Thromboxane A2 रिसेप्टर जीन के C924T Polymorphism अध्ययन करने के लिए एक विधि

Genetics
 

Summary

वर्तमान अध्ययन में, हम एक पद्धति का वर्णन करने के लिए C924T जीनोटाइप का विश्लेषण । प्रोटोकॉल के तीन चरण होते हैं: डीएनए निष्कर्षण, पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) द्वारा प्रवर्धन, और प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई पोलीमरेज़ (आरएफएलपी) के विश्लेषण एग्रोस जेल पर ।

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De Iuliis, V., Ursi, S., Pennelli, A., Caruso, M., Capodifoglio, S., Marino, A., Flati, V., Vitullo, G., Toniato, E., Robuffo, I., Martinotti, S. A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene. J. Vis. Exp. (146), e57289, doi:10.3791/57289 (2019).

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Abstract

Thromboxane A2 रिसेप्टर (TBXA2R) जीन जी प्रोटीन युग्मित superfamily के सात-transmembrane क्षेत्रों के साथ एक सदस्य है । यह atherogenesis प्रगति, ischemia, और मायोकार्डल रोधगलन में शामिल है । यहां हम रोगी जीनोटाइपिंग की एक पद्धति के बाद C924T बहुरूपता की (rs4523) TBXA2 रिसेप्टर जीन के 3 क्षेत्र में स्थित-transcriptional भूमिका की जांच करने के लिए प्रस्तुत करते हैं । इस विधि पूरे रक्त से डीएनए निष्कर्षण पर निर्भर करता है, पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) C924T उत्परिवर्तन युक्त TBXA2 जीन भाग के प्रवर्धन, और जंगली प्रकार और/या उत्परिवर्ती जीनोटाइप की पहचान एक प्रतिबंध डाइजेस्ट विश्लेषण का उपयोग कर, विशेष रूप से एक प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई अग्रासे जेल पर बहुरूपता (rflp) । इसके अलावा, परिणाम अनुक्रमण द्वारा TBXA2R जीन की पुष्टि की गई । इस विधि कई संभावित लाभ, जैसे उच्च दक्षता और C924T बहुरूपता की तेजी से पहचान पीसीआर और प्रतिबंध एंजाइम विश्लेषण द्वारा सुविधाएँ. इस दृष्टिकोण TBXA2R C924T polymorphism के लिए रोगी जीनोटाइप का विश्लेषण करके पट्टिका गठन और atherosclerosis प्रगति के लिए एक भविष्यसूचक अध्ययन की अनुमति देता है । इस विधि के आवेदन में एक उच्च जोखिम, aspirin-उपचारित समूह में विशेष विषयों में, जो अधिक atheroथ्रोनबोटिक प्रक्रियाओं के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं विषयों की पहचान करने की क्षमता है ।

Introduction

TBXA2R सात-transmembrane क्षेत्रों के साथ जी प्रोटीन युग्मित superfamily के एक सदस्य है, जो व्यापक रूप से व्यक्त कर रहे है और या तो कोशिका झिल्ली पर या intracellular संरचनाओं1,2पर स्थानीयकृत । TBXA2R सिग्नलिंग मार्ग उन्नत atherosclerotic प्रक्रियाओं3में शामिल है । TBXA2 रिसेप्टर की वृद्धि की अभिव्यक्ति atherogenesis प्रगति के दौरान प्रदर्शन किया गया था, और नैदानिक और प्रायोगिक अध्ययन ischemia और मायोकार्डल रोधगलन4में अपनी प्रासंगिक भूमिका दिखाई । C924T, एक एकल न्यूक्लिओटाइड बहुरूपता (snp) TBXA2R जीन की, स्वस्थ स्वयंसेवकों में एक कार्यात्मक बहुरूपता के रूप में पहचाना गया था और नैदानिक विकारों से जोड़ा गया है5. इसके अलावा, हमारे पिछले6 अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि TBXA2R जीन के C924T बहुरूपता ट्रांसक्रिप्ट स्थिरता में शामिल है; विशेष रूप से, वहां उत्परिवर्ती (टीटी) प्रकार प्रतिलिपि के जंगली प्रकार (सीसी) के संबंध में एक वृद्धि की अस्थिरता है । इसके अलावा, कई उत्तेजनाओं जैसे adenosine डाइफॉस्फेट (adp), epinephrine, और कोलेजन अलग सांद्रता पर एक प्लेटलेट एकत्रीकरण उत्परिवर्ती प्रकार (टीटी) के लिए कम प्रभावी प्रेरित । यह एक कम थक्का गठन और रक्तस्तस्कता के साथ संगत है । इस प्रकार, TBXA2R ट्रांसक्रिप्ट की अस्थिरता और प्लेटलेट एकत्रीकरण की संबंधित कमी एथेरोथ्रोंबोसिस के खिलाफ TBXA2R TT जीनोटाइप के लिए एक सुरक्षात्मक भूमिका के साथ जुड़ा हो सकता है और उच्च जोखिम एएप्जिन में इसकी जटिलताओं-रोगियों का इलाज6 .

यहां, हम रोगी जीनोटाइपिंग के लिए एक पद्धति का वर्णन के बाद C924T बहुरूपता की (rs4523) TBXA2 रिसेप्टर जीन के 3 क्षेत्र में स्थित-transcriptional भूमिका की जांच । इस विधि निंन चरणों पर निर्भर करता है: (1) पूरे रक्त से डीएनए निष्कर्षण, (2) TBXA2R जीन C924T उत्परिवर्तन युक्त भाग के पीसीआर प्रवर्धन, और (3) जंगली प्रकार और/या उत्परिवर्ती जीनोटाइप की पहचान प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई का उपयोग अग्रोसे जेल (ऐगेरोस gel)-पर पॉलीमॉर्फीज्म (rflp) । RFLP एक तकनीक है कि समजातीय डीएनए अनुक्रम में बदलाव का शोषण7है । इस आवेदन डीएनए polymorphisms का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था, विशेष रूप से SNPs, और खोजने के लिए और आनुवंशिक रूपों में जैविक प्रासंगिकता सहयोगी8. बहुरूपता पहली बार मानव में rflp-पीसीआर का उपयोग करने के लिए विश्लेषण abo रक्त9था । आरएफएलपी-पीसीआर विधि, उच्च विशिष्ट प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिसेस10का उपयोग करते हुए डीएनए पाचन के बाद विभिन्न लंबाई के टुकड़ों की उपस्थिति का मूल्यांकन करके समजातीय डीएनए दृश्यों में आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के विश्लेषण की अनुमति देता है ।

पिछले वर्षों में, पीसीआर तकनीक का उपयोग करते हुए एसएनपी विश्लेषण के लिए निम्नलिखित पद्धतियों का उपयोग किया गया है: शॉर्ट एलील-विशिष्ट ओलिगोन्यूक्लिओटाईड्स का संकरण11, एलील-विशिष्ट पीसीआर12, डीएनए माइक्रोसरणियों पर प्राइमर एक्सटेंशन13, ओलिगोन्यूक्लिओटाइड कोलेशन परख14, स्थिति की पहचान करने के लिए प्रत्यक्ष डीएनए अनुक्रमण-विशिष्ट एकल-न्यूक्लिओटाइड बहुरूपताओं15, taqman विधि16, निष्कर्षण मैट्रिक्स-सहायता प्राप्त लेजर विशोषण/ionization समय की उड़ान ( माल्डी-TOF) मास स्पेक्ट्रोमेट्री17, और genechips18. इन तकनीकों का उपयोग करने के लिए सरल नहीं है और महंगे उपकरणों की आवश्यकता हो सकती है । इसके विपरीत, पीसीआर-RFLP विधि सस्ती है, उपयोग करने के लिए सरल, सुविधाजनक, एक उच्च दक्षता है, और C924T polymorphism की तेजी से पहचान की अनुमति देता है । इसके अलावा, हम TBXA2R जीन sanger विधि का उपयोग कर15अनुक्रमण द्वारा परिणामों की पुष्टि की ।

यह दृष्टिकोण TBXA2R C924T polymorphism के लिए रोगी जीनोटाइप का विश्लेषण करके पट्टिका गठन और atherosclerosis प्रगति का एक भविष्य कहनेवाला अध्ययन की अनुमति देता है । इस विधि विषयों की पहचान कर सकता है और अधिक अथरोथ्रोनबोटिक प्रक्रियाओं के लिए अतिसंवेदनशील, विशेष रूप से उच्च जोखिम के बीच उन, aspirin-रोगियों का इलाज किया ।

Protocol

यह प्रोटोकॉल चियेटी विश्वविद्यालय की चिकित्सा अनुसंधान आचार समिति के दिशानिर्देशों का पालन करता है ।

1. अभिकर्मक सेटअप

  1. Tris-EDTA (TE) बफ़र (pH ८.०) तैयार करें । EDTA ०.५ M के २०० μL और एक बीकर में Tris-Cl 1 M के 1 मिलीलीटर जोड़ें और बाँझ पानी के साथ १०० मिलीलीटर के लिए ले आओ । TE बफर अंतिम एकाग्रता: 10 मिमी Tris-Cl, 1 मिमी EDTA । कमरे के तापमान (आरटी) पर स्टोर ।
  2. 10x स्टॉक सॉल्यूशन इलेक्ट्रोफोरेसिस बफर (TBE) की 1 L तैयार करें । १०८ जी Tris आधार के भंग, बोरिक एसिड की ५५ जी, और EDTA ०.५ एम के ४० मिलीलीटर (पीएच 8) एक बीकर में, और बाँझ पानी के साथ 1 एल की मात्रा में लाने के लिए । RT पर स्टोर.
  3. जेल लोडिंग डाई तैयार करें । भंग ०.२५ के ब्रोमोफीनॉल ब्लू, ०.२५ जी के xylene सायनोल एफएफ, ५० जी ग्लिसरोल, edta के 1 मिमी (पीएच 8) में ६० मिलीलीटर विआयनीकृत या आसुत पानी, और बाँझ पानी के साथ १०० मिलीलीटर की एक मात्रा में लाने के लिए । 4 ° c पर स्टोर (कुछ महीनों के लिए) या पर-20 डिग्री सेल्सियस (साल के लिए)
  4. 2% ऐगेरोस जेल की २०० मिलीलीटर तैयार करें । यह ताजा या, वैकल्पिक रूप से, कई हफ्तों तक के लिए आरटी में जम स्टोर का उपयोग करें ।
    1. एक ६०० मिलीलीटर बीकर में २०० एमएल के 1x tbe बफर में 4 जी ऐगेरोस भंग । के बारे में 5 मिनट के लिए एक चुंबकीय मिक्सर का उपयोग कर हलचल जब तक ऐगेरोस पूरी तरह से निलंबित कर दिया है ।
    2. उबलते पानी में 2% ऐगेरोस समाधान गर्मी या एक गर्म थाली पर (के बारे में 10 मिनट के लिए, जब तक ऐगेरोस पूरी तरह से भंग है) । ध्यान दें कि एगरोस जेल के साथ बीकर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया जाना चाहिए । वैकल्पिक रूप से, एक माइक्रोवेव में लगभग 3-5 मिनट के लिए एक उच्च तापमान पर खुला बीकर गर्मी ।
    3. एक चुंबकीय मिक्सर का उपयोग कर 2% ऐगेरोस समाधान भंवर, जांच है कि ऐगेरोस पूरी तरह से भंग है ।
      नोट: अग्रोस के कणों पूर्ण विघटन करने से पहले पारभासी अनाज के रूप में दिखाई देते हैं । यह कई मिनट के लिए कणों को फिर से गरम करने के लिए आवश्यक हो सकता है (के बारे में 5 – 10 मिनट).
    4. यदि ऐगेरोस जेल के एक संग्रहीत भाग का प्रयोग किया जाता है, गर्मी beaker, एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर, एक गर्म पानी के स्नान में (लगभग ६० डिग्री सेल्सियस पर) जब तक ऐगेरोस भंग है । एक pasteur पिपेट के साथ निकालें किसी भी "ट्रेस" सतह से जम ऐगेरोस के गिरने से पहले ।

2. डीएनए शुद्धि

  1. शुद्धि प्रारंभ करने से पहले निंन कार्य करें:
    1. मानव ताजा पूरे रक्त के नमूनों का प्रयोग करें, या गल पूरे रक्त जमे हुए नमूनों जल्दी (के बारे में 2-3 मिनट के लिए) एक पानी स्नान में (३७ डिग्री सेल्सियस पर) एक हल्के आंदोलन लागू करने और फिर उपयोग से पहले आर टी के लिए equilibrate ।
    2. कई बार ट्यूबों के उलटा ताजा या गल चुके रक्त के नमूने मिलाएं ।
  2. के लिए आपूर्तिकर्ता के प्रोटोकॉल का पालन करके शुद्धि प्रक्रिया प्रारंभ करें १०० μl के लिए रेफरेंस मात्रा.
  3. Quantify और २६०, २८०, और ३२० एनएम पर अवशोषण को मापने डीएनए की शुद्धता की गणना ।
    1. नमूनों को पतला करने के लिए और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर कैलिब्रेट करने के लिए बाँझ पानी का उपयोग करें ।
    2. डीएनए नमूना की सांद्रता की गणना करने के लिए निम्नलिखित सूत्र लागू करें = ५० μg/mL x (A२६० − a३२०) x तनुकरण कारक, और डीएनए की शुद्धता = (a२६० − एक३२०)/(a२८० − एक३२०), एक स्वीकार्य अनुपात के साथ १.७ और १.९ के बीच ।

3. डीएनए नमूनों की पीसीआर प्रवर्धन

  1. एक ०.२ मिलीलीटर माइक्रो-प्रवर्धन नली में अभिक्रिया मिश्रण का 25 μL तैयार कीजिए जैसा कि सारणी 1में दर्शाया गया है ।
  2. तालिका 2में दर्शाए गए प्रवर्धन प्रोग्राम का पालन करते हुए स्वचालित तापीय चक्रक का उपयोग करके शुद्ध डीएनए नमूनों का पीसीआर-प्रवर्धन करें ।
  3. पीसीआर प्रवर्धन के अंत में, 4 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए नमूनों को छोड़ कर पीसीआर प्रतिक्रियाओं को रोकें ।

4. पीसीआर उत्पादों की RFLP

  1. प्रत्येक नमूने के लिए मास्टर-मिक्स सॉल्यूशन की २२.५ μL तैयार करें, ताकि चयनित प्रतिबंध एंजाइम पीसीआर उत्पादों को हज़म कर दें, जैसा कि तालिका 3में दिखाया गया है.
  2. एक पिपेट और फिल्टर सुझावों का उपयोग कर, प्रत्येक नमूने के लिए एक नई पीसीआर ट्यूब के लिए पीसीआर उत्पाद के २.५ μL स्थानांतरण ।
  3. एक पिपेट और फिल्टर सुझावों का उपयोग कर, प्रत्येक नमूने के पीसीआर उत्पाद युक्त ट्यूबों के लिए पाचन मास्टर-मिक्स समाधान के २२.५ μL जोड़ें ।
  4. 4 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर अभिक्रिया मिश्रण (मास्टर-मिक्स सॉल्यूशन और पीसीआर उत्पाद) को इनसेबेट करें ।

5. जेल पीसीआर-आरएफएलपी नमूनों का इलेक्ट्रोफोरेसिस विश्लेषण

  1. 10 मिनट के लिए जेल के लिए इथियोडियम ब्रोमाइड (etbr) में ०.५ μg/एमएल जोड़कर एगरोस जेल दाग, डीएनए, जो पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के तहत कल्पना जा सकता है के लिए बांधता ।
    चेतावनी: यह दस्ताने और अंय सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग करने के लिए हैंडलिंग, भंडारण, और etbr के निपटान के दौरान महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह संभावित कैंसरजनन के साथ एक उत्परिवर्तजन है ।
  2. जगह में अच्छी तरह से कंघी के साथ एक जेल ट्रे में तैयार ऐगेरोस जेल डालो, और जब तक यह जम गया है रुको ।
  3. जेल बॉक्स (electrophoresis इकाई) में जम ऐगेरोस जेल प्लेस ।
  4. जेल कवर किया जाता है जब तक 1x TBE के साथ जेल बॉक्स भरें ।
  5. एक पिपेट और फिल्टर सुझावों के साथ, प्रवर्धित डाइजेस्ट डीएनए के 6 μL लोड (विशेष रूप से, लोड एक नमूना के 5 μL और जेल लोडिंग डाई के 1 μL) एगरोस जेल के कुओं में । एक अलग अच्छी तरह से और नमूनों के साथ समानांतर में एक डीएनए आकार मार्कर जोड़ें ।
  6. 20 के लिए जेल भागो-30 मिनट में १०० वी ।
  7. एक यूवी ट्रांसप्रकाशक के साथ, cleaved डीएनए टुकड़े या पचाया पीसीआर उत्पादों कल्पना, डीएनए आकार मार्कर के साथ टुकड़े की तुलना, और निर्माता के निर्देशों का पालन फोटोग्राफी द्वारा परिणाम रजिस्टर ।
    चेतावनी: यूवी प्रकाश स्रोतों के आसपास सुरक्षात्मक उपकरणों (सुरक्षा चश्मा या एक चेहरा मुखौटा) का प्रयोग करें ।

Representative Results

इस विधि का लक्ष्य C924T polymorphism के संबंध में Thromboxane A2 रिसेप्टर जीनोटाइप का मूल्यांकन करने के लिए है । मानव TBXA2R जीन 19p 13.3, spans 15 kbp पर स्थित है, और दो introns से अलग तीन exons के होते हैं । TBXA2R जीन (५३९ बीपी) की C924T बहुरूपता को चित्रा 1में दर्शाए गए पीसीआर प्रिमर्स का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया था, जो एक विशिष्ट डीएनए क्षेत्र को बढ़ाने के लिए अच्छी तरह से इंजीनियर थे, लेकिन एक ऑर्थोलॉजिस्ट या पैरालोजिस्ट अविशिष्ट क्षेत्र नहीं । इसके अलावा, एक rsai प्रतिबंध एंजाइम (चित्रा 1) का उपयोग कर पीसीआर उत्पादों पर एक आरएफएलपी विश्लेषण किया गया था और परिणाम एक ऐगेरोस जेल पर कल्पना थे, क्रम में विशिष्ट अध्ययन snp विशेषताएं ।

डीएनए के पाचन के बाद अलग टुकड़ा लंबाई की उपस्थिति के आधार पर, यह C924T polymorphism के लिए एक रोगी के जीनोटाइप भेदभाव करने के लिए संभव है । वास्तव में, के रूप में चित्रा 2पर दिखाया गया है, मेजर एलील (सीसी) के समयुग्मज दो बैंड (३९५ और १४४ बीपी) प्रदर्शित करता है, क्योंकि प्रतिबंध एंजाइम ठीक C924T बहुरूपता साइट पर TBXA2R gene भाग में कटौती । अवयस्क एलील (टीटी) की समयुग्मज को एकल बैंड (५३९ bp) द्वारा प्रदर्शित किया जाता है, क्योंकि प्रतिबंध एंजाइम काटना नहीं होता है । विषमयुग्मज (सीटी) एलील तीन बैंड (५३९, ३९५, और १४४ बीपी) से पता चलता है । चित्रा 2में दिखाया गया है, C924T polymorphism, पीसीआर उत्पाद पर rsai पाचन द्वारा परिभाषित, अनुक्रम विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई है.

घटक मात्रा (μL) अंतिम सांद्रता
10x पीसीआर बफर के बीच-20 (15 मीटर एमजीसीएल2) ०.२५ १.५ MgCl2 mmol/L
dNTP मिक्स (10 मिमी) 1 २०० μM
प्राइमरी (फॉरवर्ड) (10 pmol/ 1 ०.४ μM/μL
प्राइमरी (रिवर्स) (10 pmol/ 1 ०.४ μM/μL
Taq पोलीमरेज़ (5 U/ ०.२ 1 यू/
नमूना डीएनए (४२ एनजी/ 1 ४२ एनजी/
DNase-मुफ्त-पानी २०.५५
कुल 25

तालिका 1: पीसीआर प्रवर्धन सेटअप । एक 25 μL मास्टर-मिक्स रिएक्शन मिश्रण एक डीएनए नमूने बढ़ाना करने के लिए एक ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में स्थापित किया ।

मानक पीसीआर
प्रारंभिक सक्रिय चरण 5 min ९५ डिग्री सेल्सियस
3-कदम साइकल चलाना
विकृतीकरण 30 एस ९४ डिग्री सेल्सियस
अनीलन ६० s ५५ डिग्री सेल्सियस
एक्सटेंशन ६० s ७२ डिग्री सेल्सियस
चक्रों की संख्या 30 चक्र
अंतिम विस्तार 8 min ७२ डिग्री सेल्सियस

तालिका 2: पीसीआर प्रवर्धन कार्यक्रम । एक स्वचालित थर्मल cycler सेट करने के क्रम में पीसीआर प्रदर्शन और टेंपलेट डीएनए बढ़ाना । पीसीआर प्रतिक्रियाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर हल्का करके रोका जाता है ।

घटक आयतन (μL) (n = 1) खंड (μL) (n = 10) *
10x एंजाइम बफर २.५ २७.५
प्रतिबंध एंजाइम (5 यू/ ०.५ ५.५
DNase-मुफ्त-पानी १९.५ २१४.५
कुल २२.५ २४७.५

तालिका 3: प्रतिबंध एंजाइम पीसीआर उत्पादों का पाचन । एक मास्टर-मिक्स समाधान तैयार किया जाता है ताकि चयनित प्रतिबंध एंजाइम पीसीआर उत्पादों को हज़म कर दें । *: 10 नमूनों के लिए एक मास्टर-मिक्स समाधान स्थापित करने के लिए, 10% अधिक जोड़ने, अंत में 11 नमूने बनाने.

Figure 1
चित्रा 1: पीसीआर प्राइमरों और rsai प्रतिबंध एंजाइम । आगे और रिवर्स ५३९ बीपी के TBXA2R जीन भाग C924T polymorphism युक्त परिवर्धन के लिए डिजाइन किया प्राइमरों । RsaI, GTAC साइटों को पहचानने के लिए चयनित प्रतिबंध एंजाइम है । ˅: RsaI एंजाइम के काटने साइट । C (/T): C924T polymorphism. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: Electrophoretic पैटर्न और डीएनए अनुक्रम विश्लेषण. () C924T जीनोटाइप को विशिष्ट आरसई एंजाइम के साथ पाचन के बाद आरएफएलपी पैटर्न द्वारा पहचाना जाता है । () डीएनए अनुक्रम विश्लेषण: आरएफएलपी द्वारा प्राप्त परिणामों के बाद rsai प्रतिबंध एंजाइम के साथ पाचन C924T polymorphism दिखा अनुक्रम विश्लेषण का उपयोग कर की पुष्टि की गई । इस आंकड़े को डी इयूलिइस एट अल., प्रोस्टाग्लैंडीन्स &Amp; अन्य लिपिड मध्यस्थोंसे संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

वर्तमान अध्ययन में, हम एक पद्धति का वर्णन किया है कि रोगी जीनोटाइपिंग की अनुमति देता है के बाद C924T बहुरूपता की (rs4523) TBXA2R जीन के 3 क्षेत्र में स्थित के बाद-transcriptional भूमिका की जांच । सबसे पहले, इस विधि पूरे रक्त से डीएनए निष्कर्षण पर निर्भर करता है । विशेष रूप से, इस पहली प्रक्रिया में कुल मानव डीएनए, जीनोमिक और माइटोकोड्रियल का शुद्धिकरण होता है, जो पूरे रक्त नमूनों से ताजा या जमे हुए, EDTA (या तो सिट्रेट या हेपरिन) के साथ व्यवहार किया जाता है । पूरे रक्त नमूनों की अल्पावधि भंडारण के लिए, 10 दिनों के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । 10 दिनों में भंडारण के लिए-७० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान । स्वचालित शुद्धि प्रक्रिया 4 कदम शामिल हैं: lyse, बांध, धोने, और elute । दूसरा, विधि TBXA2R जीन C924T उत्परिवर्तन युक्त भाग के पीसीआर प्रवर्धन पर निर्भर करता है । अंत में, जंगली प्रकार की पहचान और/या उत्परिवर्ती जेनोटाइप का उपयोग कर एक प्रतिबंध एंजाइम विश्लेषण (आरएफएलपी) ऐगेरोज़ जेल पर किया जाता है ।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम निंनलिखित हैं: (i) इस मामले में है कि ऐगेरोस जेल के एक हिस्से में आरटी पर संग्रहीत किया जाता है, जम ऐगेरोस फिर से एक उबलते पानी स्नान पर भंग किया जा सकता है (के बारे में 15-20 मिनट के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर) या एक माइक्रोवेव ओवन (3-5 मिनट) में डालने से पहले । नोट: टोपी ढीला जब एक बोतल में फिर से पिघलने ऐगेरोस । (पप) इसके अतिरिक्त, जब आगरज को पुनः गर्म करना हो तो वाष्पीकरण से उसकी सांद्रता में वृद्धि होगी । इस कारण से, यह पानी की एक छोटी मात्रा जोड़कर क्षतिपूर्ति करने के लिए उपयोगी हो सकता है । (iii) १,००० बीपी से कम के डीएनए अंशों को अग्रोस जेल द्वारा विभेदित किया गया था, और TBE बफर को सर्वोत्तम संभव पृथक्करण प्राप्त करने की सिफारिश की गई है । (iv) हम polyacrylamide जेल के बजाय एक एगरोस जेल का उपयोग करना पसंद करते है क्योंकि बाद की तैयारी अधिक कठिन है, और इसे स्थापित करने के लिए अधिक समय लगता है । (v) जेल वैद्यु-संचलन के चलने के समय का चुनाव प्रवर्धन उत्पादों के प्रत्याशित आकार पर निर्भर करता है । इस प्रोटोकॉल के आधार पर, यह 20-30 मिनट के लिए एक ट्रो के लिए १०० V में 2% ऐगेरोस जेल में प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त है, के बाद से पीसीआर अंशों का आकार 100-500 bp से पर्वतमाला । (vi) मानव नमूनों से निकाली गई अच्छी गुणवत्ता वाले टेम्पलेट डीएनए की 10 से ५० एनजी प्राप्त करना अनिवार्य है । . इस कारण से, हम एक अर्द्ध स्वचालित या मैनुअल एक के बजाय एक स्वचालित डीएनए शुद्धि का उपयोग करना पसंद करते हैं । (vii) पीसीआर प्रवर्धन के लिए मास्टर-मिक्स अभिक्रिया और पीसीआर उत्पादों के लिए मास्टर-मिक्स समाधान, पाचन के लिए 10% अधिक (पिख्ता के दौरान द्रव के नुकसान के लिए) की गणना की गई मात्रा के लिए आवश्यक मात्रा के नमूनों की संख्या को जोड़कर तैयार करें । एक डीएनए नमूने के लिए ।

विधि का सबसे अक्सर नुकसान एक गलत थर्मल cycler कार्यक्रम, एक गलत प्रवर्धन मास्टर-मिक्स तैयारी, या एक डीएनए टेम्पलेट संदूषण के कारण अतिरिक्त प्रवर्धन उत्पादों की उपस्थिति है । इसके अलावा, पीसीआर उत्पादों की अनुपस्थिति निष्क्रिय Taq पोलीमरेज़ या एक गलत थर्मल cycler चलाने के कारण हो सकता है । इसके अलावा, अप्रत्याशित टुकड़े की उपस्थिति पीसीआर उत्पाद संदूषण के कारण या तो एक निष्क्रिय एंजाइम से एक अपूर्ण पाचन के लिए हो सकता है, प्रतिबंध एंजाइम की मात्रा की बहुत कम राशि, या एक बहुत कम ऊष्मायन समय.

पिछले वर्षों में, पीसीआर तकनीक का उपयोग करते हुए एसएनपी विश्लेषण के लिए निम्नलिखित पद्धतियों का उपयोग किया गया है: शॉर्ट एलील-विशिष्ट ओलिगोन्यूक्लिओटाईड्स का संकरण11, एलील-विशिष्ट पीसीआर12, प्राइमरी एक्सटेंशन डीएनए माइक्रोसरणियों पर13 , ओलिगोन्यूक्लिओटाइड बंधाव परख14, स्थिति की पहचान करने के लिए प्रत्यक्ष डीएनए अनुक्रमण-विशिष्ट एकल-न्यूक्लिओटाइड बहुरूपताओं15, taqman विधि16, निष्कर्षण मैट्रिक्स-सहायता प्राप्त लेजर विशोषण/ionization समय की उड़ान (माल्डी-TOF) मास स्पेक्ट्रोमेट्री17, और genechips18. ये विधियां आदर्श नहीं है क्योंकि वे उपयोग करने के लिए सरल नहीं है और/या महंगे उपकरणों की आवश्यकता है । इसके विपरीत, पीसीआर-RFLP इस अध्ययन में वर्णित विधि सस्ती है, उपयोग करने के लिए सरल, सुविधाजनक, एक उच्च दक्षता है, और C924T polymorphism की तेजी से पहचान की अनुमति देता है । वर्तमान पद्धति के लिए एक सीमा है कि यह केवल SNPs की एक छोटी संख्या के लिए और एक काम सत्र में कुछ नमूनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए, इस विधि TBXA2R C924T polymorphism के लिए रोगी जीनोटाइप का विश्लेषण करके पट्टिका गठन और atherosclerosis प्रगति के विषय में भविष्यसूचक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, इस विधि विषयों की पहचान कर सकता है और अधिक atherothrombotic प्रक्रियाओं के लिए अतिसंवेदनशील, विशेष रूप से, उच्च जोखिम वाले रोगियों aspirin के साथ इलाज किया । अंत में, इस विधि विशिष्ट दवाओं के लिए व्यक्तिगत चिकित्सा में शामिल अन्य बहुरूपताओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, थक्का-रोधी और antiआक्षेपग्रस्त) ताकि उचित दवा खुराक और व्यक्तिगत औषधीय समझने के लिए और चिकित्सा शुरू करने से पहले प्रत्येक रोगी के लिए नैदानिक प्रतिक्रिया और प्रतिकूल प्रभाव से बचने के लिए.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना को आंशिक रूप से ६०% द्वारा वित्त पोषित किया गया था Ministero Dell ' Università, इटली से एस. एम. ए., और एट के Ateneo अनुदान हम भी चिकित्सा, मौखिक और जैव प्रौद्योगिकी विज्ञान, Chieti के विश्वविद्यालय "जी डी ' Annunzio" द्वारा अनुसंधान व्यय के लिए आंशिक योगदान प्राप्त किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAsymphony SP QIAGEN 937055
Spectrophotometer EPPENDORF 6131-02222
UV-transilluminator UVP 732-110
PCR tubes EPPENDORF H0030121589
PCR thermal cycler EPPENDORF 5331-03721
Pipettors and filter tips EPPENDORF H4910000018/42/69 AND 0030067037/10/02
Horizontal minigel electrophoresis apparatus DIATECH PHORESIS 10 RI002-10
Dry block heater TWIN INCUBATOR DG210
QIAsymphony DNA Midi Kit QIAGEN 931255
10x PCR buffer (usually supplied by the manufacturer with the Taq polymerase) DIATECH AND TAKARA T0100 AND R0001DM
Taq polymerase TAKARA R0001DM
dNTP mixture DIATECH  pharmacogenetics NM001 dNTP MIX 10x 100 microliters, 10 mM
PCR primers DIATECH  pharmacogenetics \\
Restriction enzyme RsaI New England biolabs R0167L
Restriction enzyme 10x buffer New England biolabs R0167L
Agarose Sigma A9539 DNA fragments are best separated in TBE buffer
Tris base Sigma T6066
Boric acid Sigma B7901
0.5 M EDTA, pH 8.0 Sigma E7889
10% (wt/vol) ammonium persulfate Sigma E3678 prepared fresh each time
EtBr (0.5 μg/μL) Sigma E8751
Bromophenol blue Sigma B0126
Xylene cyanol FF Sigma X4126
Glycerol Sigma G5516
DNA size marker DIATECH  pharmacogenetics R1002-10 Plasmide pBluescript II SK (+) restrict MSPI
Sterile water (autoclaved) DIATECH  pharmacogenetics \\

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References

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