine CC 5 (CCR5)27, è stato testato con il test di associazione. Nessuna inibizione del segnale massima associazione fluorescente è stata rilevata dopo la pre-incubazione le cellule Jurkat con maravoric, anche a più alta concentrazione testato (100 ng/mL; Figura 3B). Nello stesso esperimento, una serie di diluizioni seriali di AMD11070, un'altra piccola molecola relativo alla AMD3100, ma con una migliore proprietà farmacocinetiche28, era inclusa. A differenza di maraviroc, una serie di diluizione di 1/5 da AMD11070 che vanno chiaramente da 0.0064 a 100 ng/mL e dose-dipendente ha inibito il grippaggio di CXCL12AF647 (Figura 3B).

Figure 1
Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro ed illustrazione del tipo di dati ottenuti. (A). le fasi principali del protocollo sono schematizzate per i campioni di controllo positivi e negativi e campioni composto-trattati. Campioni senza composto pre-incubazione e senza aggiunta di chemokine fluorescente contrassegnati (CXCL12AF647) sono inclusi per determinare la fluorescenza di fondo (auto) (campioni di controllo negativo). Campioni senza composto pre-incubazione, ma con aggiunta di un importo fisso di CXCL12AF647 vengono utilizzati per determinare il segnale di collegamento massima nel dosaggio (campioni di controllo positivi). Nei campioni trattati con composti, le cellule sono pre-incubate con composto prima dell'aggiunta di un importo fisso di CXCL12AF647. (B). il segnale di media associazione fluorescente è determinato dall'analisi di citometria a flusso delle cellule Jurkat. Da tutti gli eventi (cioè, cellule Jurkat) analizzati (pannello sinistro) viene utilizzato solo il segnale fluorescente da una gated sottopopolazione delle cellule per ulteriori analisi (pannello centrale). Pre-incubazione delle cellule con piccole molecole (ad es., AMD3100) inibisce il legame del ligando del recettore fluorescente contrassegnati e ciò consentirà di ridurre il segnale di collegamento massima (pannello di destra, mostrato in una rappresentazione di istogramma). (C). un layout possibile piatto quando si esegue il test di legame competitivo in un formato di piastra a 96 pozzetti. In questo caso, sei diversi composti (cpd 1 - 6) sono testati in una serie di diluizioni seriali 1/5 (in duplicato) che vanno da 1.000 nM fino a 0,32 nM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Associazione di CXCL12AF647 alle cellule Jurkat. Cellule Jurkat sono state incubate con quantità crescenti di CXCL12AF647, in assenza di pre-incubazione con composto. La fluorescenza media intensità (MFI, espressa in unità arbitrarie luce) ± SD è mostrato (n = 2). Adattamento alla curva è stata effettuata utilizzando utilizzando un modello di associazione totale uno-sito seguendo l'equazione di regressione non lineare

Equation 3

con Bmax (massima associazione specifica) = 18.345; Kd = 92,8 ng/mL; NS (versante del legame non specifico) = 2.139; e sfondo = 332.6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Inibizione del legame di CXCL12AF647 di composti attivi e inattivi. (A) Dose-dipendente l'inibizione di grippaggio di CXCL12AF647 pre-incubando le cellule con aumento delle concentrazioni di AMD3100, prima dell'aggiunta di 25 ng/mL CXCL12AF647. Nota che la massima ha inibito intensità media di fluorescenza (MFI; espressa in unità arbitrarie di luce) è ancora leggermente sopra la fluorescenza di fondo (auto) ottenuta per le cellule Jurkat (media ± deviazione standard (n = 3)). Adattamento alla curva è stata eseguita facendo uso di regressione non lineare con una pendenza variabile (quattro parametri) secondo

Equation 4

Ecco il versante di 1.313 e il calcolato IC50 è 18.12 ng/mL. (B). effetto Dose-dipendente di AMD11070 e maraviroc CXCL12AF647 associazione CXCR4+ Jurkat cellule (MFI ± SD (n = 3)). Curva di raccordo per la risposta AMD11070 è stata effettuata allo stesso modo con un versante di 1.458 e un valore di50 IC calcolato di 0.9052 ng/mL. Per la risposta di maraviroc, nessun adattamento è stato effettuato in data la mancanza di attività di questo composto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Rispetto ad altri tipi di analisi obbligatorie (i.e., associazione di saturazione ed esperimenti di binding cinetico), concorrenza analisi obbligatorie sono più adatte ai fini dello screening. Infatti, essi consentono la valutazione di grandi lotti di composti senza etichetta, per esempio piccole molecole, segnando la loro capacità di interferire con il legame di un importo fisso di un ligando del recettore con etichetta. Composti che si legano ad altri siti del ricevitore rispetto il ligando con etichettato potrebbero rimanere inosservati nel dosaggio. Anche se l'esperimento di associazione concorso descritto nel presente documento si concentra sul ricevitore di chemokine CXCR4 in particolare, probabilmente può servire come modello per la progettazione di analisi obbligatorie concorrenza per altri GPCR pure. Per esempio, il recettore di chemochine CXC 7 (CXCR7) è stato descritto come un recettore alternativo per CXCL12, capace di associazione CXCL12 con alta affinità29,30. Quindi, la chemochina con etichetta stessa (CXCL12AF647) come usato per il CXCR4 descritto analisi concorrenza obbligatoria può essere utilizzato per impostare la pagina di esperimenti di binding di CXCR7. Perché CXCR4 e CXCR7 condividere CXCL12 come ligando comune, sarebbe importante lavorare con modelli cellulari in cui è espresso solo uno di entrambi i ricevitori alla superficie delle cellule, al fine di valutare il legame al recettore specifico. Il nostro lavoro precedente ha dimostrato che le cellule Jurkat non mostrano espressione endogena di CXCR717. Così, nel dosaggio descritto qui per CXCR4, interferenza con l'associazione di CXCR7 è escluso.

Diverse caratteristiche chiave del concorso associazione test consentono di essere utilizzato come un veloce, iniziale, strumento per identificare piccole molecole che interferiscono con l'agonista di associazione a CXCR4 di screening. Uno dei vantaggi chiave del dosaggio è l'uso di intero, cellule viventi che esprimono il recettore di interesse. Questo consente di omettere la necessità per le preparazioni di alta intensità di lavoro della membrana cellulare. Inoltre, il basso livello di fluorescenza di fondo (auto) rilevato con le cellule Jurkat è benefico. Insieme alla finestra di grandi segnali ottenuta sopra l'aggiunta della quantità definita di sonda fluorescente contrassegnata, contribuisce ad un favorevole rapporto segnale-sfondo. Questo facilita la rilevazione di potenziale inibizione di associazione dai composti senza etichetta. Nel caso in cui questa analisi obbligatoria viene eseguita con altre cellule esprimenti CXCR4, consigliamo sempre di valutare questi parametri (fluorescenza di fondo, finestra di segnale) in anticipo come potrebbero differire da cellula a cellula. Il fatto che le cellule Jurkat esprimono in modo endogeno CXCR4 a un livello costante per lunghi periodi, lo rende un conveniente modello di cellulare. Lo stesso livello coerenza dell'espressione del recettore potrebbe essere ottenuto con i cloni cellulari trasfettate stabilmente. Al contrario, si sconsiglia l'uso di cellule trasfettate transientemente perché questo probabilmente porterà in una molto più ampia distribuzione di intensità di fluorescenza, meno cellule rispondenti nel dosaggio e meno coerenza tra esperimenti. Poiché non esistano nessun cellule Jurkat negative di CXCR4, specificità del legame del recettore di queste cellule è stata dimostrata da pre-incubazione con antagonisti dei recettori specifici ben consolidata (AMD3100 e AMD11070). Questi antagonisti sono strutturalmente diversi dal ligando con etichettato. Questo è importante perché, quando si utilizza la variante senza etichetta del ligando come concorrente, ligando sia marcata e non marcata potrebbe anche competere per il legame ai siti di legame non specifico potenzialmente presenti sulla superficie cellulare.

A parte l'ospite cellulare, molti altri aspetti del test descritto qui bisogno di essere presi in considerazione prima di iniziare a costruire un dosaggio simile per altri GPCR. fluorescente contrassegnate sonde destinate a GPCR sono state sviluppate come alternative per radioattivo sonde, ma sono attualmente disponibili solo per un numero limitato di GPCR e sono relativamente costosi. Inoltre, modifica dei ligandi del recettore naturale con fluorofori potrebbe alterare le proprietà di associazione rispetto alla molecola del genitore senza etichetta, soprattutto in caso di ligandi molto piccole (ad es., ammine) o piccoli peptidi31, 32. per esempio, in caso di piccoli ligandi, un linker è richiesto generalmente per separare il farmacoforo dal fluoroforo per consentire l'accesso a ortosterici del recettore vincolante sito31. Inoltre, la stabilità della sonda fluorescente del recettore complessa ha bisogno di essere presi in considerazione. Nella nostra esperienza, dopo 90-120 minuti (vale a dire, il tempo necessario per eseguire due piastre da 96 pozzetti consecutive), l'intensità di fluorescenza media per i pozzetti di controllo positivo in genere è ridotto del ~ 5% rispetto alla media di tutti i pozzetti di controllo positivo sul piastra, con valori anomali occasionali tra il 5 e il 10%.

Inoltre, l'attività intrinseca del ligando con etichettato è di importanza. Mentre gli antagonisti del ricevitore di visualizzare nessuna attività intrinseca sul recettore, con etichettati agonisti probabile inducono l'attivazione del recettore e, di conseguenza, internalizzazione dei recettori. Questo compromette la natura reversibile della interazione ligando-recettore33. Per ridurre al minimo possibili problemi con internalizzazione dei recettori, l'incubazione con il ligando con etichettato (in caso di un agonista con etichettato) devono essere limitate nel tempo e preferenzialmente devono essere eseguite a temperatura ambiente o inferiore. Il fatto che la procedura è eseguita a temperatura ambiente rende il dosaggio anche conveniente e più compatibile con gli sforzi in formato piastra di screening. Infine, un numero sufficiente di cellule per campione (ad es., 250.000 per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti) dovrebbe essere usato per il test, infine, mantenere un numero sufficiente di cellule (20.000 celle, "eventi, singolo" basato sul gating della popolazione intera cellula; si veda Figura 1) per l'analisi di citometria a flusso. Utilizzando meno cellule renderebbe più difficile raggiungere costantemente questo numero di cellule analizzate, che potrebbe compromettere l'affidabilità della lettura fuori. Utilizzando meno cellule per campione (per bene) aumenterebbe anche l'intervallo di tempo necessario per analizzare il campione mediante citometria a flusso e quindi aumenta il tempo complessivo per analizzare un intero 96 pozzetti. Questo compromette aumentare il throughput. Per il motivo suddetto, così potrebbe girare a futuri miniaturizzazione del dosaggio non sono disponibili per essere un compito banale.

Presi insieme, un test di associazione di competizione che è utilizzato principalmente nel nostro laboratorio come uno strumento di screening per identificare piccole molecole che possono competere con un importo fisso di CXCL12 con etichetta per l'associazione di CXCR4 è stata descritta in dettaglio. Questi studi di associazione sono di interesse in quanto sono un metodo relativamente semplice e veloce per identificare composti capaci di grippaggio del ricevitore. Anche se l'identificazione di composti con capacità legante già è prezioso in sé, questo tipo di analisi non fornisce informazioni sull'attività dei composti identificati. Quindi, rimane necessario ulteriormente convalidare e caratterizzare la loro potenziale attività agonista o antagonista in altri dosaggi farmacologici e funzionale del recettore. Di interesse, nel caso di CXCR4 è stato dimostrato che gli antagonisti del ricevitore che mostrano una maggiore attività nell'analisi della associazione (vale a dire, che generano valori di50 IC bassi per l'associazione di inibizione) eseguano relativamente meglio in altri funzionale CXCR4-relativi dosaggi anche17.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Gli autori vorrei ringraziare Eric Fonteyn per l'eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da KU Leuven (grant no. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, concedere no. G.485.08) e la Fondation Dormeur Vaduz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD FACSCanto II Becton Dickinson Not applicable Flow cytometry device
BD FACSDIVA Software
BD FACSArray Becton Dickinson Not applicable Flow cytometry device
BD FACSArray System Software
Graphpad Prism Graphpad software package used for nonlinear regression analysis in Figure 2 and Figure 3
FlowJo FlowJo is now a wholly owned subsidiary of BD.
Vi-CELL Beckman Coulter Not applicable cell viability analyzer
Sigma 3-18 KS Sigma Not applicable centrifuge
AMD3100 Sigma A5602-5mg specific CXCR4 antagonist
Maraviroc Pfizer antiretroviral drug, CCR5 antagonist, available for research at Selleckchem (cat#S2003), Sigma (cat#PZ0002)
h-SDF1a (AF647) ALMAC CAF-11-B-01 fluorescently labeled CXCL12, CXCL12AF647
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco (Life Technologies) 10270-106
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A1933-25G
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red Gibco (Life Technologies) 14065-049
HEPES (1M) Gibco (Life Technologies) 15630-056
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco (Life Technologies) 14190-094
Jurkat cells ATCC
Reagent reservoir PP Sigma BR703411
Rapid flow filter: 0.2 µm aPES Thermo Scientific 566-0020
Sterilin microtiter plate, 96-well, U bottom, clear Thermo Scientific 611U96
Falcon tubes, 50ml Greiner Bio-One 227 261
Tissue culture flask (T75) Corning 353024

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