Behandlung mit Vancomycin Calcium-Sulfat und autogener Knochen in eine verbesserte Kaninchen-Modell der Knochenentzündung geladen

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Summary

Diese Studie bietet eine verbesserte Kaninchen Modell durch die Blockierung der gleichen Menge an Bakterien im Knochenmark mit Staphylococcus Aureus infiziert. Vancomycin geladen-Calcium-Sulfat und autogener Knochen sind für Antibiotika und Knochen Repair-Behandlung verwendet. Das Protokoll könnte hilfreich für das Studium Knochenentzündung und Regeneration.

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Zhang, Y., Shen, L., Wang, P., Xi, W., Yu, Z., Huang, X., Wang, X., Shou, D. Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection. J. Vis. Exp. (145), e57294, doi:10.3791/57294 (2019).

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Abstract

Knochenentzündung entsteht durch bakterielle Invasion, die extrem schwierig ist, in der klinischen, orthopädischen und traumatischen Chirurgie zu behandeln. Die Knochenentzündung führen anhaltende Entzündung, Osteomyelitis und eventuelle Knochen Pseudarthrose. Einrichtung eine praktikable, reproduzierbare Tiermodell ist wichtig, die Infektionsforschung und antibiotische Behandlung Knochen. Als ein in-vivo-Modell ist das Kaninchen-Modell in der Infektionsforschung Knochen verbreitet. Frühere Studien über Kaninchen Knochen jedoch Infektionsmodelle zeigte, dass der Infektionsstatus widersprüchlich, da die Menge der Bakterien Variable war. Diese Studie bietet eine verbesserte chirurgische Methode zur Induktion Knochenentzündung auf ein Kaninchen, durch die Blockierung der Bakterien im Knochenmark. Mehrstufige Bewertungen können dann um zu überprüfen, die Modellierungsmethode durchgeführt werden.

In der Regel dominieren Debridement nekrotischen Gewebes und Implantation von Vancomycin-geladenen Calcium-Sulfat (VCS) in Behandlung mit Antibiotika. Obwohl Calcium-Sulfat in VCS Osteocyte kriechen und Knochenneubildung zugute kommt, treten massive Knochendefekte nach Debridement. Autogener Knochen (AB) ist eine attraktive Strategie Knochendefekte für die Behandlung von massiven Knochendefekte nach Debridement nekrotischen Knochens zu überwinden.

In dieser Studie wird das Steißbein als ein autogener Knochen implantiert in den Knochendefekt verwendet. Knochen-Reparatur wurde gemessen mit Mikro--Computertomographie (Mikro-CT) und histologische Analyse nach Tieropfer. Infolgedessen wurde in der VCS-Gruppe Knochen Pseudarthrose konsequent erhalten. Im Gegensatz dazu waren die Knochen defekt Bereiche in der VCS-AB-Gruppe deutlich verringert. Die vorliegenden Modellierungsmethode beschrieben eine reproduzierbare, machbare und stabile Methode, um eine Infektion Knochenmodell vorzubereiten. Die VCS-AB Behandlung führte zu niedrigeren Knochen Pseudarthrose Raten nach Behandlung mit Antibiotika. Das verbesserte Knochenmodell Infektion und die Kombinationsbehandlung von VCS und autogener Knochen könnten hilfreich bei der Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen in der Knochenregeneration Infektion und Knochen für orthopädische Traumatologie Anwendungen relevant sein.

Introduction

Knochen-Infektion führt in der Regel von Bakterien oder anderen Mikroorganismen Invasion nach Trauma, Frakturen oder anderen Knochen Krankheiten1. Knochenentzündung kann ein hohes Maß an Entzündungen und Knochen Zerstörung des Gewebes führen. In der Klinik ist Staphylococcus Aureus (S. Aureus) die vorherrschende Erreger von Knochen Infektion2,3. Die Knochenentzündung ist schmerzhaft, schwächende, und dauert oft einen chronischen Verlauf, der extrem schwer zu4zu behandeln ist. Derzeit haben Debridement von nekrotischen Gewebes und Implantation von Vancomycin-geladenen Kalzium (VCS) Perlen als eine effiziente Strategie für die Steuerung der lokalen Infektion5,6bestätigt worden. Allerdings erlebten 10 % bis 15 % der Patienten einen längeren Knochen-Reparatur-Prozess, verzögerter oder Pseudarthrose nach Anti-Infektion Behandlung7. Der Großteil der ein Knochendefekt ist das schwierigste Thema für orthopädische Chirurgen. Ein autologes Knochentransplantat gilt als die optimale Knochenersatzes in Knochen Pseudarthrose Behandlung8,9.

Bis heute wurden die meisten Studien auf Knochen wurden Infektion und Implantation von autologem Knochen in verschiedenen Tiermodellen, wie z. B. Ratten, Kaninchen, Hunde, Schweine und Schafe10,11durchgeführt. Kaninchen-Modelle sind am häufigsten für Knochen Infektion Studien, als erste von Norden und Kennedy in 197012,13durchgeführt. In unseren früheren Studie wir Kaninchen Modelle nach Norden Methode verwendet, und wir fanden, dass die Menge von S. Aureus in Knochenmark injiziert nicht genau quantifiziert werden konnte, da das Blut austreten aus dem Knochenmark zu Bakterien Lösung Überlauf geführt.

Dieser Artikel stellt eine verbesserte chirurgische Methode zur Induktion Knochenentzündung auf Kaninchen. Am Ende des Verfahrens wurden ein Bluttest Biochemie, eine bakteriologische Untersuchung und einer histologischen Untersuchung durchgeführt, um das Knochenmodell Infektion zu überprüfen. Dann VCS war implantiert, um Infektion zu verhindern, und autogener Knochen implantiert wurde, zur Förderung der Knochenregeneration.

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Protocol

Die Kaninchen, die in der vorliegenden Studie verwendet wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren behandelt. Die experimentellen Verfahren folgten die Regeln für die Bioethik Komitee von Zhejiang Academy von traditionelle chinesische Medizin.

1. Vorbereitung der Bakteriensuspension

  1. Lösen Sie 0,5 mg von S. Aureus Gefriertrocknung Pulver (ATCC 6538) mit 0,3 mL Kulturmedium Luria-Bertani auf. Mischen Sie Fahrwerk komplett.
  2. Streifen der Bakterien-Suspension auf tryptic Soy Agarplatten und inkubieren Sie die Bakterienkolonien bei 37 ° C 16 h.
  3. Wählen Sie eine einzelne bakterielle koloniebildenden Einheit (KBE) und Kultur in tryptic Soy Bouillon Rohre für 24 Std. durchführen einer Subkultur für ca. 24 h bei 37 ° C, und erhalten Mitte logarithmische Wachstum Phase Bakterien nach 16 bis 18 Uhr, wenn die optische Dichte (OD) Wert 0,6 bei 600 nm 14.
  4. Übertragen Sie 1 mL Suspension Bakterien in ein Zentrifugenröhrchen. Für 5 min bei 825 x g und 4 ° C zentrifugiert und den Überstand verwerfen. Aufschwemmen Sie und waschen Sie die Bakterien mit 100 µL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS); Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal. Zu guter Letzt Aufschwemmen Sie Bakterien mit 3 mL PBS.
  5. Schätzen Sie die Bakterien-Konzentration mit McFarlands Turbidimetry15.
    1. Übertragen Sie 100 bis 500 µL Bakterien Suspension auf farbmetrischen Rohr, bis die Trübung ein 0,5 McFarland standard entspricht.
    2. Trübung durch visuellen Vergleich zu 0,5 McFarland, zu beurteilen, wenn der Inhalt der Bakterien ca. 10 erreicht8 KBE/mL.
      Hinweis: Stellen Sie sicher, dass das Volumen der Bakterien-Aussetzung für die folgenden Protokolle ausreicht. Für jedes Kaninchen ist das Volumen der Bakterien Federung weniger als 1 mL.
  6. 0,2 mL Bakteriensuspension auf einer Nährbodenplatte übertragen und gleichmäßig auftragen. Inkubieren Sie der Platte bei 37 ° C für 16 h. Graf die Bakterien-Kolonien um die KBE Bakterien Aussetzung zu überprüfen.

2. Vorbereitung des Knochens Infektionsmodelle

  1. Halten Sie männliche Neuseeland weiße Kaninchen, im Alter von 3 Monaten in einzelnen Käfigen unter Luft-kontrollierten Bedingungen (20 ± 1 ° C) und 12 h/12 h hell-dunkel Beleuchtung Zyklen. Routinemäßige Ernährung bieten und Leitungswasser täglich.
  2. Stellen Sie sicher, dass zum Zeitpunkt der Operation, dass die Kaninchen mehr als 3 kg wiegt.
  3. Betäuben Sie Kaninchen durch intraperitoneale Injektion mit Pentobarbital-Natrium (3 mg / 100 g Körpergewicht). Sicherstellen Sie, dass Kaninchen vollständig durch einen Ausfall reagieren auf eine Pfote Prise betäubt sind. Kaninchen auf dem Operationstisch während Operationsverfahren zu beheben.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Modellierung Verfahren dauert weniger als 1 h.
  4. Rasieren Sie die proximalen Tibia-Region mit einen elektrischen Rasierer gegen die Haarwuchsrichtung. Desinfizieren Sie die Haut durch die Anwendung einer Povidon-Jod-Lösung.
  5. Markieren Sie das obere Ende des Schienbeins und der Bohrposition Loch für die Injektion mit S. Aureus (der Abstand zum oberen Ende des Schienbeins ist 1,5 cm) mit Stift und Lineal. Sicherstellen, dass die Bohrpositionen Loch sind horizontal in der Mitte der Tibia Plateau (Abb. 1A).
  6. Schneiden Sie Tibia Haut mit einem Skalpell Nr. 11 und machen Sie einen 1 cm Einschnitt in das Periost (Abbildung 1B, C). Stanzen Sie ein Loch mit Durchmesser 2 mm in der Tibia mit einem elektrischen Knochen Bohreinheit (Abbildung 1D).
  7. Drücken Sie die 2 mm Durchmesser Löcher in die Tibia Plateau mit einem Zylinder von Knochen Wachs von 2 mm Durchmesser und 2 mm Höhe (Abbildung 1E). Das spare Knochens Wachs entlang der horizontalen Ebene der Tibia Plateau (Abbildung 1F) entfernen. Überprüfen Sie, dass die 2 mm Loch voller Knochen Wachs (Abbildung 1G).
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Löcher voller Knochen Wachs sind, indem Sie das Loch mit oder ohne Blut Überlauf.
  8. Nähen Sie das Periost und Haut mit resorbierbaren chirurgischen Naht in einer vertikalen Matratze Naht zu verhindern, dass das Tier kauen die Nähte (Abbildung 1H).
  9. 1 x 108 KBE/mL der S. Aureus -Lösungen (30 µL pro 100 g Körpergewicht) mit einer 1 mL Asepsis Injektor (Abbildung 1ich) zu injizieren. Stellen Sie sicher die Nadeln dringen die Knochen Wachs und der S. Aureus -Lösung langsam in Knochenmark injizieren.
  10. Halten Sie das Tier im warmen und sauberen Bedingungen um Wärmeverlust nach Modellierung zu vermeiden. Überwachen Sie Atemfrequenz und Herzfrequenz. Beherbergen Sie nach dem Aufwachen die Kaninchen in einzelnen Käfigen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser.

3. Bewertung der Knochen-Infektionsmodell

  1. Am Tage, 7, 14, 21 und 28 nach Infektion legen Sie Kaninchen in der Kaninchen-Fixierer mit dem Kopf und Ohr außerhalb der Fixierer.
  2. Ziehen Sie 2 mL Blut aus der Ohrmuschel Venen in einen Dipotassium Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA-K2) Antikoagulans Blut Behälter. Ein Blutgefäß entziehen Sie 1 mL Blut in ein Gefäß Blut. Zentrifugieren Sie das Serum für 10 Minuten mit einer Geschwindigkeit von 651 X g bei Raumtemperatur.
    1. Bestimmen Sie Anzahl weißer Blutkörperchen (WBC) im Vollblut mit einem Blut-biochemischen Analysator und C - reaktives Protein (CRP) durch ein Enzym-linked Immunosorbentprobe assay (ELISA) Methode16.
  3. Am Tage, 7, 14, 21 und 28 nach Infektion betäuben Sie ein Modell Kaninchen mit Pentobarbital-Natrium bei der Dosierung von 3 mg / 100 g Körpergewicht. Schneiden Sie Tibia-Haut mit einem Skalpell Nr. 11 und machen Sie einen 2 cm Schnitt in das Periost (Abb. 2A).
  4. Reinigen Sie Knochen Wachs. Debride nekrotische Knochen durch Lochen zwei angrenzenden 4,8 mm Durchmesser mit einer elektrischen Knochen Bohreinheit (Abbildung 2B). Debride nekrotisches Knochenmark und Granulationsgewebe mit einem Knochen Löffel (Abbildung 2C).
    Hinweis: Reinigen Sie Knochengewebe, während das Debridement, Knochengewebe, die restlichen im Knochenmark zu vermeiden.
  5. Kratzen Sie und reinigen Sie das Knochengewebe zwischen den beiden Bohrungen (Abb. 2D).
  6. 1 mL Knochenmark auf Schafe Blutagar Platten zu verbreiten. Platten über Nacht bei 37 ° c inkubieren Wählen Sie Platten von 30 bis 300 Kolonien, und berechnen Sie die Anzahl der Kolonien.
  7. Am Ende der 28. Tag nach der Infektion extrahieren Sie Tibia Exemplare an den Rändern der Knie und Sprunggelenk. Fix die Tibia Exemplare in 4 % Paraformaldehyd für 24 h Decalcify der Tibia-Proben in 10 % EDTA für 8 Wochen.
  8. Die Tibia Exemplare in einer abgestuften Reihe von Ethanol Verdünnungen zu entwässern, und dann in Paraffin Wachs einbetten. Schneiden Sie 4 aufeinander folgenden 5 µm Abschnitte aus den koronalen Ebenen. Führen Sie Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung Kit zu Flecken.
  9. Verwenden Sie ein Mikroskop, um die befleckte Abschnitte anzuzeigen und Datensatz übertragen Lichtbilder mit standard-Software.

4. Vorbereitung der VCS Perlen

  1. 9,5 g von medizinischem Calcium-Sulfat 1 g Vancomycin Hydrochlorid Pulver hinzu, und fügen Sie dann 3 mL normale Kochsalzlösung für die gemischte macht. Mischen Sie sie gründlich mit einem Spatel für 30 bis 45 s.
  2. Platzieren Sie das gemischte Produkt in eine flexible Silica-Gel-Form (Zylinder mit Durchmesser von 4,8 mm und 4,8 mm Höhe), und bei Zimmertemperatur trocknen Sie, für 15 min. die VCS-Perlen durch Biegen der Formwerkzeugs entfernen.

(5) Antibiotika-Behandlung und Implantation autogener Knochen

  1. Betäuben Sie Modell Kaninchen mit Pentobarbital-Natrium bei der Dosierung von 3 mg / 100 g Körpergewicht aufdem 28 Tag nach Infektion . Die proximalen Tibia-Region mit einen elektrischen Rasierer zu rasieren. Desinfizieren Sie die Haut durch die Anwendung von Povidon-Jod-Lösung.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Modellierung Verfahren weniger als 1 h.
  2. Rasieren Sie die Tail-Region mit einen elektrischen Rasierer zu und desinfizieren Sie das Heck durch die Anwendung von Povidon-Jod-Lösung.
  3. Reduzieren Sie die Rute mit einer chirurgischen Schere. Schneiden Sie Rute Haut mit einem Skalpell Nr. 11 und offenbaren Sie das Steißbein zu. Die Haut an der Rute Region mit resorbierbaren chirurgisches Nahtmaterial in einer vertikalen Matratze Naht zu verhindern, dass das Tier kauen die Fäden vernähen.
  4. Entfernen Sie alle Muskeln, Weichteile und Periost. Lösen Sie das Steißbein an jedem Gelenk zu und übertragen Sie das Knochenstück zu, um eine 100 mm Kunststoff Schale mit steriler Kochsalzlösung.
  5. Implantat-4er VCS Perlen (Zylinder Durchmesser 4,8 mm und 4,8 mm Höhe, 1,25 mg Vancomycin pro Stück Perle) in das Knochenmark Hohlraum gebogenen Pinzette (Abb. 2E).
  6. Füllen Sie den Knochendefekt mit 8 Stück autogener Knochen (Zylinder mit Durchmesser von 2 mm und 4 mm Höhe pro jedes Stück) mit gebogenen Pinzette (Abb. 2E).
  7. Nähen Sie das Periost und Haut mit resorbierbaren chirurgisches Nahtmaterial in gewissem Matratze Naht (Abbildung 2F).
    Hinweis: Halten Sie die Temperatur bei 25 ° C, während der Operation.
  8. Halten Sie das Tier in warmen und sauberen Bedingungen um Wärmeverlust nach der Operation zu vermeiden. Überwachen Sie Atemfrequenz und Herzfrequenz. Beherbergen Sie nach dem Aufwachen die Kaninchen in einzelnen Käfigen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser.

6. Beurteilung der antibiotischen Tätigkeit

  1. Kaninchen in ein Kaninchen Fixiermittel, und legen Sie den Kopf und Ohr außerhalb der Fixierer auf 2, 4, 6 und 8 Wochen nach der Behandlung.
  2. Auricularis Adern mit EDTA-K2 Antikoagulans Blutgefäß entziehen Sie Blut. Ein Blutgefäß entziehen Sie 1 mL Blut in ein Gefäß Blut. Zentrifugieren Sie das Serum für 10 Minuten mit einer Geschwindigkeit von 651 X g bei Raumtemperatur.
  3. Bestimmen Sie die Anzahl weißer Blutkörperchen (WBC) im Vollblut mithilfe Blut biochemischen Analysator und C - reaktives Protein (CRP) durch einen ELISA-Methode-16.

7. Bewertung der Knochenregeneration

  1. Einschläfern Kaninchen durch die Injektion mit einer über Dosierungen von Pentobarbital-Natrium, am Ende des 8 oder 12 Wochen nach der Behandlung.
  2. Extrahieren Sie Tibia Exemplare, an den Rändern der Knie und Sprunggelenk. Debride Muskeln und Faszien Schichten.
  3. Analysieren Sie die Struktur der Tibia mittels Mikro-Computertomographie (Mikro-CT). Wählen Sie einen ovalen Bereich 4,8 mm Durchmesser und 9,6 mm lange wie der Region of Interest (ROI). 3D Modelbilder mit Bitmap-Daten zu rekonstruieren.
  4. Wählen Sie Resultate von das Verhältnis Volumen/Gewebe Knochenvolumen (BV/TV), trabekuläre Dicke (Tb.Th), Trabekel Anzahl (Tb.N) und trabekuläre Trennung (Tb.Sp)from the3D Modelle zur Knochenregeneration zu beurteilen.

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Representative Results

Bewertung der Knochen-Infektionsmodell
Nach Infektion mit S. Aureusähnelten die pathologischen Erscheinungen von Kaninchen das repräsentative Symptom der chronischen Osteomyelitis in der Klinik. In unserer Studie wurden 30 Kaninchen infiziert, unterworfen als eine Modellgruppe und 10 Kaninchen als Kontrolltiere unterzogen wurden. Alle Modell-Kaninchen infiziert haben Nebenhöhlen der Tibia lokalen Site, mit weißen und gelben Eiter über Flow aus den Nebenhöhlen(Abbildung 3). Die Ergebnisse der H & E Färbung zeigen, dass bakterielle Aggregate um Toten Knochen in der Modellgruppe befinden und normalen Osteozyten können nicht identifiziert werden. Die Höhe der CRP und WBC sind höher in der Modellgruppe als die Kontrollgruppe (Abb. 3B). Nekrotische Knochenmark Lysates sind auf Agarplatten, gestreift, die eine erhöhte Anzahl von Kolonien für die Model-Gruppe nach der Infektion (Abb. 3C) führen. Am Ende der Modellierung gab es 3 Kaninchen tot wegen schweren Infektionen. Die übrigen infizierten Kaninchen als Infektion Knochenmodell wurden identifiziert und wurden in 3 Gruppen eingeteilt: Group, VCS Group und VCS-AB Gruppe zu modellieren.

Bewertungen der antibiotische Aktivität und Knochenregeneration
Bei 2, 4, 6 und 8 Wochen nach der Behandlung mit VCS oder VCS-AB, die Höhe der CRP und WBC deutlich reduziert werden (Abb. 4A). Nach 12 Wochen der Implantation von VCS und Knochen Allograft schien tibiale Mängel der VCS-AB Gruppe voll zusammenwachsenden. Tibia Plateau Oberflächen der VCS-AB-Gruppe sind flacher als die VCS-Gruppe. 2D Wiederaufbau Bilder zeigen eine progressive Zunahme der Knochenvolumen während der 12 Wochen nach der Behandlung mit VCS-AB und VCS, während Knochenverlust in der Modellgruppe (Abbildung 4B) bedeutsam ist. Um die Knochen Regeneration quantitative Indizes zu analysieren, wurde eine ovale Fläche 4,8 mm Durchmesser und 9,6 mm lang als der Region of Interest (ROI) (Abb. 4C) gewählt, und 3D-Modell Bilder wurden rekonstruiert mit Bitmap-Daten. Die Mikro-CT-Indizes BV/TV in der Modellgruppe lagen deutlich unter, dass Gruppen in der VCS und VCS-AB. Die Tb.N und Tb.Th Noten in der VCS-AB-Gruppe waren deutlich höher als die im Modell und VCS-Gruppe. Darüber hinaus sind die Tb.Sp Punkte in der VCS-AB-Gruppe deutlich niedriger als die in der Modellgruppe und VCS-Gruppe (Abbildung 4D).

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Infektionen mit S. Aureus Ursachen zunehmender WBC und CRP in der Modellgruppe, die mit dem VCS gesenkt werden kann. Die Implantation von VCS gilt als die optimale Behandlung mit Antibiotika. Allerdings ist der Knochendefekt zu beobachten in der VCS-Gruppe. Der VCS und autogener Knochen Behandlung die Trabekel Dicke und Trabekel Anzahl erhöhen und verringern die trabekuläre Trennung. Die VCS-AB-Behandlung zeigte Fähigkeit Knochenheilung zu fördern.

Figure 1
Abbildung 1 . Chirurgische Vorbereitung der Infektion Knochenmodell. (A) zeigt die Stanzen positionieren auf der Tibia. Der Abstand zwischen der Bohrposition Loch für Injektion mit S. Aureus am oberen Ende des Schienbeins 1,5 cm. (B) gemacht Schnitt in der Haut, das Periost verfügbar zu machen. (C) zeigt Schnitt durch das Periost die Tibia aussetzen. (D)-Punch ein Loch mit 2 mm Durchmesser in der Tibia. (E) füllen die 2 mm Durchmesser-Loch voller Knochen Wachs. (F) abgeschnitten spare Knochens Wachs. (G) zeigen die Knochen Wachs füllen den Knochendefekt. (H) Sew Periost und Haut. (ich) Spritzen mit S. Aureus -Lösung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 . Vorbereitung der Knochen Allograft und Antibiotikum Behandlung. (A) Schnitt in der Haut, Periost verfügbar zu machen. (B) zwei angrenzenden 4,8 mm Durchmesser Löcher stanzen. (C) Debride nekrotische Knochen und entzündlichen Knochenmark. (D) kratzen und reinigen das Knochengewebe zwischen den beiden Löchern zu einem langen Kreis von 4,8 mm Durchmesser und 9,6 mm lang. (E) füllen das Loch mit VCS und Allograft Knochen. (F) Sew Periost und Haut. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 . Bewertung der Infektion Knochenmodell. (A) ästhetischen Eigenschaften der Kaninchen Beine mit S. Aureusund typische Histopathologie Bilder des Schienbeins Kaninchen in das Modell und Kontrollgruppen infiziert. Blauer Pfeil: Osteocyte; Rosa Pfeil: Knochen Trabekel; gelber Pfeil: bakterielle Aggregate; grüner Pfeil: Toten Knochen. (B) der WBC und CRP führt das Kaninchen-Serum zu den Zeitpunkten der vor der Modellierung, 7, 14, 21 und 28 Tage nach der Infektion. Die Spalten entsprechen den mittleren ±SE *p < 0,05 vs. der Kontrollgruppe. (C) zählte die Anzahl der Bakterienkolonien in der Tibia Knochenmark nach Inkubation über Nacht. Die Spalten entsprechen den mittleren ±SE *p < 0,05 vs. die Kolonie am Tag 0 zählen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 . Bewertungen der antibiotische Aktivität und Knochen Regeneration. (A) die Ergebnisse der WBC und CRP im Serum von Kaninchen zu den Zeitpunkten 2, 4, 6 und 8 Wochen nach der Implantation des VCS und VCS-AB, die Punkte repräsentieren die mittlere ±SE, #p < 0,05 und *p < 0,05 im Vergleich mit der Modellgruppe. (B) der koronalen Abschnitt Bilder von Tibia analysiert von Mikro-CT (C) die Lage des ROI. (D) die Histogramme zeigen die Knochen Volumen/Gewebevolumens (BV/TV), trabekuläre Dicke (Tb.Th), Trabekel Anzahl (Tb.N) und trabekuläre Trennung (Tb.Sp) Resultate von ROI aus fünf Kaninchen pro Gruppe. Die Spalten entsprechen den mittleren ±SE *p < 0,05 vs. der Kontrollgruppe oder die Model-Gruppe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 . Die Chronik aller Verfahren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

In den bisherigen Studien wurden verschiedene Arten von Tiermodellen konstruiert, um sowohl akute und chronische Knochenentzündung zu studieren; die Suche nach dem idealen Modell weiterhin17,18. Darüber hinaus dürfte das ideale Knochenmodell Infektion zu simulieren die pathologischen Merkmale der Knochenentzündung im klinischen Umfeld, während die Modellierungen Perioden, bleiben, kostengünstig und einfach durchzuführen. So weit, Kaninchen Knochen Infektionsmodell ist die am häufigsten in entzündlichen Knochen-Krankheit-Forschung, wie die Kaninchen verfügbar, möglich und kostengünstig sind. In unserem vorangegangenen Studie verglichen wir die Sterberate und die Infektionsrate von Kaninchen mit unterschiedlichem Körpergewicht. Die Ergebnisse zeigten, dass das Körpergewicht mehr als 3 kg sein sollte; Andernfalls gäbe es eine hohe Todesrate oder eine hohe Inzidenz von Haematosepsis und eine höhere Sterblichkeitsrate nach der Operation.

Im Gegensatz zu früheren Studien entsprechen die Kaninchen Knochen Infektionsmodelle und antibiotische Behandlung in unserer Studie die pathologischen Merkmale der menschlichen Krankheit und die chirurgische Therapie. In der vorangegangenen Studie haben Tiere injiziert mit Natrium Morrhuate und S. Aureus nicht pathologischen Status mehr als 60 Tagen. Darüber hinaus war die Todesrate mehr als 20 %12,19. Der Überlauf S. Aureus -Lösung von Knochendefekten hatte eine niedrige Infektionsrate induzieren erwiesen. Wir Knochen Wachs verwendet, um die 2 mm Loch an der Tibia zu füllen, um der S. Aureus -Lösung im Knochenmark zu blockieren und dafür gesorgt, dass die Löcher voller Knochen Wachs waren durch das Loch mit oder ohne Blut Überlauf überprüft. Die Dicke der Tibia ein Kaninchen 2 mm war, wir gedrückt einen Zylinder mit Durchmesser von 2 mm und 2 mm Höhe Knochen Wachs in die 2 mm Durchmesser Löcher, die die Knochen Wachs dafür gesorgt das Loch gefüllt und konnte nicht in das Knochenmark infiltrieren. Darüber, wie die Knochen Wachs flexibel und stabil war, die Löcher gefüllt und könnte nicht schmelzen oder reagieren mit Knochenmark. In unserer Studie am 28. Tag nach der Infektion der Knochen Wachs war noch komplett und die Löcher voll ausgefüllt. Da die Gewichte der Kaninchen mehr als 3 kg und weniger als 3,2 kg waren, war die Menge an Bakterien Fahrwerk 900 µL bis 960 µL. Wegen der langsamen Geschwindigkeit der Injektion und Blockierfunktion Knochen Wachs könnte diese Menge an Bakterien Aussetzung in Knochenmark ohne hohen Druck injiziert werden. Die Ergebnisse zeigten, dass dieses Protokoll sorgt für die Menge von S. Aureus infiziert im Knochenmark. Ein Loch mit Durchmesser 2 mm wurde in der Tibia zu gewährleisten gestanzt, die den Abstand zum oberen Ende des Schienbeins 1,5 cm, die lokalisiert das Loch an der Tibia Plateau, genügend Platz, um debride und Implantat VCS Perlen und autogener Knochen bei der folgenden Behandlung zu gewährleisten. Während der Modellierung 3 Kaninchen wegen schweren Infektion gestorben. Die blieben Kaninchen als Knochen Infektion Kaninchen identifiziert, und die Infektionsrate bei den restlichen Kaninchen war 100 %. Im Vergleich zu anderen Knochen Infektion Protokolle, wie die Implantation von Schwämmen, getränkt mit S. Aureus oder die Implantation von Fremdstoffen, unsere Protokolle genau simulieren Knochenentzündung im klinischen Umfeld und haben wenig Einfluss auf Verfahren, so als Debridement nekrotischen Knochens und antibiotische Behandlung.

Diagnose von Knochenentzündung ist eine Herausforderung für den Chirurgen. Die Laborbefunde, einschließlich Serum Entzündung Marker Erkennung, Mikrobiologie und Histopathologie Analyse wurden zur Knochenentzündung im klinischen Umfeld20zu bewerten. Auch bildgebende Diagnostik, wie Ultraschall, Radiologie, Computertomographie, Magnet-Resonanz-Tomographie oder Raman-Spektroskopie wurden eingesetzt, um Knochen Infektion21zu erkennen. Leider ist bei der Diagnose von Osteomyelitis durch bildgebende Verfahren oft verzögert, weil Knochen Nekrose schwierig, von einfachen Röntgen bis 3. Woche der Infektion zu erkennen ist. In unserer Studie haben wir Serum Entzündung Erkennung und Histopathologie Markeranalyse um Knochen Infektionsmodelle, zu bewerten, da diese Methoden effektiv, bedienbar und die Indizes empfindlich waren. Im folgenden wurden die wichtigsten Schritte des chirurgischen Eingriffs ein Knochen-Infektionsmodell in unserer Studie zu erstellen. Wählen Sie die Kaninchen mit entsprechenden Körpergewicht zur Durchführung der Operation und Behandlung. Pflegen einer sterilen Umgebung während der Bewusstseinsbildung und chirurgische Verfahrens und warme Bedingungen nach dem chirurgischen Eingriff-Protokoll zu gewährleisten. Schlag ein Durchmesser von 2 mm Loch in der Tibia, und sicherzustellen, dass der Abstand zum oberen Ende des Schienbeins 1,5 cm. füllen das Loch mit Knochen Wachs und vernähen die Knochenhaut und die Haut um die Bakterien-Lösung zu blockieren. Nachfolgend die wichtigsten Schritte der antibiotischen Behandlung. Die pathologische Knochenentzündung der Kaninchen durch das Erkennen von WBC in Vollblut und CRP im Serum zu gewährleisten. Debride nekrotische Knochen vollständig, zwei benachbarte 4,8 mm Durchmesser Löcher stanzen und kratzen und reinigen das Knochengewebe zwischen den 2 Löchern. Implantat-4er VCS Perlen und 8 Stück autogener Knochen in Knochenmark und Knochendefekt.

Nach Behandlung mit Antibiotika beobachteten wir, dass die Kaninchen in der VCS-AB-Gruppe ein höhere osteogene Potenzial als das in der VCS-Gruppe hatte. Möglicherweise die autogene Knochen enthält aktivierte Osteozyten und Bildung Knochenwachstumsfaktoren, die Knochenmatrix in der Graft-Oberfläche zu produzieren, während Abbau von VCS knapp induziert Knochen Matrix im Großraum defekt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der autogene Knochen die überlegene osteogene Fähigkeit hat. Obwohl autogener Knochen Ernte im Volumen begrenzt ist und Morbidität an der Entnahmestelle beinhaltet, ist die Bedeutung des autogenen Knochen nicht vernachlässigbar22,23,24. In unserer Studie erwarb die autogene Knochen vom Steißbein, die systemische Verletzungen vermeidet und Sterberate im Vergleich zu gewinnen autogener Knochen vom Beckenkamm Knochen abnimmt. Autologen Knochen vom Steißbein ist möglicherweise das bevorzugte Material der Pfropfen in der Tier-Studie der Knochenentzündung.

Abschließend wurde in dieser Studie eine verbesserte Kaninchen-Modell der Knochenentzündung gegründet. Entzündung-Indizes und Blut biochemische Indizes wurden verwendet, um das Knochen-Infektion-Modell zu schätzen. Darüber hinaus wurden nach Behandlung mit Antibiotika, mehrstufige Analysen durchgeführt, um antibiotische Aktivität und Knochen Regenerationsfähigkeit zu erkennen. Die Modellierung, Behandlungsprotokolle und Bewertungsmethoden sind machbar und verlässlich. Weitere Studien werden darauf konzentrieren, unter Ausnutzung der Multi-Modalität visuelle Geräte, den pathologischen Prozess der Knochenentzündung und der Knochen-Reparatur-Prozess zu überwachen.

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Disclosures

Die Autoren berichten keine Interessenkonflikte in dieser Arbeit.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81803808, 81873062), Zhejiang Provincial Medical und Health Science und Technology Fund (2017KY271) und der Wissenschaft und Technologie-Projekt der Provinz Zhejiang (2017 37181) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
absorbable surgical suture Jinghuan 18S0604A
asepsis injector Jinglong 20170501
bone wax ETHICON JH5CQLM
CCD camera Olympus DP72
EDTA-K2 anticoagulant blood vessel XINGE 20170802
Electric bone drill unit Bao Kang BKZ-1
Electric shaver Codos 3800
flexible silica gel mold  WRIGHT 1527745
Hematoxylin and Eosin Staining Kit Beyotime 20170523
Luria-Bertani culture medium Baisi Biothchnology 20170306
Medical-grade calcium sulphate WRIGHT 1527745
microcomputed tomography (micro-CT) Bruker SkyScan 1172 
Microscope Olympus CX41
New Zealand white rabbits Zhejiang Experimental Animal Center  SCXK 2014-0047
No. 11 scalpel  Yuanlikang 20170604
normal saline Mingsheng 20170903
PBS TBD(Jingyi) 20170703-0592
pentobarbital sodium Merk 2070124
povidone-iodinesolution Lierkang 20170114
S. aureus freeze drying powder China General Microbiological Culture Collection Center ATCC 6538
sheep blood agar HuanKai Microbial 3103210
tryptic soy agar plates HuanKai Microbial 3105697
tryptic soy broth tubes HuanKai Microbial 3104260
Vancomycin Lilly C599180

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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